材料与试剂

试剂

1.正磷酸（Carl Roth，目录号：6366.1）
2.Paladur ，液体成分（Anton Gerl，目录号：82462）
3.丁丙诺啡（拜耳，目录号：14439113）
4.异氟烷（cp-pharma，目录号：1214）
5.脱毛膏（薇婷）
6.Cutasept F（Hartmann AG，目录号：9803650）
7.Naropin（阿斯彭德国，目录号：02749854）
8.Vitagel （博士伦，目录号：1318187）
9.Braunol （博朗，目录号：190971）
10.Metacam（勃林格殷格翰，目录号：08890217）
实验室用品

1.圆形微型连接器，公头（OMNETICS，目录号：A79108-001）
2.不锈钢丝，7 股，PFA（AM Systems，目录号：793200）
3.焊锡（ Stannol ，目录号：574006）
4.透明胶水（ Silisto ，目录号：71024）
5.超柔性超小型屏蔽电缆（ Daburn ，目录号：2721/5）
6.钝针，27 G（Braun Petzold，目录号：9180117）
7.M9 连接器，公头（Binder，目录号：99-0413-00-05）
8.热缩管套件（ Haupa ，目录号：267200）
9.常规绝缘线（ RadioSpare ，目录号：872-5167）
10.圆形微型连接器，母头（OMNETICS，目录号：A79109）
11.特氟龙胶带（ Toolineo ，目录号：100000000178797）
12.铝箔
13.1 mL注射器（ Praxisdienst ，目录号：138322）
14.针，30 G（ Praxisdienst ，目录号：128330）
15.棉签
16.棉湿巾（ Maicell ，目录号：72100）
17.粘性胶水（ Pattex ，目录号：2804443）
18.手术刀刀片（Hartenstein，目录号：SJ10）
19.缝合材料，心电图（Serag Wiessner，目录号：LO07340B）
20.缝合材料，皮肤，编织丝（SMI，目录号：8200518）
21.牙签
22.胶水，黑色（ Wekem ，目录号：WK-2400）

设备

1.第三手（ Toolcraft ，目录号：‎TO-6871371）
2.体视显微镜（奥林巴斯，型号：SZ-61）
3.直钳（Fine Science Tools，目录号：11252-00）
4.焊台（Velleman，型号：VTSSC40N）
5.剪刀（Passau Impex，目录号：14060-10）
6.电缆剥线器（ Toolcraft ，目录号：TO-4861971）
7.打火机
8.万用表（福禄克，型号：179）
9.平衡（Kern，型号：EMB 2200-0）
10.麻醉盒（Hugo Sachs Elektronik ，目录号：50-0108）
11.麻醉面罩（Hugo Sachs Elektronik ，目录号：73-4858）
12.麻醉蒸发器（Hugo Sachs Elektronik ，目录号：34-2052）
13.MiniVac排气装置（Hugo Sachs Elektronik ，目录号：73-4910）
14.氟吸收剂过滤罐（Hugo Sachs Elektronik ，目录号：34-0415）
15.加热垫（Kent Scientific，型号： RightTemp Jr.）
16.弯钳（Fine Science Tools，目录号：11271-30）
17.镊子，直，钝（Fine Science Tools，目录号：11002-14）
18.饲喂插管（Fine Science Tools，目录号：18061-75）
19.持针器（Passau Impex，目录号：T220218）
20.手术刀手柄（Fine Science Tools，目录号：10003-12）
21.红外线灯（ Medisana ，目录号：88232）
22.带前置放大器（NPI Electronic，型号：DPA-2FX）
23.带数字转换器的模拟采集系统（例如， Plexon 综合体）
24.大型定制箱（如1m × 1m × 1m）
25.定制的有机玻璃圆柱体（规格取决于进行的行为实验；此处使用直径30厘米、高50厘米、壁厚0.4厘米的圆柱体）

软件和数据集

采集软件

与记录模拟信号的系统相关的专用软件。这里提供的数据是用数字Omniplex系统（ Plexon ，达拉斯，德克萨斯州，美国）记录的，该系统专为神经元活动的电记录而设计。

分析软件

1.MATLAB 2022a（至少在 2019a 版之前向后兼容；MathWorks，2022 年 9 月 3 日）
2.ECG_Process包（自定义编写的代码）；当前版本可以在以下位置找到： https ://github.com/Defense-Circuits-Lab/ECGanalysis
3.Prism v9.5（GraphPad，2023 年 1 月 26 日）

程序

A.心电图连接器制造

参见一般说明 1。
1.圆形微型连接器有六个引脚，其中三个用于制造 ECG 连接器。将微型连接器固定在第三只手的夹具中，并将所有五个外围引脚弯曲至 90°。用细镊子捏住中心销并扭转它，使其靠近底座断裂（图1 ）。
注意：如果不需要额外的销钉，也可以将其拆除或在侧面弯曲以增加支撑。

图 1. 心电图 (ECG) 连接器的制造。 A. 三个销钉向外弯曲，其余三个销钉剪短。 B. 将电线的剥皮端焊接到引脚上。 C. 第二个 ECG 和接地线焊接到另外两个引脚上。 D. 在连接器内部以及所有引脚和剥线部分涂上一层胶水。比例尺：5 毫米。

2.将两根电线焊接到微型连接器引脚 #1 和 #2 上：
a.将两根电线切成 7 厘米长。
b.用细镊子从电线的一侧剥去 5 毫米。
c.在销钉上添加极少量的正磷酸。
d.将剥开的电线与引脚对齐。
e.在烙铁上取少量焊锡并短暂接触引脚/电线组合。
注意：焊接应该很容易——熔化的锡应该立即流到引脚上，发出独特的声音。结果应该是非常薄的焊料，看起来有光泽。锡不应预先在熨斗上放置太长时间，并且熨斗不应在插针上停留超过一瞬间，因为它可能会因加热连接器而使其内部松动。
f.对 2 号引脚重复上述步骤。
3.重复步骤 A2，将长度为 2 厘米的参考线焊接到连接器引脚 #6 上。
4.测试焊接质量；快速而有力地拉动每根电线，可以评估电线是否正确焊接到引脚上。
注意：良好的焊接可以承受很大的拉力，这是高质量录音的预示。
5.在所有连接处和剥开的电线上涂上胶水。
6.检查连接，将专用母连接器（与电缆型号相同）安装到连接器上。剥去电极线的最尖端。使用安装在万用表上的精细工具接触每对母连接器的引脚/电极，以检查连接是否正确。以防万一，在仍然触摸每根电线的同时，触摸母连接器上的连续引脚；只有合适的电阻才应该具有低电阻。

B.制造跳线

请参阅一般注释 2。
1.剪断适当长度的超小型屏蔽电缆。考虑到长时间录音期间可能出现的环路，这应该允许电缆在由滑轮固定的同时从探头自由地延伸到鼠标的头部。
注意：潜在损坏通常位于鼠标一侧，是由于咬伤或扭转导致绝缘层内电线破裂造成的。为了节省时间和资源，将电缆加长是有意义的，这样在必要时只能重新制作鼠标一侧。理想的长度取决于如何处理额外的电缆长度，而不会有因弯曲或滚动而损坏的风险。
2.组装电缆的探头侧（图 2）。
注意：建议从这一侧开始，以便能够检查护套是否正确连接鼠标侧的远端，一直屏蔽到探头侧的电线。

