材料与试剂

1.12 孔板（Falcon，目录号：353043）
2.吖啶橙/碘化丙啶染色剂（ Biocat ，目录号：F23001）
3.琼脂Kobe I（Roth，目录号：5210.3）
4.Aqua bidest （Fresenius Kabi，目录号：16.231）
5.CASY 杯（OMNI Life Science，目录号：5651794）
6.CASY Ton 缓冲液（OMNI Life Science，目录号：5651808）
7.细胞刮刀（Sarstedt，目录号：83.3951）
8.CoolCell TM LX 冷冻容器（Merck，目录号：BCS-405G）
9.冷冻瓶，2 mL（ Simport ，目录号：T311-3）
10.二甲亚砜（DMSO）（Roth，目录号：A994.1）
11.一次性比色皿（BRAND，目录号：759015）
12.一次性移液器，5 mL、10 mL 和 25 mL（Falcon，目录号分别为：606180、607180 和 357525）
13.杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）（Pan Biotech TM ，目录号：P04-01500）
14.Eppendorf 管，0.5 mL（Eppendorf，目录号：0030121.023）
15.锥形瓶，250 mL（ Stoelzle Medical，目录号：21226368000）
16.三氯化铁（FeCl 3 ）（Sigma，目录号：236489）
17.FerroOrange （GERBU Biotechnik GmbH，目录号：F374-10）
18.胎牛血清（FBS）（Pan Biotech TM ，目录号：P30-3031）
19.庆大霉素（Gibco，目录号：15750-037），库存：50 mg/mL
20.玻璃烧杯，150 mL（ Ruprechter ，目录号：102113729）
21.甘油（Sigma，目录号：G5516-100ML）
22.Iscove改良的 Dulbecco 培养基（IMDM）（Pan Biotech TM ，目录号：P04-20150S3）
23.L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE17-605E）
24.Luna 细胞计数玻片（ Biocat ，目录号：L201B1C3GB）
25.溶源肉汤（LB）培养基Lennox（Roth，目录号：X964.2）
26.青霉素/链霉素（Capricorn Scientific，目录号：PS-B）
27.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号：17-515 F）
28.Pipetman L 入门套件，2、20、200 和 1,000 μL移液器（GILSON，目录号：F167370）
29.移液器吸头，10、200 和 1,250 μL （STARLAB，目录号分别为：S1110-3700、S1120-3810 和 S1112-1720）
30.聚丙烯管，50 mL（Falcon，目录号：352070）
31.肠沙门氏菌鼠伤寒血清型 ATCC14028 (ATCC)
32.Sartorius Midi Plus 移液控制器（Sartorius，目录号：710931）
33.组织培养烧瓶，750 mL，直颈（Falcon，目录号：353028）
34.LB 培养基（参见食谱）
35.含 30% 甘油的 LB 培养基（参见配方）
36.细胞培养基（参见食谱）
37.S .tm的细胞培养基（参见食谱）
38.染色液（参见配方）
39.氯化铁 (III) 溶液（参见配方）

细胞系

J774A.1 (ATCC TIB-67 TM ) 是 1968 年从患有网状细胞肉瘤的雌性 BALB/c 小鼠中分离出来的巨噬细胞系。

食谱

1.LB培养基
200 毫升水瓶
2 克 LB 中粉
°C 20 分钟，50 °C 10 分钟）

2.含 30% 甘油的 LB 培养基
将 300 μL甘油添加到 700 μL LB 培养基中

3.细胞培养基
500 mL 的DMEM
50 mL 胎牛血清
5 mL L-谷氨酰胺
5 mL 青霉素/链霉素

4.S.tm感染的细胞培养基
500 mL 的 DMEM
5 mL 胎牛血清
5 mL L-谷氨酰胺

5.染色液
5 mL 的 IMDM
1 µL橙铁(1 mmol/L)

