材料与试剂

生物材料

1.杨属雌树，结有柳絮和接近成熟的果实（见图 1）。在温带气候下，近乎成熟的柳絮在春末夏初之间发育。种子成熟的精确时间将取决于地理位置和当地的天气条件。
2.本协议中使用的繁殖材料是从美洲杨中收集的巴特尔。前马什。生长在加拿大安大略省大多伦多地区 (GTA) 和多伦多大学密西沙加校区的树木。有关树木位置和种子采集的详细信息见下表 1。

表 1. 本研究中使用的树木和材料
基因型（树）物种纬度经度海拔（米）采集日期
POP31三角松43.6311319-79.4715803752023年
POP32三角松43.6310720-79.4713711752023年
POP50三角松43.6294418-79.474405702023年
POP50三角松43.6294418-79.474405702022年
POP29三角松43.5464906-79.65995711102021年
POP19三角松43.5461274-79.66054351142023年

试剂

1.Murashige & Skoog (MS) 基础盐混合物（ PhytoTech Labs，目录号：M524）
2.植物防腐剂混合物（PPM）（Plant Cell Technology，目录号：PPM）
3.琼脂（ BioShop ，目录号：AGR003）
4.氢氧化钾（KOH）（ BioShop ，目录号：PHY202）
解决方案

1.MS 培养基 (100 mL)（参见配方）

食谱

1.MS 培养基 (100 mL)
使用 2.5 M KOH 和高压灭菌器将 pH 调节至 5.8。将培养基冷却至约 60°C，并在倾注板前立即添加 200 μL PPM（0.2% 最终浓度）。给定的体积产生四个板。
试剂最终浓度数量或体积
多发性硬化症0.5 ×0.2166克
琼脂0.7%（重量/体积）0.7克
水分子_不适用至 100 毫升
生产计划管理0.2%（体积比）200微升
全部的不适用100毫升

实验室用品

1.培养皿，圆形，100 mm × 15 mm（ Fisherbrand ，目录号：2071-FB0875712）
2.培养皿，方形，100 mm × 15 mm（ Fisherbrand ，目录号：08-757-11A ）
3.硼硅酸盐玻璃瓶（VWR，目录号：66011-085 ）
4.50 mL锥形离心管（ FroggaBio ，目录号：TB50-500）
5.裂片钳（ Almedic ，目录号：7737-A10-600）
6.微孔胶带（3M Micropore，目录号：1533-0）

家居用品

1.纸质午餐袋（1.88 L）（加拿大轮胎，目录号： 053-0200-8 ）
2.带盖植物繁殖盘（The Grow Depot，型号：Mondi Propagation Tray 10 × 20 ）
3.丝网铅笔杯（10厘米× 8厘米× 8厘米）；铅笔杯可在任何办公用品商店购买（例如 Grant & Toy、 Dollarstore ）
4.圆形竹串，直径5毫米，切成2-2.5厘米的片。圆形竹签可以在任何零售店或杂货店购买
5.不锈钢细网厨房过滤器（网孔尺寸 30 和 40）
6.白色纸张

设备

1.微珠灭菌器（ Fisherbrand ，目录号：14-955-342）
2.层流罩（ Thermo Scientific，型号： Heraguard ECO）
3.生长室（ Conviron ，型号：MTPS144）

软件和数据集

1.R Studio v 2023.03.0+386 [22]
2.R v4.3.x [23]

程序

A.种子采集

1.识别成熟的雌树并仔细监测生殖发育。
笔记：
a.杨属树木是雌雄异体的。成熟的雌树上会产生大量的种子（图1A）。
b.花朵排列成花簇（柳絮）。受精后，柔荑花序伸长，花朵发育成绿色果囊，携带正在发育和成熟的种子（图1B）。蒴果成熟时裂开，释放出带有毛状体（棉花）的种子，以通过风传播（图1C和1D）。
c.根据地理位置和主要天气条件，树木在春季开花，种子在 4-6 周内成熟 [13,16]。
2.当前几个胶囊开始打开时收集成熟的柳絮（图1C）。轻轻地从树枝上摘下柳絮，将它们从根部折断。将柳絮存放在纸袋中。
笔记：
a.如果过早收集柔荑花序（图 1B），种子将无法正常成熟，并且提取的种子将无法存活。如果柳絮在树上留得太长（图1D），风可以在很短的时间内（例如，一个下午）驱散整个种子作物。
b.因此，当柳絮在春末夏初成熟时，需要进行密切监测，最好是每天进行监测。