图2 .制造跳线的探头侧。 A. 微型屏蔽电缆的制备。对电缆进行去绝缘处理( i )，并小心地拆开护套 (ii)。将单根电线展开、去绝缘(iii)，然后焊接到连接器的引脚上 (iv)。 B. 通过将额外的电线焊接到跳线 ( ii ) 的护套上，将其用作接地参考 (i )。使用不同尺寸的热缩管对连接进行绝缘 (iii)。

a.首先将 M9 连接器外壳滑到电缆上，然后使用不同直径的热缩套管：一种几乎与连接器的螺纹部分一样大，一种与电缆松散地配合，一种是中间尺寸。
b.小心地去除大约 1 厘米的绝缘层，然后使用钝针尖插入编织物之间并朝切割侧拉动，轻轻解开护套。将护套松散地捆扎在一侧。松开单根电线并按照图 2 进行排列。
注意：避免施加过大的力，因为单根电线上的绝缘层很脆弱，无意中的损坏可能会因内部短路而导致最终产品报废。
c.将电线末端剥去 1-2 毫米。
d.保持股线紧密对齐，将它们短暂浸入表面上的一滴正磷酸中，然后涂上焊锡。
注意：确保任何单根电线中没有任何单股突出，因为这可能会使后续步骤复杂化。此外，请注意，当暴露在过热的环境中时，电线的绝缘层往往会显着收缩，因此在焊接时要小心。
e.放置电缆，使要焊接的一端位于顶部并与连接器的引脚对齐。您可以通过将电缆固定在其中一个双目旋钮上并使用第三手动工具旋转连接器，将销钉定位在相应电线的前面来实现这一点。
f.在每个销钉上滴一小滴酸。
注意：仅使用最少量的酸，因为随着时间的推移，过量使用可能会导致过度腐蚀。
g.将第一根电线插入第一个引脚并涂上一些焊锡。应加热焊料，直到其在引脚上完全变成液体，但注意不要过热，因为它可能会熔化细线上的绝缘层。对剩余的引脚重复此过程。
h.调整连接器的角度以确保与电缆完美对齐。对电缆施加张力，例如轻轻拉动电缆并增加重量以防止其松弛。
i.将胶水涂在引脚和电线上，从引脚底部开始，一直涂到电缆剥皮部分的顶部。分几个阶段进行，逐渐添加胶水并使用Paladur 的溶剂快速固化粘合剂。
注意：注意不要使胶水超出连接器的正常尺寸。请注意，在使用Paladur溶剂后，胶水可能会短暂变得更加液态。
关键：从这一点开始，电缆的非脱绝缘部分和绝缘部分之间的连接变得极其脆弱，电线很容易断裂。完全避免弯曲或扭曲它们。
j.将最小的热缩管移近连接器。
k.对于接地线，准备一根普通电线，将其去绝缘约 1 厘米，并在裸露的电线上涂上焊锡。
l.将此电线插入热缩管（以及已位于内部的电缆）中，并将裸露的电线放置在护套旁边。
m.涂少量酸并将两个组件焊接在一起。
n.轻轻地将最小的热缩管一直滑到粘合部分，然后加热。
关键：收缩管子时要小心，不要施加过多的热量或时间过长。电缆内每根电线的绝缘层非常薄，很容易熔化。
o.依次添加和收缩另外两根管子。
关键：尽量保持组件笔直。否则，可能会难以将连接器的外壳安装到位。
p.小心地滑下连接器的各个组件。电缆密封套包含齿，这些齿将由远端螺母拧紧以夹紧电缆，因此建议将连接器拆卸成不同的部件。
我。从主轴开始，应将其拧到连接器销钉所在的部分上。
关键：拧紧时，确保轴不会扭曲热缩管，从而扭曲整个电缆/电线组件。由于它们是焊接在一起的，扭转可能会导致它们折断。
二.然后，添加牙齿。
三.最后，将螺母拧到主轴上，固定并拧紧齿，确保牢牢抓住热缩部分。
3.制作电缆的鼠标侧（图 3）。

图 3. 跳线鼠标侧的制造。 A. 夹在鳄鱼夹中的微型连接器的弯曲引脚。 B. 连接器的单根电线和引脚之间的薄焊接连接。 C. 嵌入胶水中。 D. 在连接处缠绕两层聚四氟乙烯胶带。 E. 准备一块铝箔来绝缘连接。 F. 包裹铝箔。 G. 两根热缩管构成连接盖。

a.首先滑动两个不同直径的热缩件：一个比连接器稍大，另一个松散地围绕电缆。
注意：如果您想格外小心，或者对探头侧有疑问，现在是通过测试连续电气来检查探头侧连接器上的引脚是否仍正确连接到各个电线的最佳时机。连接正确，线间无短路。为此，请使用处于电阻检查模式的万用表。
b.按照之前的说明准备电缆末端，但剥去较少的绝缘层。
c.将连接器固定在鳄鱼夹中，将连接器的引脚向外弯曲，然后将电缆放置在引脚上方。
d.根据提供的图焊接单独的电线。
关键：焊锡应尽可能薄并呈现出闪亮的外观。
e.将连接器插针恢复至笔直位置。
注意：确保没有短路（焊料接触另一个焊料或相邻引脚）。如有必要，只要外径保持在连接器的限制范围内，引脚就可以横向弯曲。
f.将组件嵌入胶水中，尝试在电线接近电缆时将其拉得更近。
g.剪下一块聚四氟乙烯胶带，将其缠绕在胶水上，不要先使其变形。至少涂抹两层。此步骤对于确保焊接和屏蔽之间的适当绝缘至关重要，以防胶水未覆盖整个区域。
注意：为防止特氟龙移位，建议在放置特氟龙之前在已固化的胶水中添加一层强力胶薄膜。
h.准备一块铝箔，使其与连接器底部和电缆剥皮部分之间的距离相匹配。在连接器和电缆上涂抹胶水（避开护套），并牢固地粘贴一层铝箔。修剪多余的箔片。
i.将电缆护套铺在箔层上。放下最紧的管子并将其收缩。
j.确认参考线的探头侧与铝箔层连接良好，检查参考线。
k.小心地降低另一块，直到它到达连接器的边缘（但避免过度延伸），然后收缩它。
l.确保所有电线均已正确连接。将两个连接器固定在夹子中，并使用带有精细工具（或电线）的万用表来验证每个引脚是否仅与其对应的对应引脚相连，而不与其他引脚相连（图 4 ）。

图 4. 最后检查电线连接是否正确。 A. 电缆两端均已完成。 B. 使用万用表确认探头侧的所有引脚是否正确连接到电缆的鼠标侧连接器。

C.手术：植入

1.准备手术区域和整个手术所需的所有设备（图 5 ）。

图5 .手术野的准备

2.准备动物（图 6 A）。

图 6.心电图 (ECG) 连接器植入手术过程。 A.准备好植入导线后，小鼠的背侧 ( i ) 和腹侧 (ii) 视图。 B. 将饲喂插管从胸部皮下插入头部切口。 ECG 连接器的电缆穿过空心插管。 C. 将一个小胶球涂在剥去的金属丝末端，并在其附近打一个结，以将金属丝缝合到下面的肌肉组织上 ( i )。皮肤切口缝合 2-3 个结 (ii)。 D. 暴露的头骨表面干燥 ( i ) 并粗糙化 (ii, iii)。将连接器粘在头骨上 (iv)，并添加一层黑色胶水 (v, vi)。