6.氯化铁(III)溶液
135 mg FeCl 3
50 mL Aqua bidest

设备

1.自动化多模式酶标仪（TECAN Spark，目录号：1912001805）
2.Casy计数系统CASY TT（OMNI Life Science，目录号：TT2QA2571）
3.离心机（Hettich Micro 200R 和Rotanta 460R）
4.冰箱，-80 °C （ Thermo Fisher Scientific，目录号：15788587）
5.CO 2培养箱（ Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus ® HERAcell® ) _
6.层流柜（ EuroClone Sicherheitswerkbank Safe Mate Eco 1.2) ( Politakis Laborgeräte ，目录号：EN 12 469)
7.液氮储罐（ CryoShop ，目录号：CS-79105601）
8.LUNA 自动细胞计数器（ Biocat ，目录号：L10001-LG）
9.Millivac -Maxi 真空泵（Merck，目录号：SD1P014M04）
10.光度计（Eppendorf，目录号： BioPhotometer D30）
11.振荡培养箱（VWR，目录号：GFL 3031）

软件和数据集

1.GraphPad Prism 9.1（GraphPad 软件）
2.SparkControl TM （Spark Method Editor V.3，发布日期2021年6月1日）（TECAN Trading, Ltd.）

程序

A.J774A.1 巨噬细胞培养物等份的解冻

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.将水浴预热至 37 °C 。
2.预热细胞培养基（参见食谱）。
3.准备一个 50 mL 聚丙烯管，其中装有 25 mL 预热的细胞培养基。
4.从液氮储存中取出 J774A.1 细胞培养物等分试样，并在水浴中孵育细胞，直至等分试样几乎完全解冻。
5.将解冻的细胞培养物等分移入先前准备的 50 mL 聚丙烯管中。
6.×离心细胞 g 5 分钟。
7.将上清液丢弃在 150 mL 玻璃烧杯中。
8.将细胞沉淀重悬于 25 mL 细胞培养基中（参见配方）。
9.将细胞移入 750 mL 组织培养瓶中。
10.将细胞培养瓶放入 37 °C、 5% CO 2和 95% 湿度作为生长条件的细胞培养箱中。

B.J774A.1 细胞培养物的分裂

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.使用蠕动泵去除完整的细胞培养基。
2.用 10 mL 的 PBS 清洗细胞。
3.使用蠕动泵去除 PBS。
4.添加 10 mL 细胞培养基。
5.使用一次性细胞刮刀刮掉细胞。
6.准备一个新的细胞培养瓶，其中含有 24 mL 的细胞培养基。
7.将 1 mL 刮下的细胞移至先前准备的细胞培养瓶中。
8.将细胞培养瓶置于37°C、5% CO 2和95%湿度作为生长条件的细胞培养箱中。
9.每隔一天检查一次细胞密度。
10.如果细胞覆盖细胞培养瓶表面的90%，则进一步将细胞分装到新的细胞培养瓶中。

C.J774A.1 细胞的冷冻和储存

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.执行 B1-5 节中所述的步骤。
2.将刮下的细胞移入 50 mL 聚丙烯管中。
3.将 9 μL细胞悬液移至 0.5 mL Eppendorf 管中。
4.将 1 μL吖啶橙/碘化丙啶染色溶液混合到 9 μL细胞悬浮液中。
5.将 10 μL染色细胞移入 Luna 细胞计数玻片中。
6.使用 LUNA-FL 荧光和明场自动细胞计数器测量细胞数。
7.300 ×离心细胞 g 5 分钟。
8.准备冷冻混合物（含有 10% FBS、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素/链霉素 + 8% DMSO 的 DMEM）。
9.将上清液丢弃到 150 mL 玻璃烧杯中。
10.将细胞沉淀重悬于 FBS 中，浓度为 1 × 10 7 个细胞/800 μL 。
11.800 μL细胞与 800 μL冷冻混合物混合。
12.将 800 μL细胞悬液等分到冷冻管中。
13.冷冻管上标记细胞类型、细胞传代次数和储存日期。
14.将Cryo管放入 Cool Cell TM冷冻容器中，并在 -80 °C下放置两天。
15.将冷冻管置于液氮上以便长期储存。

