材料与试剂

试剂

1.对苯二甲酸（BDC，98%）（Millipore Sigma，目录号：185361-100G）
2.4,4'-联苯二甲酸（BPDC）（CHEM-IMPEX INT'L Inc.，目录号：26841）
3.用于蛋白质测定的二辛可宁酸（BCA）试剂盒（Millipore Sigma，目录号：BCA1）
4.MES（Millipore Sigma，目录号：475893-100GM）
5.乙酸钠（Millipore Sigma，目录号：S8750）
6.HEPES（Millipore Sigma，目录号：PHG0001-100G）
7.甘氨酸（Millipore Sigma，目录号：410225）
8.乙醇 (EtOH)（标准资源 - 可以从任何商业资源获得）
9.乙酸（标准资源）
10.氢氧化钠 (NaOH)（标准资源）
11.浓盐酸 (HCl)（标准资源）
12.双蒸水（标准资源）
13.细试管（ Wiretrol ® II，目录号：5-000-2020）

解决方案

1.MES 缓冲液 0.5 M，pH 6 (10 mL)（参见配方）
2.醋酸盐缓冲液 0.05 M，pH 4.6 (40 mL)（参见配方）
3.HEPES 缓冲液 0.2 M，pH 6.8 (40 mL)（参见配方）
4.甘氨酸缓冲液 0.05 M，pH 9 (40 mL)（参见配方）

食谱

1.MES 缓冲液 0.5 M，pH 6 (10 mL)
8 mL 双去离子水 (ddH 2 O)
0.976 克 MES
使用 HCl 将 pH 调至 6
稀释至 10 mL

2.醋酸盐缓冲液 0.05 M，pH 4.6 (40 mL)
30 mL ddH 2 O
82.272毫克乙酸钠
0.057 mL 冰醋酸
使用 HCl 将 pH 调节至 4.6
稀释至 40 mL

3.HEPES 缓冲液 0.2 M，pH 6.8 (40 mL)
30 mL ddH 2 O
1.91 克 HEPES
使用 HCl 将 pH 调节至 6.8
稀释至 40 mL

4.甘氨酸缓冲液 0.05 M，pH 9 (40 mL)
30 mL ddH 2 O
150 毫克甘氨酸
10毫克氢氧化钠
用 NaOH 将 pH 调至 9
稀释至 40 mL

设备

1.离心机（ Thermo Fisher，型号： Sorvall Legend Micro 21R）
2.热重分析仪（TA Instruments Water，型号：TGA-Q500）
3.XRD – 布鲁克单晶衍射仪，带 Cu IμS X 射线源的 Apex 2 Duo（布鲁克公司，型号：Apex 2 Duo）
4.场发射扫描电子显微镜（STEM，型号：JEOL JSM-7600F）
5.Millipore浓缩器（Merck KGaA ，目录号： UFC500396)
6.研钵和杵设置（Millipore Sigma，目录号：Z136077）
7.光谱仪（ Thermo Scientific，型号： NanoDrop 2000）

程序

为了最大限度地减少矿物质对 MOF 制备的影响，此过程中的所有水均为双去离子水 (ddH 2 O)，并且所有溶液均使用 ddH 2 O制备。所有缓冲液中的 pH 值均用 1 M HCl 或 NaOH 调节。酶的活性往往需要特定的pH值；然而，某些 MOF 在某些 pH 值下不稳定。在这种情况下，配方部分提供了相同 pH 范围的替代缓冲液。所有酶和酶@MOF复合材料应在4℃下储存，并在活性测试前在冰上运输。 Enzyme@MOF复合材料不需要新鲜制备，除非在冰箱中放置一个多月。所有涉及的设备操作和数据分析均应遵循相应的用户手册/指南，此处仅进行简要介绍。该协议的总体概述如图 1 所示。

图1。本协议涉及的程序概述

A.金属离子/配体选择和水相 MOF 制备

有必要制备不含酶的 MOF，因为它们可以作为表征的背景或控制信号。选择金属离子和配体的最佳库是已发表的通过溶剂热或水热方法制备的 MOF [6-8]，请记住，同一对金属离子和配体在环境条件下可能不会在水相中形成相同的晶体结构，或者可能不会形成水中完全没有晶体。金属离子和配体的常见组合的一些总结性列表可以在文献中找到[8,14,31]。在选择和扫描金属离子-配体组合时，应考虑过量金属离子和配体存在下酶的稳定性和功能性、配体的溶解度以及潜在毒性[32-35]。扫描许多金属离子和配体是很常见的，但只能找到几种可以形成晶体的组合[19]。通常，根据我们的经验，金属离子的+2氧化态是优选的，尽管在某些情况下+3和+4也是可能的。一旦通过直接可视化判断找到了组合，请继续执行以下操作。