杨树的树势和结籽结构。 A.晚春的三角杨树（东部三叶杨）携带雌性柔荑花序（花簇）。每片柳絮包含数个蒴果；每朵花都由一朵花发展而来。 B-D。 P. deltoides 柔荑花序处于蒴果打开的不同阶段。 B. 未成熟的柔荑花序，其正在发育的种子完全封闭在蒴果中。 C. 带有第一个蒴果的柳絮在逐渐成熟后裂开，露出毛状体和种子以供风传播。 D. 柳絮上的所有胶囊都完全打开。它们释放出大量附着在长毛簇（棉花）上的种子。比例尺：2 厘米。

3.完成柳絮收集后，将材料带入室内并铺在托盘中。将柳絮均匀分布在单层中，并避免柳絮重叠，以便快速干燥。存放在干燥的地方。在实验室、一般存储区域或气候办公室中在室温 (20–24 °C) 下干燥效果很好。在温带气候下不需要特殊的干燥室。
注意：如果不干燥，材料可能会发霉并且种子无法正常成熟。
4.用盖子松松地盖住托盘，以将新出现的棉花保留在托盘内，同时保持适当的通风。
注意：种子脱落（即棉花出苗）需要一到七天的时间。
5.当所有胶囊打开并出现棉花时，应立即进行种子提取。
注意：一簇簇富含纤维素的长毛附着在小而轻的种子上，以利于风的传播。需要将毛发与种子分离，而不损坏脆弱的种皮。
6.产量：收获和加工 15-25 朵柔荑花序将产生大约 10,000 颗干净的种子（另见本协议的验证第 2 部分）。
注意：每棵柔荑花序的种子产量因树而异（图 3）。

B.种子提取——机械振荡提取

1.对工作区域的表面进行消毒，并用干净的纸完全覆盖。这将有助于稍后收集提取的种子。
2.将 10-15 根新鲜竹签放入高压灭菌的网状铅笔杯中，组装种子摇床（图 2A 和 2B）。
笔记：
a.添加的竹签片有利于机械提取种子。
b.不同形状、密度和材料的各种物体已经过测试用于机械种子提取。其中包括木头、小水族箱岩石、钢球或竹棍。此外，还测试了不同长度的竹片。长度为 2-2.5 厘米的竹签效果最佳。

图 2. 种子提取、清洁和储存所需的材料。答：我们的方案旨在专门使用 ( i ) 简单和 (ii) 易于清洁的物品，(iii) 每个家庭和实验室都可以轻松获得。 B. 我们组装好的种子摇床。将干燥成熟的柳絮（嵌入头发中的种子）制成的棉花放入网状铅笔杯中，并盖上培养皿的盖子。添加竹签碎片有助于机械提取。摇晃很容易释放出种子，其中一些会出现在杯子周围。 C. 完整、干净的种子储存在玻璃瓶中。比例尺：2 厘米。

3.将 0.5–1 克棉花转移到摇床中，并盖上培养皿盖（图 2B ）。
笔记：
a.棉花是从干燥成熟的柳絮中释放出来的白色绒毛（图1D，A.4），其中包含种子和附着的毛发。
b.避免将种子胶囊的一部分或柔荑花序中的任何其他硬块添加到摇床中。
c.保持绒毛松散，避免将其压下去。压缩棉花会降低种子提取的效率。
d.添加超过 1 克的棉花也会降低提取效率并延长摇动和清理过程。
4.种子摇床（图 2B）倾斜到一侧，并用手剧烈摇晃。种子将从摇床中掉落到纸张上。种子的毛发（大部分种子被去除的白色棉花）将留在里面。
5.继续摇动，直到只提取出一些种子，或者直到种子摇床内的毛状体形成小的毛毡状团块。
6.从工作表面的纸片上收集提取的种子，将它们放入一个小容器中，并放在一边以进行后续的清洁步骤。
7.再次用纸张覆盖工作表面，并从网杯中取出结块的毛状体，但将竹签留在铅笔杯内。
8.重复步骤 B3–B7，直到一种基因型（树）的所有棉花均已加工完毕。
9.为了避免样品混淆和跨基因型污染，请一次处理一种基因型的棉花。在处理新基因型之前，对网状铅笔杯进行消毒，使用一套新的竹签片，并彻底清洁工作区域。