D.将 J774A.1 细胞接种到 12 孔板上

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.使用蠕动泵去除完整的细胞培养基。
2.用 10 mL 的 PBS 清洗细胞两次。
3.使用蠕动泵去除 PBS。
4.添加 10 mL 含有 1% FBS 和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM。
注意：1% FBS 用于减少细胞培养基中的铁含量。胎牛血清的减少对于通过铁刺激实现铁过载是必要的。
5.使用一次性细胞刮刀刮掉细胞。
6.将 9 μL细胞悬液移至 0.5 mL Eppendorf 管中。
7.将 1 μL吖啶橙/碘化丙啶染色溶液混合到 9 μL细胞悬浮液中。
8.将 10 μL染色细胞移入 Luna 细胞计数玻片中。
9.使用 LUNA-FL 荧光和明场自动细胞计数器测量细胞数。
10.在 12 孔板中含有 1% FBS 和 1% L-谷氨酰胺的 1 mL DMEM 中种子 2.5 × 10 5 个细胞。
11.将细胞在细胞培养箱中在 37°C、5% CO 2和 37°C、95% 湿度作为生长条件下孵育过夜。

E.用铁处理 J774A.1 细胞培养物

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.用 50 μM FeCl 3 [氯化铁 (III) 溶液；请参阅食谱]或将其放置 5 小时而不进行处理（图 1）。
2.°C、 5% CO 2和 95% 湿度作为生长条件的细胞培养箱中孵育细胞 5 小时。

图 1. 本协议中描述的实验程序的时间线和 12 孔板布局。 A. 描述不同实验阶段的实验程序的时间线。 B. 12 孔板布局描绘了本协议中使用的处理和重复的排列。

F.鼠伤寒沙门氏菌 ( S.tm ) 库存的制备，如 Brigo 等人所述。 (2022)

1.从 -20 °C储存中取出一份肠沙门氏菌鼠伤寒血清型 ATCC14028 。
2.在室温下解冻等份。
注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
3.将 10 μL的S.tm吸移到 250 mL 锥形瓶中的 10 mL LB 介质中，并使用锡箔覆盖烧瓶顶部。
4.在摇床中以 200 rpm 的速度在 37 °C下孵育过夜。
5.第二天，将 50 μL过夜培养物移入 250 mL 锥形瓶中的新鲜 10 mL LB 培养基中，并用锡箔覆盖顶部。
6.将剩余的S.tm过夜培养物处置在适当的指定生物安全 2 级废物中，并对 250 mL 锥形烧瓶进行清洗和灭菌。
7.将培养物在摇床中于 37 °C 、200 rpm 的转速下孵育 1-2 小时。
8.测量 OD 600以检查S .tm 是否达到 0.5：
a.μL LB 介质测量空白来校准光度计。
b.将 500 μL的S.tm培养物移至新的一次性比色皿中并进行测量。
9.600在0.5至0.7之间时， S.tm达到最佳对数生长期。
注意：如果 OD 600值低于 0.5，则如上所述继续在 250 mL 锥形瓶中孵育培养物，直到达到OD 600值 0.5。值得注意的是， S.tm密度每 20 分钟重复一次。如果 OD 600值高于 0.7，则用 LB 培养基按 1:1 稀释培养物，并在 250 mL 锥形瓶中孵育培养物，直至 OD 600值达到 0.5。
10.S.tm计数（G 部分）；将细菌置于冰上，使用 Casy 计数系统进行计数，然后直至细胞感染。
11.将S .tm 培养物以 5000 ×离心 g，室温下 5 分钟。
12.使用蠕动泵去除上清液。
13.将沉淀重悬于 1 mL 新鲜制备的含 30% 甘油的 LB 培养基中（参见配方）。
14.制备 50 μL等分试样。
15.将等分试样储存在-20 °C 。
G.对活的S.tm进行计数，如 Brigo 等人所述。 (2022)

注意：Casy 计数系统的设置程序和使用的程序已在（ Pfeifhofer-Obermair等人，2022 年；Brigo 等人，2022 年）中进行了描述。或者，可以使用另一种计数/定量细菌的方法（即，通过显微镜进行手动计数）。
1.使用 45 μm毛细管。
2.通过将装有新鲜 10 mL Casy Ton 缓冲液的新 Casy 杯放置在测量单元下方来测量背景。
3.选择背景测量程序。
4.测量背景。它应该低于 30 个计数和 1 μm大小。否则，请清洗系统。
5.准备一个新的 Casy 杯，加入 10 mL 的 Casy Ton 缓冲液，并添加 5 μL的S .tm OD 600 0.5。
6.轻轻摇动。
7.将样品放在测量单元下方。
8.μm之间的程序。
9.措施。
10.单击“下一步”以获得活菌计数/mL = 活菌S .tm / mL。
注意： OD 600为 0.5 的新鲜制备的S .tm 培养物中的活菌计数在 2.5 × 10 8和 3 × 10 8活菌计数/ mL 之间。