a.在手术开始前 20-30 分钟在颈部皮下注射足够量的丁丙诺啡（剂量 0.1 mg/kg），用于围手术期镇痛。
b.将动物放入异氟醚感应室（4% 感应，0.6 L/min 氧气流量）中麻醉。
c.将鼠标转移到加热垫上，并将头部放入麻醉面罩中。
d.检查爪子反射以确保已达到深度麻醉。
e.用 1.5% 异氟醚氧气维持麻醉。
f.将脱毛膏涂抹在头顶，去除 1 × 1 厘米区域的毛发。
g.将动物翻转过来，在动物胸部的右上和左下涂抹脱毛膏。
h.将其放回俯卧位置以再次接触头部。
i.Cutasept 3 次对皮肤进行消毒，并使用 1 mL 注射器直接在头骨顶部的皮肤下方放置 200 μL Naropin 进行局部麻醉。
3.打开皮肤。
a.用锋利的剪刀剪下头部0.5 × 0.5 厘米的皮肤。
b.Cutasept消毒胸部皮肤3 次。
c.用锋利的剪刀（3-5 毫米）在胸部皮肤上切一个小切口。
4.穿入心电图线（图 6 B）。
a.使用钝钳小心地从皮肤上解剖下面的组织。
b.将饲喂插管插入切口，轻轻地将其向背部推向头部打开的皮肤。
关键：始终保持插管的角度，使尖端朝外，以防止损坏任何器官。滑动插管不需要很大的力量。如果感觉不同，则插管可能没有穿入皮下。插入前将插管保持在无菌水中，以便其顺利滑到组织上，然后彻底消毒。
c.将适当的导线从心电图连接器穿过头部侧的空心喂食针。当导线到达插管的胸部开口时，小心地将插管拉出，将导线留在原位。
注意：一些结膜组织可能会阻塞插管。在这种情况下，只需用针戳一下即可将孔打开。拔出插管后，取出所有组织并对其进行消毒。尝试始终使用连接器右侧的电线连接右胸部，左胸部也是如此。
5.准备好电线。
a.使用细镊子剥去 5 毫米的线尖。
b.在导线尖端的最末端涂上粘性胶水。不要铺得太多，并确保留下足够的剥线。使用少量Paladur溶剂聚合胶水。
注意：可以用一些镊子将电线的尖端压平（仅尖端），使单根线稍微散开，从而更容易将胶水保留在那里。
6.固定电线和皮肤缝合线（图 6 C）。
a.用镊子解剖结组织以暴露肌肉并将线缝合到其上，垂直于肌纤维。结应靠近胶水放置。
注意：将电线留得足够长，以免妨碍动物随后的运动。最好在头部保留一个小环，然后将其安装在皮下。
b.用两次间断缝合闭合皮肤，并用碘基消毒剂（例如， Braunol ）对伤口进行消毒。
7.使用 ECG 连接器的第二根电线在胸部右上方重复步骤C4 –C6。
8.将连接器固定在鼠标头上（图 6 D）。
a.再次将动物转为俯卧位。用棉签擦拭颅骨，去除颅骨上剩余的组织。用手术刀刀片背面轻轻刮擦头骨表面，小心地使其粗糙。
注意：将头部正确固定在立体定向框架中有助于这些步骤，但这也可以在麻醉面罩中进行。
b.将微型连接器粘在头骨上，并用少量Paladur聚合胶水溶剂。
注意：头骨需要绝对干燥。
c.剥去剩余金属丝的一小部分并将其滑入皮下，然后在骨头上涂上胶水将其粘合到位。
d.通过在连接器周围添加更多胶水并使其聚合来形成小头盖。
e.涂上一层不透明的黑胶。
关键：确保有足够的头骨表面暴露并用于帽子。
9.皮下注射metacam （剂量2mg/kg），将动物转移至笼中，并使其在红外灯下恢复。
10.监视动物直到它完全从麻醉中恢复。
11.术后7 天每 12 小时监测一次动物的恢复情况。
12.对于长期术后护理，每天监测体重和一般状态。
注意：密切注意缝合线。这种手术通常耐受性很好，动物在大约 1 小时后行为完全恢复，并在 3-4 天后恢复术前体重。
请参阅一般注释 2。
13.（可选）实验结束时，取出头盖并放入丙酮中过夜。丙酮会溶解胶水，但仅放置半天就不会损坏连接器。用水冲洗并干燥。仔细检查引脚完整性和一般状况。如果小心处理，连接器可以重复使用几次。
重要：丙酮会溶解并稀释氰基丙烯酸酯胶，但蒸发后仍可能留下一层胶；可以将几个头帽同时放入丙酮中，但不能太多，丙酮的量要相应。如果在丙酮中停留时间过长，连接器也会开始损坏。定期检查胶水是否溶解，必要时更换丙酮溶液。重复使用连接器之前检查连接器时要格外小心：连接母连接器并确保母连接器的每个引脚与（重复使用的）公连接器上相应的引脚之间存在连接。还要按照步骤 A6 中的说明检查每个“准备植入”连接器。

D.数据采集

1.在数据采集之前让动物恢复至少一周。
2.在几天内让动物熟悉处理和连接程序。
注意：处理动物至少三天可显着改善后续连接程序。第一天，让动物多次探索手掌。在接下来的几天里，用食指和拇指轻轻抓住头盖，同时用其他手指固定尾巴以防止逃脱，逐渐使动物习惯于被握在手中。
3.录制当天，将动物连接到跳线并将其放置在行为场所，最好有持续的视频监控。
笔记：
a.可以使用换向器来防止缠结，但带有两个凹槽轮、一根轻质螺纹和一个 5 mL 注射器作为配重的简单滑轮系统效果很好。轻轻地将线系在电缆和注射器头上。通过修改注射器中的水位来调节反拉力。电缆上的理想结位置应根据经验确定（图 7 ）。
b.尽可能尝试仅在电缆连接到鼠标时打开放大器，以防止系统饱和和潜在损坏。

图 7. 使用滑轮系统的记录设置。一根线绑在心电图 ( ECG) 电缆上并围绕两个滑轮运行。线的另一端系有一个可调节配重。

4.打开接收放大器输出的采集系统以在线显示它并将其保存到文件中。为了在 ECG 信号中保留足够的分辨率并允许准确的心跳时间戳，理想情况下采样率应为 5 kHz 或更高（请记住，太高没有用，并且会增加文件大小和处理时间）。
注意：当前示例基于 NPI 放大器和Plexon采集系统 ( Omniplex /Cineplex)。
注意：有关文件格式注意事项和预处理，请参阅数据分析部分 A。
批判的：如果实验涉及将心电图数据与行为数据对齐，则必须确保心电图信号和视频记录系统之间的完美同步。在实验开始之前应该仔细计划这种同步。记录系统依靠内部时钟来采样信号，虽然这些时钟通常单独相当准确，但在处理两个独立的系统及其时钟时可能会出现问题：
a) 它们可能在不同时间启动（一个系统启动速度可能较慢或需要手动触发），从而导致初始时间滞后（偏移）。
b) 他们的时钟可能比彼此运行得稍快或稍慢，从而导致时间差异。例如，在一个系统上显示为 t = 10 分钟，在另一个系统上显示为 t = 9 分钟 56 秒（漂移）。
预先解决这些同步挑战对于精确的数据对齐和防止进一步的误解至关重要。
5.调整放大器设置（这些设置可能因系统而异，但通常存在以下参数）：
a.通道：每个电极都有一个参考通道和一个“信号”通道。在任何情况下，每个电极的信号都是参考电极和该电极之间的电压差。然而，对于每个通道，我们也可以选择输出两个电极之间的差异。
注意：除非一个电极的信号非常差（受到噪声污染），否则最好将一个通道设置为输出差分信号，并将另一个通道保留为单个输出，并为此使用更好的通道。应针对每只小鼠单独进行此选择，这不应导致分析问题，除非配置很重要的非常具体的分析（例如，对心跳形态感兴趣）。
b.滤波器：可以调整低通和高通滤波器。低通滤波器保留信号中的较低频率，同时降低较高频率。相反，高通滤波器去除低频并保留高频。
我。低通滤波器：大约 1 kHz。
二.高通滤波器：设置一个值以消除心电信号中的缓慢波动。 30 Hz 是一个不错的选择。如果放大器具有 50 Hz（或 60 Hz，具体取决于当地电网）陷波滤波器，则当信号受到普遍的电网相关干扰影响时激活它会很有帮助。
注意：放大器的模拟滤波器不会急剧截止信号中的特定频率。相反，它们对频谱有逐渐的影响。例如，如果高通滤波器设置为 30 Hz，它将降低较低频率，同时不同程度地允许较高频率通过。它可以被认为是影响不同频率的缓坡。这意味着在设置这些过滤器时，必须考虑研究的范围。如果目标不是研究心跳形态，那么直接调整滤波器设置以提高心跳与波结构背景的可分离性似乎是合理且更稳健的。
c.增益：确保增益设置得足够高，以便清晰地显示信号而不使其饱和，这意味着避免信号触及采集系统的上限或下限。如果发生饱和，信号在这些极值处将显示为一条平线。
注意：有关初始设置设备和识别潜在问题的综合指南和提示，请参阅“故障排除问题 2”。
d.偏移：偏移允许您调整信号的基线电平，有效地将其向上或向下移动。旨在将基线（通常在心跳之间发现）定位在接近采集系统的中间值的位置，例如，如果系统的范围从-5V 到5V，则约为0V。这种调整有助于将信号保持在系统的最佳工作范围内。