C.种子清洗

1.将提取的种子放入细网厨房过滤器中，并以轻柔的圆周运动筛分材料。小碎片将通过筛子。
注意：我们测试了几种具有不同网孔尺寸的家居用品的适用性。典型的细网厨房过滤器效果最好。它保留了胡杨种子，但允许小碎片通过。
2.接下来，将种子放在一张纸上，并用镊子手动去除较大的碎片，例如残留的毛状体或干胶囊的碎片。
3.一些非常小的碎片可能是静态的并且会粘附在种子表面。通过将种子从一张纸转移到另一张纸上来去除这些种子。小的静电碎片留在后面并保留在纸张上。重复两三次。
4.将种子转移到干净的玻璃瓶中并储存在-20°C。
注意：种子储存条件至关重要。
a.种子具有细腻的种皮，几乎不含胚乳，并且不表现出休眠性。
b.新鲜成熟的杨树种子在有利条件下迅速发芽，但在自然条件下从胶囊中释放或在室温下储存种子时，种子质量在几周内迅速恶化[17,18,24–26]。
c.根据种子储存特性，杨树种子被认为是次正统的，干燥成熟的种子可以保存在寒冷或低于冰点的温度下，以延长种子活力的保存[27]。
d.使用我们的方案提取的种子立即储存在 -20 °C 下，可在数周和数年内保持高活力（参见验证第 5 节）。它们的种子水分含量 (SMC) 约为 10%，与报道的成熟干燥杨树种子的 SMC 值相当 [27]。

D.发芽测试——评估种子质量

1.按照配方中的详细说明准备 MS 板。在层流罩中工作，让板固化和干燥。
笔记：
a.杨树种子很容易因表面消毒而受损。不是表面灭菌，而是在培养基中添加0.2% PPM（最终浓度）以防止微生物污染。
b.或者，可以使用潮湿的滤纸进行发芽测试。
c.每个条件至少留出 100 颗种子用于发芽测试。
2.使用微珠消毒器对镊子进行消毒，并在处理种子之前让它冷却。使用消毒镊子将种子放在盘子上，并用微孔胶带密封盘子。在这里，我们每盘使用 50 颗种子，并至少包含两次重复。在层流罩下工作。
3.在长日照条件下（16:8 小时光照/黑暗和 21/19 °C 白天/夜间）将铺板的种子放入气候控制室中。
4.平板接种三天后计算发芽种子的数量，并计算发芽效率，即每平板接种总种子中发芽种子的数量乘以 100。
笔记：
a.当胚根（胚根）穿透种皮时，种子被认为已发芽。
b.包括前几年收集的种子批次，以研究长期种子储存的影响。
c.进一步记录发芽后的植物生长和存活率（参见验证部分 5）。

数据分析

验证部分中提供的所有数据均使用 R 和 R Studio 进行可视化。

协议验证

1.生物材料的选择
为了测试我们的种子提取方案，我们选择了东部三叶杨（ Populus deltoides 巴特尔。 ex Marsh .），原产于北美洲东部的杨属典型物种。 P. deltoides植物在潮湿、排水良好的地方迅速生长成大树，提供生态系统服务，并用于商业林业和城市环境。 2023 年 5 月至 6 月期间的春季和初夏期间，对雌性成熟树进行了鉴定并密切监测其种子发育和成熟情况（图 1）。