1.优化 MOF 成型条件。此步骤是必要的，因为最佳金属：配体比例通常偏离 MOF 中的含量比。我们发现，即使在相同的金属和配体浓度下，以这种方式形成的共晶的质量也取决于反应体积。在极少数情况下，金属离子库存的阴离子会影响共晶的形成和稳定性[36]。我们发现以下步骤对于新的金属/配体组合有用：
a.提高配体在水中的溶解度。有机连接体/配体在水中的溶解度较低。为了能够达到共结晶所需的浓度，典型的操作是将配体与 NaOH 反应以制备盐基配体，如我们最近的工作中详述的。简而言之，50 mM NaOH 与 25 mM 配体在水中在室温下剧烈搅拌下反应 1-2 小时就足够了，尽管浓度和反应时间可能因配体而异。以对苯二甲酸（BDC）和4,4'-联苯二甲酸（BPDC）作为配体示例，以下步骤被证明是有效的。
为了制备更易溶解的对苯二甲酸二钠 (BDC-Na 2 )，将对苯二甲酸 (4.16 g，25 mM) 和 NaOH (2.0 g，50 mM)在室温下在 20 mL ddH 2 O中搅拌混合直至透明 (~ 1小时）。然后，通过混合将混合物在400mL冷异丙醇中沉淀。通过用异丙醇离心洗涤沉淀直至滤液达到pH 7并在烘箱中在75°C下干燥过夜。
2 O中添加 6 g (22.2 mM) BPDC 和 2.65 g NaOH 来合成 BPDC二钠(BPDC-Na 2 ) 。将混合物在 95 °C 下搅拌 3 小时直至透明，然后沉淀以与上述BDC-Na 2合成类似的方式进行、洗涤和干燥。
b.金属离子选择。优选含有所需金属离子的低电荷典型盐，因为高负电荷可能干扰MOF [即Zn( NO 3 ) 2 、Ca(NO 3 ) 2 、Al(NO 3 ) 2 ]的形成。
注意：在水共结晶中，金属离子原液的阴离子可能会影响共晶的形成。一个典型的例子是ZIF： Zn( AoC ) 2形成更稳定、更小的ZIF，而Zn(NO 3 ) 2形成更大的ZIF。在选择商业金属离子资源时，应仔细选择阴离子。
c.形成MOF。我们通常从 1 mL 含有 25 mM 金属离子和 50 mM 配体的水开始，在室温下进行温和章动。 MOF 的形成时间从几分钟到几小时不等，具体取决于金属和配体的选择。
注意：我们发现先添加金属，然后再添加配体更有效。
d.洗掉未反应的物质。我们建议对复合材料进行离心（13,000× g ，5 分钟）并尽可能去除上清液中的水。然后，应使用 1 mL EtOH 或 MeOH 洗涤额外的反应残留物，因为水可能会压碎形成的晶体，考虑到形成条件，晶体可能很弱。通常，洗涤三次就足够了。获得的共晶应在4℃保存以供进一步使用。
注意：我们建议避免大量用水清洗，因为这可能会破坏晶格。此外，有机溶剂更容易干燥以进行晶体表征。
2.MOF 表征。所有表征技术均已建立并具有标准操作程序。在这里，我们仅强调处理水相中形成的 MOF 时的差异/注意事项。
a.粉末 X 射线衍射 (PXRD)。通过干燥除去 EtOH 后，应将粉末加载到细试管的底部来制备 PXRD 样品（图 2）。样品高度应为 ~1.6 mm，密封件为 ~2.5 mm。如果形成单晶（水相中也可能发生），则应将晶体直接装入 X 射线衍射仪中进行数据采集。对于粉末样品，为了获得高质量的衍射图，精细研磨颗粒非常重要。通常，我们使用常规的研钵和研杵装置。获取数据后，我们通常会将 2θ 4–70° 的模式与文献中报道的相同金属/配体的模式进行比较。如果找不到匹配项，则我们有可能正在形成多相共晶或全新的晶体，这两种晶体都可以通过粉末 X 射线衍射仪和适当的分析来解析。