H.在 12 孔板上用S.tm感染 J774A.1 巨噬细胞系

注意：在无菌层流柜中执行后续步骤。
1.S .tm 使用 10 的感染复数 (MOI) 感染细胞密度为 2.5 × 10 5 个细胞的所需孔；因此，每个孔中添加的S.tm数量是细胞数量的 10 倍。
2.S .tm计算示例：
a.要获得 MOI 10，请将细胞数量乘以 10：2.5 × 10 5 × 10 = 2.5 × 10 6 。
b.将计算出的细胞数除以获得的活沙门氏菌计数（例如 2.5 × 10 8 ）：
c.2.5 × 10 6活菌计数/mL： 2.5 × 10 8活菌计数/mL = 0.01 mL = 10 µL
3.将计算量的S.tm直接添加到含有用于感染S.tm 的细胞培养基的所需细胞培养孔中。
4.将细胞在细胞培养箱中孵育 1 小时（37 °C ，5% CO 2 ，95% 相对湿度）。

I.庆大霉素中和测定以及用铁继续处理 J774A.1 细胞培养物

1.°C水浴中预热介质和 PBS，以避免对细胞产生额外压力。
2.使用细胞培养蠕动泵去除含有非吞噬S .tm的培养基。
3.μg /mL 庆大霉素清洗细胞两次。
4.添加 1 mL 的 DMEM，辅以 1% FBS、1% L-谷氨酰胺和 25 μg /mL 庆大霉素。
5.μM FeCl 3 [氯化铁 (III) 溶液]再次处理细胞或不处理。
6.将细胞在细胞培养箱中孵育长达 24 小时（37 °C ，5% CO 2 ，95% 相对湿度）。

J.FerroOrange对 J774A.1 细胞进行染色

1.解冻等份橙铁。
2.准备染色溶液（参见配方）。
3.使用蠕动泵去除细胞培养基。
4.用 1 mL 的 PBS 轻轻清洗细胞两次。
5.使用蠕动泵去除 PBS。
6.将 200 μL准备好的染色液添加到每个细胞培养孔中。
7.细胞在 37 °C、 5% CO 2和 95% 湿度作为生长条件的细胞培养箱中孵育30 分钟。
8.将 12 孔板放入预热并预设的 5% CO 2 Spark 读板器中。

K.Spark 读板器的设置

下面显示了捕获的设置屏幕图像（图 2）。

图 2. Spark 读板器方法编辑器设置的屏幕截图

1.打开 Spark 板读取器方法编辑器。
2.选择 12 孔板。
注意：根据其商业来源选择正确的 12 孔板型号，以避免“底部读取模式”下的测量不准确并避免损坏检测器。
3.选择测量荧光强度。
4.将仪器温度设置为 37 °C 。
5.将 CO 2流量设置为 5%。
6.将模式更改为底部以进行荧光强度底部读数。
7.将荧光团设置更改为其他。
8.将荧光团参数设置为：
a.单色仪540 nm激发；带宽20纳米。
b.单色仪 585 nm 发射；带宽20纳米。
9.将Flash保留为 30。
10.将增益更改为手动并使用 140。
11.将 z 位置设置为手动。
注意：z 位置可以在测量前校准，并根据需要进行更改。
12.选择每口井的多个读数：
a.用户自定义。
b.类型：实心圆圈 (4 × 4)。
c.边界：1450。
13.保存设置。
14.打开 Spark 读板器控件。
15.加载FerroOrange测量设置。
16.确认温度为 37 °C，CO 2为 5%。
17.将 12 孔板放入火花板读取器中。
18.校准机器中的 z 位置（图 3）：
a.在左下角的菜单中选择z 位置。
b.在扫描子菜单中，选择用于信号检测的孔。
c.单击左下角的扫描按钮。
d.在结果图中，可以看到不同 z 位置的信号强度。

图 3. Spark 读板器校准 z 位置的屏幕截图。在SparkControl TM软件的z 位置面板中，用户能够测量多个 z 位置（y 轴）上的信号强度（x 轴），以确定检测的最佳 z 位置。