2.P. deltoides繁殖结构和种子生产的特征
为了评估我们的种子提取方案的有效性，我们首先旨在通过详细研究当地研究群体中的三棵树来描述P. deltoides的繁殖结构和种子生产（表 1，材料和试剂部分）。种子在雌性柳絮上的蒴果中发育。我们计算了每个蒴果的种子数量和每个柔荑花序的蒴果数量，并确定了每个柔荑花序的种子数量（图 3）。这是通过对所研究的每个柳絮上的每个胶囊手动采摘并单独计数胶囊内发育的所有种子来完成的。
平均而言，我们计算了三种基因型中每一种胶囊的 13、14 和 19 个种子，每个胶囊的种子的最小值和最大值范围为 1 到 38（图 3A）。请注意，并非每个胚珠最终都会产生成熟的种子，导致每个胶囊的种子数量各不相同。我们进一步观察到每个柔荑花平均有 41、44 和 40 个胶囊，具体取决于基因型（图 3B）。对于三种基因型中的每一种，每个柔荑花平均有大约 516、631 和 768 粒种子，成熟时单个柔荑花的极值范围为 391 到 921 粒种子（图 3C）。为了进行比较，Bessey [14] 报告称，对于一棵成熟的P. deltoides树，每个蒴果有 32 个种子，每个柔荑花序有 27 个蒴果。每片柔荑花序中含有 864 颗种子。同样，我们的观察结果完全在北美植物志中P. deltoides描述的范围内[28]。我们材料的表征（图 3）现在为我们的种子提取方案提供了准确的参考点。

图 3. 东部三叶杨 ( P. deltoides ) 种子生产的特征。杨属树木产生带有多个蒴果的柳絮，每个蒴果中含有多个种子。通过手动计数彻底表征繁殖材料。 A. 每个胶囊的种子数量。 B. 每片柔荑花序中的胶囊。 C. 每个花序的种子。显示了三种不同基因型（树）和每棵树随机选择的六种柔荑花序的数据。每个点代表一个单独的数据点。在箱线图中的每个方框内，水平线表示中位数，方框从第 25 个百分位数延伸到第 75个百分位数（即第一个和第三个四分位数）。晶须代表第 25 个百分位数和第 75 个百分位数之间四分位距的 1.5 倍。

3.P. deltoides生殖结构中有效提取种子
并非所有生产的种子都可以轻松提取。例如， Maisenhelder [18] 报道称，使用其出版物中描述的方法，只有 20% 的东部三叶杨种子可以轻松地从杨树中含有种子的结构中提取出来。尽管具有潜在的相关性，但杨树种子提取程序的有效性却很少报道。
我们将柳絮随机分配给手动种子计数（另参见图 3）或通过摇动进行机械提取，如本文所述。对于所研究的三种基因型，摇动平均每片柔荑花序可提取 402、591 和 635 个种子（图 4，左图）。这意味着每个柔荑花序中 78% 到 83%–94% 的种子可以通过摇动轻松从所研究的基因型中提取出来。在所有基因型中，使用我们的方案可以轻松提取柳絮中 85% 的种子（图 4，右图）。

P. deltoides繁殖结构中提取种子。本文提出的协议允许从P. deltoides棉花（深灰色，标签：“提取”）中有效提取清洁和健康的种子。为了进行比较，繁殖材料中存在的种子总数是通过手工挑选和计数确定的（白色，标签：“存在”）。柔荑花序被用作繁殖材料的参考单位。给出了三种不同基因型（树）和每棵树随机选择的六种柔荑花序和提取方法的数据（左图）。右图总结了不同基因型的数据。

4.三角棉中快速有效地提取干净的种子
时间要求也具有实际意义。因此，我们记录了使用我们的方案时在种子提取和种子清洁上花费的时间。这是与手动采摘所需的时间进行比较。我们选择了一种基因型 POP50，并为具有不同工作经验水平的几位实验室成员（本科生、研究生、研究科学家）并行记录了提取时间。使用我们的方案时，获得了非常干净的种子，平均每分钟 36 颗种子，而手动采摘种子时，每分钟大约只有 5 颗种子（图 5）。
当测试我们的手动摇床的不同材料时（图 2B），我们观察到网状笔架的形状对种子产量和种子提取速度有明显影响。圆形铅笔杯的效率低于方形网眼铅笔杯。因此，我们继续使用方形杯子并推荐它们用于未来的工作。