图 2. 通过将粉末加载到薄试管的底部来制备用于粉末 X 射线衍射 (PXRD) 数据采集的粉末样品

b.扫描电子显微镜（SEM）。需要使用 SEM 来确认所形成的共晶的形态和尺寸。此处适用于 SEM 数据采集的常规操作，无需特别注意（需要约 2 毫克干燥样品）。
c.热重分析（TGA）。 TGA 需要特别小心，因为样品支架可能很敏感，因此在采集由 Al、Zn、Ni、Fe 等材料制成的 MOF 的数据采集过程中会被损坏。我们的典型建议是为这些 MOF 选择陶瓷支架，为其余的 MOF 选择常规支架（以节省成本）。大多数情况下，需要 10 毫克样品。
注意：完全干燥所有样品非常重要。
d.N 2等温线。这对于确认底物扩散和酶活性所需的孔隙率是必要的。 N 2 等温线测量需要大量样品和高结晶度。塌陷的 N 2 等温线图通常表明结晶度和孔隙率较差[19]。文献中报道的典型数据分析适用于此。我们发现需要 10 毫克样品，典型孔隙率为 0.05–0.5 cm 3 /g，这是可接受的 MOF 的正常范围。
注意：避免用水清洗可以减少清洗过程中潜在的晶体损坏。 MeOH 或 EtOH 是不错的选择。
e.pH值稳定性。由于缓冲液中金属离子和阴离子之间潜在的相互作用，某些缓冲液可以分解某些 MOF。 PBS缓冲液是一个典型的例子，其中带高负电荷的磷酸基团可以与阳离子配合并分解MOF支架。我们发现柠檬酸盐缓冲液也能够分解 MOF。对于低 pH 范围，我们通常使用醋酸盐和 MES 缓冲液；对于接近中性的 pH 值，我们发现 HEPES 缓冲液效果最好；在高 pH 范围内，甘氨酸缓冲液是最佳选择。这些缓冲液（通常浓度为 50 mM）也不会显着影响大多数酶的活性，因此应在形成的 MOF 上进行测试，以指导下一步的 pH 稳定性。浸泡在缓冲液中后，我们使用光谱仪在 450 nm 处监测一段时间内的浊度。如果在一定时间内（例如一天）浊度没有变化，则将对颗粒进行 PXRD 和 SEM 研究，以确认共晶的存在。
f.热稳定性。对于热稳定性测试，我们通常将共晶放入烘箱中并将温度设置为目标温度。对于大多数生物应用，37–45 ℃ 是典型的温度范围。大约每小时测量一次浊度以确认晶体的存在。 1-2天后，如果晶体仍然存在，则应使用PXRD和SEM进行确认，因为破碎的晶体也会出现浑浊。对于长期保存在4℃的晶体也应进行同样的测试，以记录形成的晶体的长期稳定性。

B.酶@MOF复合制剂

酶可以作为核参与金属离子与配体的共晶，影响共晶形成的动力学甚至结构。因此，酶@MOF复合材料的所有数据都应与单独 MOF 的数据进行比较。由于酶的性质差异很大，以下程序仅基于我们对几种酶的经验。特定酶的生物矿化应具体情况具体对待。

1.准备酶和对照实验。此步骤对于保留酶功能并验证后续步骤中测量的酶活性是必要的。
a.酶制剂。如果订购粉末形式的酶，则应根据制造商的说明（如果有）使用适当的缓冲液或 ddH 2 O 来溶解酶。如果没有给出说明，我们通常从 HEPES 缓冲区开始。典型的酶原液浓度应遵循文献中建议的浓度，因为高酶浓度会导致酶沉淀。我们建议在 4 ℃ 下储存低于 1 mM 的酶。如果可能，最好将酶储存在 MOF 喜欢的缓冲液中（见上文）。如果酶以低浓度的溶液形式订购或表达/纯化，则需要通过透析或离心浓缩器进行缓冲液交换，以最大限度地提高 MOF 封装的有效性。
注意：通过优化缓冲液更换过程中的浓度和缓冲液选择，最大限度地减少酶损失。
b.酶活性的阳性控制。应进行典型的活性测定以确认酶具有活性。通常，结果会与来自具有已知活动的可靠资源的活动数据进行比较。通常，为了确认酶具有活性，需要将活性作为酶浓度的函数进行依赖性。
c.活动的负面控制。有必要使用典型的活性测定来确认金属离子、配体和 MOF 本身不显示活性。如果金属/配体组合影响目标酶的活性，则应使用替代的 MOF 来生物矿化该特定酶。洗涤后与 MOF 物理混合的酶（在冰上，在 50% 占空比、中等功率下超声处理）也应进行活性测试，以确认酶没有物理吸附。这很重要，因为物理吸附会导致酶浸出，并且在多轮活性测试后可重复使用性差。只需要在 MOF 中植入酶即可。
注意：虽然金属离子和配体通常不会影响酶活性测量，但根据活性试剂盒和机制，某些金属离子和配体可能会影响相关设备的读数。因此，阴性对照是必要的并且必须仔细设计。
2.制备酶@MOF复合材料。
a.典型配方：通常，将 1 mL ddH 2 O、25 μL 0.5 M 金属盐溶液、1 mM 酶和 0.5–0.25 M 配体（混合后总体积通常约为 1.1 mL）混合，具体取决于配体，可以形成所需的复合材料。这些浓度主要适用于我们最近工作中报告的 MOF。如果需要金属和配体的新组合，则需要优化金属离子和配体的浓度。
注意：避免高浓度的酶可以减少酶的损失。
b.章动下室温反应过夜。
c.如上所述（步骤 A.1.d）在 4℃下用 EtOH 洗涤。保持酶活性需要低温。
d.制备的酶@MOF复合材料可在4 ℃保存。
3.酶@MOF表征。所有表征技术均已建立并具有标准操作程序。在这里，我们仅强调处理酶@MOF复合材料时的差异/注意事项。
a.粉末X射线衍射。通过干燥去除 EtOH 后，应如上所述应用类似的加载程序和分析（步骤 A.2.a）。 PXRD 数据示例如图 3A 所示。