数据分析

A.心跳提取

本节介绍使用自定义 MATLAB 代码提取心跳的过程。这种提取是用户友好的，不需要任何编码经验。我们提供 MATLAB 代码作为常规和实时脚本，以允许从关联的数据集执行不同的步骤。

1.加载数据。
GUI 可容纳各种数据源，包括文本/.csv 文件、.mat 文件、.pl2 文件 ( Plexon ) 和 . tsq文件（塔克-戴维斯）。
注意：虽然大多数系统允许将数据导出为 csv 文件，但支持的文件格式列表可以根据需要轻松扩展。它只需要 MATLAB 的专用 API 来访问专有文件格式，或者在文件是伪装的文本文件的其他情况下，需要有关文件中的标头和数据组织的知识。
a.单击“开始路径”以选择起始文件夹（可选，为方便起见）。
b.单击“加载文件”以选择数据文件。您还可以选择“_ HeartBeats.mat ”文件（输出文件）以在 GUI 中重新加载分析（图 8 ）。

图 8. 将文件加载到处理图形用户界面 (GUI) 中。作为一个选项，您可以定义“起始路径”来选择批处理文件夹。单击“加载文件”以选择要预处理的第一个文件。

2.原始心电图预处理。
原始心电图信号可以进行预处理，其中包括：
a.去趋势：最初是为具有显着基线变化的人类录音而设计的，此功能也可以使其他系统的录音受益。它涉及使用大窗口（覆盖多个心跳）计算滑动平均值并从原始信号中减去它。
b.带通滤波：可以应用零相位带通滤波器来消除缓慢波动和噪声（零相位滤波确保无信号偏移）。
我。通过勾选相应的框来启用去趋势和/或带通滤波。
二.根据需要调整编辑框中的值（图 9 ）。

心电图(ECG) 信号的预处理。去趋势和带通滤波选项可以通过勾选相应的框来启用。根据需要调整值。

3.心电图信号的转换。
与背景相比，心电图信号被提升到 n 次方（其中 n 是偶数）以放大心跳。通常，将信号提升到 4 次方会产生最佳结果，但可以根据经验使用不同的值进行实验。然后使用足够大以包含一次心跳的高斯核对所得信号进行平滑，从而创建平滑的峰值。
笔记：某些心电图信号可能包含具有相似幅度和频率的噪声（尖锐伪影）。在这种情况下，减小平滑窗口大小可能是有益的，可以防止噪声与峰值合并。然而，这可能会导致检测到的峰值数量增加。在中等情况下，算法可以有效地处理这个问题。
调整编辑框中的值，并根据需要使用以下步骤进行优化。
4.阈值和假定的心跳提取。
对升高/平滑的信号进行阈值设置以检测潜在的心跳。 “窗口”参数确定阈值交叉之前和之后被选为单个波形（潜在心跳）的样本数。
注意：此参数对于算法步骤非常重要，但不需要非常严格地围绕一个心跳。重要的是它捕捉了整个节拍而不与另一个节拍重叠。
a.心电图上，识别心跳幅度最小的窗口并放大该区域。调整蓝线以穿过与最小心跳对应的峰值（大约其高度的 1/5；图 10 ）。
b.查看心率曲线出现急剧、不自然的下降，表明心跳缺失。放大可疑区域以确认未检测到心跳（无实心菱形），并在必要时调整阈值。
注意：确保在此步骤检测到所有心跳至关重要。进一步的步骤涉及手动清理，如果某些节拍丢失，则可能会浪费，因为重新调整阈值将重置其余节拍。
c.如果这是这些条件下的第一个记录，请勾选“绘制波形”复选框。对于每个阈值峰值，这将直接在心电图迹线上显示相应的波形。调整“窗口”参数的值（阈值交叉之前和之后的样本数），以便包含单个节拍的主要特征（如叠加层上所示）。
注意：始终绘制波形和/或峰值可能会导致 GUI 反应性降低。

图 10. 检测潜在心跳的阈值。通过拖动线或输入值以跨越录音中的最小峰值来调整阈值（蓝线）。

5.运行算法。
该算法迭代运行，系统地分析连续的假定心跳。以下是其操作的简要概述：
模板创建：该算法首先构建从所有假定的心跳中派生的代表性波形。该模板可用作与潜在候选峰进行比较、计算相关值的参考。
迭代：从至少几个连续峰值具有良好相关性得分的区域开始，它将前进到下一个峰值，并从一个峰值迭代到另一个峰值。
对于每个峰值，算法根据峰值的相关性得分和位置得分计算平均得分。为了获得位置分数，该算法根据先前（先前验证的）节拍创建高斯概率曲线。如果接下来的峰值接近之前间隔的平均值，则得分最高，并且对于偏离的值会缓慢下降。
当给定时间窗口内所有假定的心跳中的一个或两个分数都具有极低的值时，算法将采用并行路径。在每条路径中，它选择位置接近的峰值之一作为有效心跳并丢弃其他峰值。对于每条路径，算法都会处理相应的心电图信号并进行几秒钟的记录，如此处所述。然后，该算法考虑从片段中所有峰的相关性和位置得分得出的聚合得分，计算从每种可能性获得的片段的全局得分。根据全局分数，算法决定将哪些初始候选保留为有效心跳，并继续进一步处理信号。
注意：该算法特意调整为干净的部分，其中峰值可以安全地识别为心跳并忽略其余部分，以便可以手动处理。
6.手动后处理。
检查心率曲线是否存在可疑模式。如果算法难以区分噪声和实际心跳，但实验者可以自信地识别真实心跳，则可以安全地丢弃噪声峰值并保留真实心跳。但是，如果实验者有任何疑问，我们建议排除从（并包括）最后一次明确识别的有效心跳开始到（并包括）第一个后续有效心跳的时间段。
a.选择允许查看心率曲线异常的缩放幅度（通常约为 200 秒）。使用顶部的滑块或按键盘上的左/右箭头浏览录音。
b.检查是否有异常情况（图 11 ）。
我。一个典型的例子是，当采集的是噪声峰值而不是非常接近的心跳时；因为噪声峰值太早，它会导致心率急剧且非常短暂的上升，当用于计算心率的滑动窗口经过它时，它会产生同样急剧的下降。这种双相噪声可能是最常见且最容易识别的。
二.大多数时候，当算法无法成功清除某些部分时，手动处理包括取消点击噪声峰值和/或将整个部分设置为排除。然后可以将排除的范围设置为NaN值以进行进一步处理。要排除范围，请单击添加排除范围并在心电图上绘制一个矩形。重叠的范围会自动合并，也可以通过单击范围然后单击“删除所选范围”来删除范围。
笔记：
1）。除了处理偶尔质量不理想的录音（信噪比差、伪像等）之外，手动后处理速度非常快。只需几次记录即可熟悉心率曲线及其通常的外观，并快速浏览即可有效发现有问题的范围。
2）。在此步骤中最好使用小窗口进行心率处理，因为它不会像较大窗口那样平滑异常。 0.6 秒通常足以不会在心率中产生间隙，并且可以很好地识别有问题的范围。
3）。当手动勾选/取消勾选多个峰值时，最好在（取消）选择时取消勾选自动更新，然后再勾选它。这样可以防止每次操作后刷新 GUI，从而节省时间。
4).排除的范围显示为填充的灰色区域。随后的空白时段以虚线结尾，表示由于排除的部分而无法处理心率的时段，但其本身并不是排除的范围。
关键：强烈建议完美地预处理每个记录，因为这样可以确保它们可以安全地用于任何类型的后续分析，而不会因在量化中添加噪声或偏差而影响结果。