P. deltoides棉花中快速提取干净的种子。我们的提取方案和使用来自基因型 POP50 的棉花手工采摘的种子提取时间均已确定。每次提取四到五次。时间安排包括提取和清洁步骤。

5.提取的种子具有活力，适合组织培养和长期储存
种子必须能够用于测定和下游实验。为了评估种子质量，在标准发芽测试中测试了活力。杨树种子不进入休眠，在有利条件下迅速发芽，通常在24小时内。然而，种子的寿命本质上是有限的[5] 。
种子经过两种不同的储存条件，并在不同的时间间隔进行测试（图 6）。提取和清洗后直接进行测试的新鲜种子表现出高达 98% 的发芽率（图 6B），并且出苗的幼苗健康强壮（图 6A）。当种子在室温下保存 15 天时，活力下降 5%（发芽率 93%），并且这种趋势仍在持续。种子在室温下储存30天后，发芽率下降至84%（图6A和6B）。相比之下，在-20℃下保存相同时间（30天）的种子保留了94%的高发芽率，并且种子发芽旺盛（图6A和6B）。仅研究了- 20 °C 储存条件对种子活力的长期影响（图 6C 和 6D）。种子在低于冰点的温度下储存一年后，种子仍保持活力并发芽，效率高达 95%。尽管是不同的树，但在- 20 °C下储存两年后，发芽率仍然达到 79% 。还应该指出的是，成功发芽后，几乎所有植株都存活下来，继续生长良好，并建立了健康的植株（图7），进一步凸显了种子质量和种子健康。
发芽数据证实，用我们的方案提取的种子尽管性质脆弱，但完整且有活力，并且发芽旺盛。它们非常干净，适合在无菌条件下进行电镀、组织培养和实验。种子在环境条件下很快失去活力，不应在室温下储存。然而，在 -20 °C 下储存可在数周、数月甚至数年内保持良好的活力。

图 6. 提取的P. deltoides种子的活力和储存条件的影响。用我们的方案提取的种子进行了标准发芽测试。 A. 具有发芽的棉白杨幼苗的代表性板的图像。种子在-20°C 或室温 (RT) 下储存 0、15 和 30 天。 B. 显示了 A.C、D 中描述的条件下的发芽效率。前几年收集的种子在 -20°C 下储存较长时间（一年和两年）后进行了测试。再次给出了具有发芽幼苗的典型平板以及发芽效率。广告。将种子铺在MS培养基上，并在铺铺三天后对发芽率（胚根出现）进行评分。每盘制备五十粒种子，一式两份用于发芽测试。除储存两年的种子 (POP29) 外，所有数据均代表基因型 POP50。值得注意的是：新鲜种子和在 -20°C 下储存 15 天的种子在重复中具有相同的发芽值。因此，在这些条件下，误差线不可见。

图 7.三角杨植物在成功发芽后继续生长良好。经过标准发芽测试后，植物在平板 (A) 和组织培养物 (B) 中显示出健康的幼苗生长。 A. 两周龄植物，基因型 POP50。 B. 八周龄植物，基因型 POP19。比例尺：1 厘米。

结束语
大多数植物的生命都是从种子开始的。在这里，我们描述了收集和存储胡杨树种子的协议。该属具有经济和生态重要性，可作为落叶乔木的科学模型。种子脆弱、寿命短，附着在浓密的毛发上，需要快速分离和处理。我们的协议描述了一种仅使用简单的实验室和家庭用品来收集、提取和清洁这些种子的快速有效的方法。该协议中使用的所有设备都可以轻松清洁和消毒。种子质量以及最重要的储存条件已经过测试。发芽测试证实所获得的种子在数周、数月甚至数年的储存中具有持久的质量。获得的种子非常干净，适合在无菌条件下进行组织培养和实验。

致谢

我们感谢 Dana Al Refai 和 Stefan Heinen 对种子计数数据和种子铺板的贡献。这项工作得到了加拿大国家科学与工程研究委员会 (NSERC) (RGPIN-2017-06552)、加拿大创新基金会 (CFI, 36678) 和多伦多大学 (RSAF) 向 KB 提供的竞争性资金的慷慨支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

本研究不需要伦理批准。

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