图 3. 当脂肪酶固定在模型金属有机框架中时，粉末 X 射线衍射 (PXRD) (A)、扫描电子显微镜 (SEM) ( B)、热重分析 (TGA) (C) 和脂肪酶活性 (D) 数据示例（MOF），Zn-BDC [19]。在不存在和存在酶的情况下，接近的 PXRD 图案表明酶不会对晶体结构造成显着改变 (A)。 SEM 图像显示了酶@Zn-BDC的一般形状生物复合材料（A）。 TGA 数据表明负载能力（~1%；C）。活性测定表明脂肪酶在 Zn-BDC (D) 中具有活性。

b.扫描电镜。需要使用 SEM 来确认所形成的共晶的形态和尺寸。此处适用于 SEM 数据采集的常规操作，无需特别注意（需要 2 mg 复合样品）。 SEM 数据示例如图 3B 所示。
c.热重分析。 TGA 需要特殊的预防措施，因为样品支架可能很敏感，因此在采集由 Al、Zn、Ni、Fe 等材料制成的 MOF 的数据采集过程中会被损坏。我们的典型建议是为这些 MOF 选择陶瓷支架，为其余的 MOF 选择常规支架（以节省成本）。大多数情况下，需要 10 毫克样品。酶@MOF复合材料的 TGA应该与单独的 MOF 进行比较，这应该突出由于酶封装而导致的重量损失。 TGA 数据示例如图 3C 所示。
d.N 2等温线。文献中报道的典型数据分析适用于此。我们发现需要 10 毫克样品。酶@MOF复合材料的N 2 等温线应与单独的MOF的N 2 等温线进行比较，这应突出由于酶封装而导致的孔隙率损失。典型的孔隙率损失范围为0.05–0.3 cm 3 /g。大多数N 2等温线仪器直接提供孔隙率的数字。
e.pH值和热稳定性。对于酶@MOF复合材料也应该执行类似的程序来测试 pH 值和热稳定性。
f.MOF 上的酶活性。 Enzyme@MOF复合材料应进行上述活性测定，以确认封装酶的功能。此外，如果需要比较不同 MOF 之间的酶性能，则应使用相同的负载容量（或至少标准化）进行比较。这通常是通过 BCA 测定完成的。具体而言，在特定氨基酸（胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等）的帮助下， Cu 2+的形成和还原为Cu +与存在的蛋白质的量成正比。市售的BCA工作试剂呈浅绿色，在蛋白质存在下变成紫蓝色。将大约 0.1 mL 蛋白质样品与 2 mL 工作 BCA 试剂混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。标准溶液和样品的吸光度在 562 nm 处测量。在相同酶量下，可以进行公平比较，以确定哪种MOF最能保留酶活性。图 3D 显示了脂肪酶固定在 Zn-BDC 中时的示例活性数据。
g.如果金属离子和配体的多种组合都能够固定酶并保留可接受的活性，通常大的结晶 MOF 在生物催化应用中是有利的，尽管较小的颗粒可以提高对大尺寸底物的催化效率。