图 11. 检查异常情况。嘈杂的录音片段示例。通过心率曲线（上）上的急剧、短暂的上升和下降，可以很容易地看到噪声峰值。通过单击“添加排除范围”取消选择错误选取的峰或排除范围。

7.保存。
GUI 导出两个文件：
a.一个“_ HeartBeats.mat ”文件，包含心跳时间戳和排除范围。
b.“_ ECGLog.mat ”文件，包含分析参数以及有关实验者和日期的信息。
注意：可以在该功能中启用一个选项，将心跳和排除范围导出为 .csv 文件。

B.从原始心跳中获取读数

可以实现与 GUI 使用的方法相同的方法来从心跳导出心率。
1.选择固定的窗口大小，例如 0.6 秒。
2.对于每个心跳，计算当前心跳之前 0.6 秒窗口内发生的心跳次数。
3.将此计数除以窗口中的第一个节拍与当前节拍之间的时间差。
4.解析排除范围并将相应时间窗口中的所有值（加上平均窗口的大小）设置为NaN 。这允许在小鼠/周期之间进行平均，而不会出现来自不良范围的伪影。
5.（可选）此方法提供了一种快速有效的从心跳得出心率的方法。然而，它会导致数据点间隔不规则，因为每次心跳都有一个数据点。为了使其适合平均值或创建周刺激时间直方图，必须将数据重新采样到固定采样率，以便数据均匀分布。
注意：当使用此方法从心跳处理心率时，重要的是要了解窗口在每次心跳时精确结束。这意味着心率曲线显示每次心跳心率立即增加。然而，重要的是要认识到心率的下降是渐进的。可以选择不同的对齐选项，例如将窗口在每个节拍上居中或在每个节拍上启动窗口等，具体取决于您的技术偏好。无论选择哪种对齐方式，在解释数据时都必须牢记这一点，因为它会影响对心率变化的感知。
使用GetHeartRate.m函数复制此步骤。

C.可以执行的分析/量化摘要

1.全球平均水平。
原因：全局比较一般条件（例如物种、环境）之间的特定读数。
方法：执行长时间记录，预处理数据，并获得每个人的平均值。
统计：取决于所比较的特征（图 12）。
a.如果这些值来自在不同时间点（例如在病理发展期间）或在不同条件下（饱腹与进食）重复测量的单个组：重复测量单向测试+事后测试。
b.如果这些值来自同一组但不同的队列（例如测试不同的药物）：单向测试+事后测试。
c.如果这些值来自多个组（例如野生型与具有特定敲除基因的小鼠）：单向测试+事后测试。
d.如果这些值来自在不同时间点记录的多个组（例如，比较接受治疗的小鼠与对照小鼠在不同周的模型发育情况）：重复测量双向测试+事后测试。
e.如果这些值来自接受不同治疗的多个组，每个组进行一种治疗：双向测试 + 事后测试。
解释：取决于测试。
注意：对于所有这些情况，一个重要的方面是正确告知统计软件有关匹配条件的信息。测试的确切选择取决于组的数量以及是否满足某些条件（例如正态性、同方差性），这超出了当前协议的范围。解释也是如此：考虑主要影响/相互作用（当可用时）以及何时解释它们，以及事后比较。

图 12. 典型的数据持有者表。 ( i )可以在t个条件或每个时间点下记录n组（整个表，灰色轮廓），允许使用双向测试。 ( ii) 如果在单一条件下记录了 n 个组（黄色轮廓），或( iii) 如果在 t 个条件下记录了单个组，则需要进行单向测试。如果同一个人经历不同的条件，则情况（ i ）和（ iii）都需要考虑重复。

2.平均整个痕迹。
原因：观察记录过程中信号的演变，可能是在两组/条件之间。
如何：执行长时间记录，预处理数据，并根据匹配条件获得平均曲线。
统计：如果统计分析要匹配曲线（仍然只能显示为示例/描述性数据），时间需要成为维度之一，这实际上将所有统计数据更改为重复测量测试。然后事后测试可以了解显着不同的特定时间段（组内或组间）。适用与上述相同的原则，但这次可能涉及更多因素，这可能导致三向分析和/或按条件子选择数据并对有意义的因素子集进行统计测试。或者，可以使用组匹配拟合和相关统计比较。
3.周围刺激时间直方图 (PSTH)。
原因：观察同步事件（刺激、行为等）周围发生的变化，可能发生在两组/条件之间。
如何：执行记录，通过围绕事件对齐数据来预处理数据，并从匹配条件中获取平均曲线。
注意：数据可以标准化，通常通过减去平均值并除以标准差（可选）（得到基线的 z 分数）来标准化为基线。然而，考虑基线本身是否表现出内在差异至关重要，因为这可能会掩盖或在标准化期间引入人为效应（有关更多详细信息和示例，请参阅 D 节）。
量化/统计：
a.一种方法是将 PSTH 视为平均整体迹线并执行 RM 分析。
b.另一种方法是直接通过配对测试来比较经期前后。
c.最后，在有意义的情况下可以使用更有针对性的分析。例如，可以在特定时间窗口中提取单个峰值或谷值，并且可以对这些单独的每只小鼠的值进行组比较。
注意：在构建 PSTH 时，特别是在曲线上呈现数据离散度（使用标准误差或平均值的标准误差）并选择/报告统计数据时，平均和计数的精确方法是决定性的，应透明记录。
在特定情况下，汇集所有动物的所有事件是合理的，但本质上会减少明显的数据分散，同时增加统计显着性。此外，每只小鼠的事件数量可能会根据实验设计或量化方法而有所不同，特别是当同步事件涉及行为时。因此，仅依赖全球平均值可能会使研究结果偏向于特定小鼠。建议获得每个实验单位（一个记录和/或一只动物）的平均值，用作 PSTH 和统计数据。在适当的情况下，事件总数的范围仍然可以被提及为平均数±偏差。