注意：z 位置决定测量设备距微板表面的距离。您可以通过上下移动板来改变它。当光从样品上的液体反射时，调整 Z 位置有助于最大化信噪比。
19.将自动建议的 z 位置应用于整个板或输入手动值。
20.单击开始。
21.测量完成后，Excel文件将自动打开。
22.保存该文件并继续进行数据分析。

数据分析

1.打开生成的 Excel 文件。 Excel 文件显示实验设置中执行的所有操作。
2.向下滚动直到显示测量数据。
3.表中显示了每孔 4 × 4 多次读取的每次单独测量。每个单独测量的位置显示在地图中，也可以在 Excel 文件中找到（参见图 4）。
4.在表中，在测定信息（即时间和温度）下方的行中，显示了一个孔的所有单独测量的平均值和标准偏差（示例输出Excel可在下面的验证部分下找到）。
5.打开 GraphPad Prism。

图 4. Excel 表中每孔多次读取的位置（左）以及一个孔中多次测量的图示（右）。转载自布里戈等人。（2023）。

6.在 GraphPad Prism 中选择一个柱形图。
7.根据组标记列。
8.将每组的技术重复添加到每列中。
9.检查图表。
10.将 y 轴标记为FerroOrange 的荧光强度。
11.将 x 轴标记为 24 小时刺激。
注：测量的 24 小时时间点的示例图如图 5 所示。

图 5.在有或没有感染的情况下铁处理 24 小时后FerroOrange的荧光强度。三次实验的数据一式三份 (n = 9)，显示为平均荧光强度 ± SD，标准化为未感染的对照条件（虚线）。 *表示p < 0.05，*** 表示 p < 0.001，通过单向方差分析进行评估。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

这里以巨噬细胞系 J774A.1 的感染模型为例，该协议可应用于其他巨噬细胞模型，如骨髓源性巨噬细胞或人类 THP-1 细胞系。
正如制造商在技术信息表（DOJINDO，产品代码 F374）中暗示的那样，可以使用共聚焦荧光显微镜（Cy3 通道）或流式细胞仪（Weber）观察和量化FerroOrange荧光强度等人，2020）。据我们所知，铁橙染料是不可固定的。

故障排除

潜在的问题包括低信号、不可信的测量结果或重复或单个实验之间的不适当差异。为了解决这个问题，应验证测定细节：细胞应均匀接种在孔中。尽管该协议建议每孔进行多次测量，但细胞的均匀分布将允许最一致的测量。 12 孔板的正确 z 位置对于最佳信噪比至关重要。如果使用其他制造商的 12 孔板，则可能需要更改此校准的 z 位置。由于FerroOrange对时间和光敏感，因此只有将新鲜染色等份解冻并立即使用才能获得准确的结果。最后，由于橙铁可能会从细胞中漏出，因此测量前不应更换培养基。

协议验证

Grubwieser之后进行了改编和修改等人。（2023）。
对于该协议，我们使用了如图 1 所示的 12 孔板布局。这使得能够同时测量每个实验条件的三个技术重复（孔）。此外，该实验独立重复3次，以提高研究结果的稳健性（图5）。图 6 显示了一项实验的示例性输出 Excel 文件。

图 6.一项实验的示例输出 Excel 文件。在输出 Excel 文件中，列出了所执行测量的详细信息（面板 1，蓝色）。下面的结果表显示了多次测量的数据（第 2 幅，橙色）。实验条件和用户计算如面板 3（绿色）所示。

致谢

GW 得到基督教多普勒学会和奥地利研究基金（FWF 博士计划 W1253 HOROS；和 FWF，DOC 82 doc.fund ）的资助。 PG 和 IT 得到了奥地利科学基金 (FWF, DOC 82 doc.fund ) 的支持。 NB 得到了 FWF 博士项目 - W1253 HOROS 的支持。 MN 由奥地利科学基金 (FWF, P33062) 资助。 Grubwieser等人，2023 年已使用该协议。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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Brigo, N.、Pfeifhofer-Obermair, C.、Demetz, E.、Tymoszuk, P. 和 Weiss, G. (2022)。表达红色荧光蛋白的肠沙门氏菌鼠血清型体外感染的巨噬细胞的流式细胞术表征。生物协议12(11)：e4440。
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