数据分析

典型的数据分析程序是将表征数据与已发布的数据进行比较。例如，有和没有酶固定的 MOF 的 PXRD 图案应与没有酶的相同 MOF 的文献进行比较（例如，见图 4）。
在文献中可以找到某个 MOF 的多个 PXRD。获得的 MOF 可能是几种 PXRD 图案的组合，表明存在多个晶相，如图 5 所示，其中在水相中合成的 Al-BDC MOF 最有可能是具有至少两个晶相的多相 MOF。可能的结构。当合成在环境条件下在水中进行时，多相 MOF 的情况并不少见。
还应比较酶在溶液中和固定在 MOF 中的活性测定。根据所研究的酶，可以进行不同的数据分析和解释。例如，对于溶菌酶，我们通常会比较 OD 450的下降，并将斜率与溶菌酶活性测定中游离酶的斜率进行比较。对于脂肪酶，我们比较光密度增加的斜率来评估脂肪酶的催化效率。我们最近的工作[19]中显示了比较的详细信息。

图 4. 根据已发表的结构与实验数据重叠，模拟 Ni-BDC (A) 和 Ni-BPDC (B) 的粉末 X 射线衍射 (PXRD) 图案 [37,38]。模拟是使用剑桥晶体学数据中心开发的免费软件 Mercury 完成的，大多数公共学术用户都可以使用该软件。根据模拟，我们能够提出生物矿化产品可能的晶体结构。

图 5.基于与实验数据（紫色）重叠的两个已发表的结构（插图）对 Al-BDC（黑色）的粉末 X 射线衍射 (PXRD) 图案进行模拟 [39]。模拟是使用剑桥晶体学数据中心开发的免费软件 Mercury 完成的，大多数公共学术用户都可以使用该软件。我们的 PXRD 图案与模拟光谱均不匹配，这表明我们的产品中可能存在多个相共存。

协议验证

整个过程在我们最近的工作和补充信息中得到了验证[19]。

一般注意事项和故障排除

所有程序均假设正常条件。一旦酶被固定在各种 MOF 上，就值得一提的是，为了更好地利用所形成的复合材料。
1.活动差异的原因。对于生物材料/生物催化剂的开发目的，通常需要酶性能的分子水平细节，以便了解功能并指导未来 MOF 平台的合理设计。根据酶和金属/配体的选择，即使在相同的负载量下，多种原因也可能导致不同 MOF 上的酶活性存在差异。例如，不同的 MOF 可能呈现不同的亲水性，从而导致不同的酶内在动力学（大多数酶是亲水性的，并且在疏水性支架中可能活性较低）。较小的配体可能呈现较小的间隙/孔，因此对酶的严格限制，这也会降低活性。对于大底物酶，暴露于溶液中的活性位点的量与活性直接相关。 MOF 中生物矿化时酶的这些结构/动态细节可以使用我们最近开发的技术进行探测 [40,41]。
2.分解 MOF 以释放酶。这是确认 MOF 封装后的负载能力和酶功能的常见做法。大多数 MOF 在酸性或碱性 pH 值以及特定缓冲液（例如 PBS 缓冲液）下不稳定。因此，可以分解 MOF 以释放酶，并使用圆二色性和活性测定双重检查完整性。这也是确认承载能力的有效方法。
3.酶@MOF复合材料的其他合成条件。我们发现，如果稍高的温度（< 60 ℃）可以帮助共晶的形成而不损坏某些酶，那么它实际上是有用的。也可以使用一些调制剂来调节晶体形成的速率。
4.根据目标酶选择金属/配体的注意事项。金属酶以这种方式生物矿化时应格外小心，因为内源金属结合位点可能被 MOF 形成所需的金属离子占据。我们的典型建议是使用电荷与内源金属不同的 MOF。例如，为了固定人铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）[42,43]，应使用Al 3+作为MOF的金属中心。
5.水相中形成的 MOF 结晶度不完美且孔隙率低。高结晶度无疑会增强稳定性和基材扩散率。然而，如果酶与某些金属离子和配体共结晶时形成无定形或多相晶体，这可以通过 PXRD 轻松快速地确认，我们仍然建议测试酶在这些 MOF 上的可重复使用性。不完美的晶体很可能仍然能够固定酶并保留酶活性，因此可用于生物催化应用。当只能使用特定的金属离子来固定金属酶并且不完美的晶体是唯一的选择时，它特别有用。
6.稳定性和可重用性。酶@MOF复合材料在反应条件下与底物相互作用后通常是稳定的。我们在关键参考文献 [19] 中的可重用性测试已经证实了这一点。

致谢

这项工作得到了国家科学基金会（NSF：MCB 1942596 和 DMR 2306137）的支持。我们感谢 Peter G. Fajer 博士向我们机构（北达科他州立大学）慷慨捐赠 Bruker ECS-106，感谢 Wayne Hubbell 博士慷慨提供 EPR 数据分析软件。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

这项工作没有涉及人类受试者。

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