D.解释数据

除了典型的统计结果解释之外，对上述分析的直接解释不应构成任何重大挑战。然而，选择方法和数据子选择需要仔细考虑。
对于基于事件引起的变化的研究，很容易只关注 PSTH 分析；相反，对于比较各组的研究，将 A 组的平均心率与 B 组的平均心率进行比较似乎很简单，依此类推。然而，在进行任何量化或进一步分析之前，全面查看心率曲线通常很有用。为了说明这种方法的重要性和好处，我们在下面提供了一些关键原则和潜在混淆或在盲分析期间可能被忽视的见解的示例（图 13中的示例，表 1 中总结），然后讨论其基础并进行概括并给出有关如何探索新数据集的一般指导。
注意：这些示例主要围绕与行为不动相关的心率变化，因为它是生成从中选择它们的数据集的研究的中心焦点。尽管如此，基本原则和关键要点应该具有相关性并适用于各种条件。

图 13. 心率值的状态依赖性。 A. 单个小鼠在第二个恐惧调节日过程中的代表性心率轨迹。顶部的黑线表示不动发作，垂直虚线表示复合条件刺激 (CS)，垂直黑线表示美国演示。 (1) 首先，可以解释为心率变异性 (HRV) 随着时间的推移而增加，但 (2) 心率波动与不动行为密切相关。 (3) 记录开始时心率缓慢上升，这可能是由于环境重新暴露导致的恐惧。此外，虽然在例如（1）期间可以达到与早期阶段（3）期间类似的值，但它们不太可能具有相同的机械基础。 B. n = 33 只小鼠在调节第 2 天期间的平均心率。(1) 看起来似乎仅在 CS 阶段出现峰值，(2) 其间的基线水平。虽然这无可否认地捕获了平均现象，但它并不反映单个鼠标曲线（例如，A.中），其中似乎在有限的高值和低值之间存在切换。 (3) 这种理论最大值（上限）被表示在平均曲线上。 C. 旷场记录中 n = 25 只小鼠的平均心率曲线。 (1) 与调节第 2 天类似的早期增加 [B. (3)]可见。这表明这种增加与调节本身无关。 D.基于 B (3) 中的理论最大值的去趋势心率允许更稳健和忠实的解释：(1) 在 CS 和电击的后半段期间，心率在 CS 和峰值之间下降。 (2) 这也导致早期上升正常化，从而防止对绝对心率值的错误解释。与 B (3) 相比，它还使小鼠之间的值均质化，其变异性非常低。

表格1 。心率特征的潜在观察及其直接和调整解释的示例
观察直接解释仔细看看调整后的解释
A(1)HRV高恐惧调节会增加 HRVA(2)这里的HRV实际上反映了与心率下降相关的不动发作恐惧调节条件增加了不动的可能性
A(1) HRV 随着时间的推移而增加随着时间的推移，恐惧调节会增加 HRV在记录过程中，与不动相关的心率下降幅度会增加记录过程中的一些潜在过程会全局影响心率变化的幅度（刚性）。这并非特定于威胁暴露，但威胁暴露改变了这种现象的严重程度
A(3)、B(3) HR 在记录开始时增加重新暴露于调节环境会增加心率C(1) 在其他情况下，心率在录音开始时增加记录过程中的某些因素导致心率过早增加
B(1) 在 CS/US 配对期间 HR 增加，但 B(2) 在两者之间保持恒定水平CS/US 增加 HRD(1)、A(1) 在 CS/US 配对之外频繁出现的不动发作期间，HR 会降低，而在 CS/US 配对的后半段则 HR 会增加心率变化反映了不动概率的变化以及刚性的变化

这几点强调了几个关键原则：
1.国家依赖性
通常，特别是在人类研究中，以恒定值来讨论心率并比较不同年龄、健身水平和健康状况的个体的一般指标。然而，很明显，心率是一个高度动态的参数，受到一系列生物过程和环境因素的影响，在不同的时间尺度上运行。昼夜节律调节心率，运动时心率会增加以满足身体的需求，最重要的是，情绪会极大地影响心率。因此，当考虑这些平均值时，通常暗示它们对应于在同等且某种程度上受控的情况下获得的静息心率。同样，在小鼠研究中，只要比较值之间的条件保持一致，单次记录就应该产生有效的个体平均值。然而，对于小鼠来说，只要条件发生最微小的变化，解释就会很快变得微妙。在避免过度决定论的同时，目标是在一个承认可访问因素的框架内开展工作，从而实现平衡的解释和可靠的结论。
a.行为
行为是小鼠心率值的关键决定因素。例如，进入或离开防御性不动回合（通常称为冻结）会导致心率快速而剧烈的变化。饲养会导致心率短暂增加，许多其他行为可能与心率波动有关。有趣的是，与运动相关的心率增加常常在许多典型的记录条件下被掩盖（参见 B 部分）。一般来说，最明显的心率变化可以追溯到行为变化。
一般来说，最显着的短期心率变化可归因于行为改变。即使在相同的行为中，心脏反应也可能取决于内在特性，例如行为发作的持续时间（例如，不动发作持续时间与心率降低幅度正相关）。
• 在长时间内进行平均时，所得平均心率可能在很大程度上取决于某些行为的比例（例如，如果鼠标表现出多次不动，则平均值会较低）及其各自的特征，这些特征可能受到不同因素的影响。
• 通过比较类似行为期间的心率值，甚至考虑特定的行为特征，可以增强结果的分析能力和意义。

→ 调查个体行为是否与一致的、时间锁定的心率变化相关（即，一次行为发作会导致刻板的心率变化）。
→ 探索是否存在富含某些行为的时间段，从而表现出整体较高或较低的心率。
→ 通过相应地匹配行为和时期，将这些因素纳入分析中。

b.语境
弥漫性威胁水平及其产生的焦虑会影响平均心率值（即使是匹配的行为； Signoret-Genest 等人，2023）。这对于整个范式（例如，开放场地与小竞技场）以及某些范式的特定区域内（例如，高架十字迷宫中的闭臂与张开臂）都是如此。这种对分散威胁的感知是由固有的物种特异性进化反应（例如，开放空间与捕食风险增加相关）形成的，并且可能受到其他因素（例如先前历史或个体特征）的影响。
令人惊讶的是，环境威胁的程度也会影响与相同行为相关的心率变化的幅度：在高威胁环境中，与不动相关的心动过缓会减少。
值得注意的是，标准记录程序引起的基线威胁水平/刺激足以掩盖与运动相关的心率增加，因为基线已经升高（Andreev- Andrievskiy等人，2014）。
在极端情况下，在不同的环境中呈现相同的刺激可能会引起相反的心率反应（另请参见 Signoret-Genest 等人，2023）。
• 如果进行两次不同的记录来比较两个条件（例如，两种药物）但两个区域差异太大，则可能反映的是该区域的影响而不是治疗的影响。
•当对以与不同威胁级别相关的区域的范式记录的会话进行平均时，在每个区域花费的时间将影响所得到的平均值。
• 同样，考虑背景的潜在影响可以通过控制其否则引起的变异性来提高统计功效，这本身也构成了有意义的结果。

→ 分析时考虑这些因素（确保背景/区域匹配，评估背景/区域的独立影响）。

c.不同时间尺度的心率调节
与行为相关的心率变化在行为事件的时间尺度上发生——范围从几分之一秒到几十秒。当子区域存在差异时，上下文效果可能会扩展到整个记录或记录中的特定时段。此外，如所提供的示例所示，可能会出现较慢的过程（由于记录过程而导致心率增加以及心脏反应幅度逐渐增强）。
→ 同样，建议在分析中考虑这些因素，寻找不同尺度的模式和相关性。以这种方式分解信号可以减轻这些因素对数据及其综合表征的影响。
d.历史/个人特征
例如，让老鼠暴露在恐惧条件下，可能会导致随后的焦虑水平升高。除了可观察到的行为变化和相关的直接心率变化之外，人们还可以预见心率模式也会随之发生变化。较早时间点的代谢挑战也可能对心脏反应产生持久影响，并且可以合理地预期各种其他具有生物学意义的状态会诱导或调节心率的变化（例如，饱足状态与进食状态）。在特定研究领域考虑这些因素至关重要，因为它们有可能显着影响结果。
→ 在某些情况下，进行纵向分析并识别进入会话的小鼠的个性（除了明显的治疗差异）可以通过引入有助于阐明变异性的复杂程度来提供有价值的见解。
e.先前存在的状态
基线也是不可忽视的变异性来源，通常隐藏在精细方法细节中。在开始记录/程序之前让小鼠适应与否可能会导致重大差异，甚至导致心率反应反转。但即使在较小规模的事件水平上，例如个体行为发作或刺激的呈现，小鼠的预状态也是随后心脏变化的关键决定因素。在某些情况下，心率的相关切换是进入或退出特定行为，在这种情况下，分别从一种行为转换到另一种行为并不重要。
→ 有时值得考虑从一种状态过渡到另一种状态，而不是简单地进入/退出一种状态（例如，一种行为）。
→ 由此推论，信号与基线的标准化是一把双刃剑，因为基线在事件和/或条件之间可能不是同质的，并且本身具有内在含义。例如，如果某种行为与整体心率下降相关，但一次发作发生在心率已经很低的状态下，则心率可能不会进一步下降。当最相关的信息是心率（仍然）较低时，通过基线进行归一化看起来好像没有变化。
f.相互作用
不同的方面可能会相互作用，如果不加以理清，可能会产生矛盾的结果。例如，如果在一个非常特定的时间点发生某种心率变化，并且如果小鼠碰巧在同一时间段内概率上处于特定区域，则区域效应可以调节其他非因果相关的心率变化。
→ 作为最后一步，应将不同的元素拼凑在一起。

2.伞形术语和语义
试图过早地将观察结果“放入盒子中”可能会出现问题，因为它会导致数据探索和解释出现偏差，而这些数据探索和解释会受到更高层次的概念和语义的偏见，并脱离低层次的数据描述。
一个典型的例子是 HRV，它是一种广泛用于研究人类心率的指标，使其成为考虑翻译的小鼠研究的潜在有价值的工具。然而，值得注意的是 HRV 包含广泛的分析。虽然描述性和比较结果可用于诊断和揭示隐藏状态，但该领域面临着缺乏坚实的机械基础和理解的挑战。这可能会使生物学解释有些不稳定，特别是随着 HRV 的日益普及有时会导致不以事实为依据的过度解释。
大多数 HRV 分析依赖于长时间记录，每次读数都会产生一个值。所谓的时域分析直接研究节拍间隔。连续差分均方根 (RMSSD) 是最常用的方法之一（Shaffer 等人，2014）。然而，由于这些与心跳间隔密切相关，因此它们本质上与小时间尺度的心率变化密切相关。因此，对于步骤 D1 中提到的点，应该控制更大的时间尺度，特别是在小鼠中。
基于频率的 HRV 分析着眼于心率信号中某些频段的表示（即，心率信号在某些节律下振荡的程度）。虽然它们有时提供有用的生物标志物，但它们的生物学基础尚不清楚，也没有明确的共识。我们最近对信号进行了频率分析，以量化宏观、可见的振荡：相当于人类的迈耶波，假设这种振荡源自压力反射环。因为它们的振幅受到与其他一些更简单的心率变化（增加/减少）类似的影响，所以它为我们的假设提供了双向验证——与压力反射曲线调整相关的潜在机制限制了心脏率变化。

HRV 分析的最后一种类型是：非线性分析，它表明心率本质上是分形的（它在不同尺度上重复模式）。虽然显示出诊断的希望，但它缺乏生物学可解释性。

→ 我们建议使用 HRV 分析时考虑到对人类的可转化性，或者对心率中无法用其他方式解释的非常明显的振荡模式进行表征和量化，因为否则许多变化可能会无意中与 HRV 混淆。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
西尼奥雷-吉内斯特等人。（2023）。对威胁的综合心脏行为反应定义了防御状态。自然神经科学（所有数字）。
我们随当前协议提供一个小数据集，允许访问原始心电图数据的示例以及相应的预处理和分析程序。此外，我们还提供可应用于任何测试和实验步骤的开放访问代码。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.我们选择使用 6 针Omnetics连接器，因为它们的尺寸和重量最小，可以将心电图记录与需要将额外元件固定到头骨上的技术结合起来，而且因为我们偶尔可能需要额外的通道。这些连接器具有高端品质，可提供完美的连接，但会增加每只鼠标的成本，即使它们可以在适当保养的情况下重复使用（参见 C 部分）。可以使用更简单的三针连接器来代替；一般程序和重要提示保持不变。
2.由于电线脆弱，制造跳线最初可能会带来挑战。在选择电缆型号方面，所选择的参考价格相对昂贵，但具有两个显着优势：a) 非常薄且重量轻，b) 它具有屏蔽功能，使其适合在无法避免噪音（或只是处理通常的环境噪音）。另一方面，这是以相当脆弱为代价的。考虑到这些点，如果看起来更有利，可以决定改用更便宜/更可靠的参考。
3.就植入电极的数量而言，此处描述的心电图植入是侵入性最小的，并且可以在几周内提供最稳定的记录。它可以实现准确、稳健的心跳检测，从而实现可靠的心率提取。然而，通过此处提出的设置和部件，可以轻松地将其扩展到四个通道，以适合可能需要对心跳本身（波）进行更深入分析的应用程序。由于电缆已经制成可以从两个以上通道馈送前置放大器信号，因此只需将另外两根电线焊接到连接器上，并将四个所得电极植入鼠标上的所需位置。那么最好只记录每个通道的直接输出，并离线处理特定的心电图推导。

故障排除

问题1：心电信号不可见
可能原因#1 ：噪音太大，无法查看心电图。
解决方案#1 ：请参阅问题 2。
可能原因#2 ：放大器参数或布线等出现问题。
解决方案#2 ：请参阅程序中的 D 部分。
可能原因#3 ：植入出现问题。
解决方案#3 ：评估手术质量（如果需要进行尸检），以了解可能出了什么问题。
可能原因#4：连接器准备或电缆完整性出现问题。
解决方案#4：检查电缆是否有短路或缺少连接，并在植入之前检查任何新连接器（确保焊接质量良好，并且每个引脚都连接到其相应电线的末端）。

问题2：信号有噪声
可能原因#1 ：信号和记录系统正常，但没有心电图，因此基线看起来好像只有噪声。
解决方案#1 ：排除无心电图故障（植入问题、电缆/连接器问题）。
可能原因#2 ：放大器参数有问题。
解决方案#2 ：请参阅程序中的 D 部分。
可能的原因#3 ：系统正在拾取噪声，特别是环境“嗡嗡声”（来自交流供电设备的噪声）。屏蔽电缆可以减少电生理记录中常见问题的影响，但可能无法完全避免。对于新设置来说，这种情况很可能发生。检查记录频谱图中的 50 Hz（或 60 Hz，具体取决于电网特性）和谐波。
解决方案#3：系统需要接地，以消除或至少减少噪音。关于如何将系统接地有一般原则，但没有独特的解决方案。如果没有任何效果，最好联系放大器公司的支持人员（在此设置的情况下为 NPI）。

问题 3：信号有时看起来不错，但一些尖锐的伪影导致其余录音无法使用
首先，评估它是发生在单个人身上还是发生在所有人身上。
如果这种情况发生在一个人身上：
可能原因#1 ：一根或多根电线未正确固定（不再）。这很可能是由于手术过程中出现的问题造成的。电线可能稍微太短，导致一些张力，最终导致它们移开，或者肌肉上的缝线不理想，或者尖端的胶球不够大/不够稳定，或者混合了有几个因素。
解决方案#1 ：一旦实施该技术并且实验者有足够的经验，这些特殊问题应该会变得很少。在大多数情况下，似乎最好解决上游的问题元素（例如，电线足够长，缝合正确），而不是诉诸第二次手术来尝试修复问题，这甚至可能是不可能的。
可能的原因#2 ：与原因#1 类似，但单根电线受到影响。
解决方案#2 ：更改设置以禁用差分记录并检查每根电线的单独信号。如果环境相对无噪声，则差分记录不是强制性的，并且可能是差分信号看起来很糟糕，因为一根线有问题，而来自另一根线的单通道信号看起来很好。
可能原因#3：电极拾取大量肌肉信号（肌电图、EMG），这些信号在记录中通常看起来像突发信号。它们在某些动物中存在不同程度，但当它们的幅度大于心电图的幅度时，就会出现问题。
解决方案#3：该特定动物被植入到次优位置和/或电极剥离太多或不够；它无法解决，但可以作为以后植入的反馈。
如果所有人都发生这种情况：
可能原因#1 ：头到头台电缆接触到某些东西。
解决方案#1 ：确保电缆尽可能悬挂在场地中央，并且除了通过滑轮支撑电缆的线之外，不接触任何其他物体。
可能原因#2 ：电缆损坏。所使用的电缆是理想的，因为它具有屏蔽且重量轻，但它也很脆弱。一不留神导致鼠标抓住并咬住电缆，可能会导致一些咬痕，根据损坏的部位，可能会产生各种影响：
- 破坏屏蔽可能会让一些环境噪音通过。
- 破坏单根电线的绝缘层有时会导致它们接触其他电线或屏蔽护套，从而在电缆上运动时产生伪影。
- 如果单根电线被部分切断，它可能会间歇性断开。
请注意，过度用力弯曲电缆或在同一位置反复弯曲电缆也会导致不可见的损坏，并产生类似的后果。
解决方案#2 ：检查电缆上是否有咬痕并评估损坏的严重程度。在没有外部损坏的情况下，仔细触摸电缆的整个长度，以找到绝缘层内部潜在的破损处。
如果没有时间再制作一根电缆（实验正在进行中，不能推迟），使用胶带紧紧包裹电缆可以将电线固定一段时间，这提供了一个临时解决方案。无论如何，电缆都需要更换；明智的做法是始终准备好第二根电缆，以防万一。
作为更一般的修复：可以改进设置，以便不容易抓住电缆（需要时有足够的张力拉动电缆并防止其悬挂得太低）并确保实验者密切关注正在发生的情况，以便他可以在需要时进行干预。
可能的原因#3 ：存在一些相当缓慢且有些周期性的漂移，但过滤的设置方式使其在某些转折点期间看起来像伪影。
解决方案 #3 ：检查问题 3。
可能原因#4：电极拾取大量肌肉信号（肌电图、EMG），这些信号在记录中通常看起来像突发信号（图 14 ）。如果这种情况或多或少系统地发生，而不是轶事，并且不限于非常小幅度的突发（理论上，如果幅度小于心跳信号，它应该是可行的，但仍然表示系统性问题），则可能有两件事：检查：
解决方案#4a：植入位置不是最佳的，必须重新调整。
解决方案#4b：电极材料可能不具有理想的特性。尝试使用此处提供的参考，或者至少更改当前使用的参考。

图 14. 肌电图 (EMG) 信号造成的心电图 (ECG) 污染。代表性的原始心电图迹线（仅由放大器在线过滤），显示心跳信号和肌电图污染（看起来像较厚的基线噪声，例如，在 t = 218 秒时突出）。在这种情况下，振幅小于心电图信号，但在某些记录中，肌电图信号可能会妨碍心电图分析。

问题4：信号有时看起来不错，但叠加了一些缓慢的振荡
可能原因：录音与其他设备结合，屏蔽损坏或不足。
我们在两个不同的案例中遇到了这样的问题，这可以帮助理解其他人：

ECG 电缆与数据传输电缆捆绑在一起，用于不同类型的记录。
在我们的案例中，我们将心电图电缆与小型头戴式显微镜（微型显微镜）的电缆捆绑在一起。该显微镜依靠湿透镜来实现对感兴趣区域的聚焦，并且可以在多个焦深之间快速切换。这需要用不同的电流重塑湿透镜，当焦点保持时，这些电流会导致特定的偏移。
解决方案#1：我们采用了当前的屏蔽电缆，它可以很好地防止所有噪声污染。如果污染再次出现，则表明屏蔽层已损坏。

将动物置于电磁场中。
对于其他一些实验，我们需要提供电磁刺激。刺激范围为 10 至 50Hz，占空比为 50%。在每个脉冲处，心电图上都可以看到双相偏转（先上升然后下降）。
解决方案#1：屏蔽电缆不足以防止噪声污染，因为整个对象都受到它的轰炸。然而，我们能够记录驱动刺激的电流脉冲以检索它们的时间。这使我们能够通过查看每次刺激开始/偏移时的信号来确定并拟合噪声模型。将模型拟合到每个刺激，然后减去估计的噪声并检索几乎干净的心电图信号，然后可以像往常一样进行预处理。理论上，这可以扩展到遵循可辨别模式的不同类型的噪声污染。或者，在某些条件下，可以将参考线植入更靠近其他电极的位置，这样噪声会更相似，因此只是被减去。

问题五：头帽脱落
可能原因#1 ：头骨上的帽子表面不够。
解决方案#1 ：去除更大的一块皮肤以构建更大的头帽。
可能原因#2 ：胶水涂在湿的头骨上。
解决方案#2 ：在添加胶水之前将骨头干燥。有时骨头本身会发生一些轻微的出血；不要使用骨蜡，因为它会降低胶水的粘合力，而是用钝器轻轻刮擦出血区域（考虑使用合适的鲁吉恩）。
可能原因#3 ：头骨表面刮擦不够。
解决方案＃3 ：在干骨头上，毫不犹豫地用手术刀刀片的背面画出非常清晰的网格图案。这对于牢固固定头盖至关重要。

致谢

我们感谢 Giorgio Rizzi 博士在我们第一次遇到 ECG 信号交叉污染时就电缆参考进行的讨论和宝贵建议，并感谢 NPI Electronics 的 Jens Looser 提供的初步帮助和建议。
我们感谢 J. Deckert（维尔茨堡大学医院心理健康中心）对该项目（JSG）的支持。这项工作得到了 Deutsche Forschungsgemeinschaft [海森堡教授职位和 PT 项目资金：(TO 1124/1,2,3), TRR 295: (446022135), (446270539)] 的支持，并获得了欧盟 Horizon 2020 研究和项目的资助根据 Marie Skłodowska - Curie 赠款协议第 956414 号（给 PT）的创新计划。它得到了 NARSAD 大脑和行为基金会青年研究员资助给 PT 的支持

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

所有动物程序均得到当地兽医当局和动物实验伦理委员会的批准（ Regierung von Unterfranken ，授权2532-2-509）。遵循 ARRIVE 指南（动物研究：体内实验报告）。

参考

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