材料与试剂

生物材料

1.可平板冷冻保存的原代人肝细胞（Lonza，目录号：HUCPG）
2.小鼠3T3-J2成纤维细胞（ Kerafast ，目录号：EF3003）
3.雌性裸鼠，8-10 周（Taconic Biosciences，目录号：NCRNU）

试剂

组织培养所需试剂
1.来自牛血浆的纤维蛋白原（Millipore Sigma，目录号：F8630）
2.来自牛血浆的凝血酶（Millipore Sigma，目录号：T4648）
3.AggreWell TM 400 微孔板（STEMCELL Technologies，目录号：34411）
4.DMEM，高葡萄糖，丙酮酸盐（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11995065）
5.胎牛血清 (FBS)，优质精选，热灭活（R&D Systems，目录号：S11550H）
6.青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
7.Corning TM ITS+ 预混通用培养补充剂（Fisher Scientific，目录号：CB-40352）
8.HEPES（1 M）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）
9.地塞米松（Millipore Sigma，目录号：D4902）
10.胰高血糖素（Millipore Sigma，目录号：G2044）
11.聚凝胺，10 mg/mL，液体（EMD Millipore，目录号：TR-1003-G）
12.康宁TM HepGo TM肝细胞培养基（Fisher Scientific，目录号：MT454670）
13.在人白蛋白启动子下表达萤火虫荧光素酶的慢病毒载体 ( pTRIP.Alb.IVSb.IRES .tagRFP -DEST)（来自纽约洛克菲勒大学 Charles Rice 的礼物）
14.台盼蓝溶液，0.4%，无菌过滤，适用于细胞培养（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）

手术所需试剂
1.异氟烷，3%（体积/体积）（ Covetrus ，目录号：029405）
2.Puralube兽医软膏（Patterson Veterinary，目录号：07-888-2572）
3.聚维酮碘 10%（体积/体积）聚维酮碘溶液（亚马逊，型号：104457）
4.0.25%盐酸布比卡因注射液，2.5 mg/mL（ Covetrus ，目录号：061842）
5.美洛昔康注射液，5 mg/mL（ Covetrus ，目录号：049755）
6.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (10 × ) pH 7.4，不含 RNase，0.9%（重量/体积）（Fisher Scientific，目录号：AM9625）
7.Dietgel回收（ClearH2O，目录号：72-06-5022）
8.D-荧光素钾盐（ GoldBio ，目录号：115144-35-9）

仅限处方药
1.Ethiqa XR（丁丙诺啡）缓释注射混悬液，1.3 mg/mL，C3（ Covetrus ，目录号：072117）

解决方案

1.1 ×磷酸盐缓冲盐水溶液（参见食谱）
2.肝细胞培养基（参见食谱）
3.50 mg/mL 纤维蛋白原溶液（参见配方）
4.200 U/mL 凝血酶溶液（参见配方）
5.15 mg/mL D-荧光素溶液（参见配方）

食谱

1.1 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液
100 mL PBS (10 × ) pH 7.4，不含 RNase，0.9%（重量/体积）
900 mL 蒸馏 H 2 O

2.肝细胞培养基
432 mL DMEM
50 mL 胎牛血清
5 mL 青霉素-链霉素
5 mL ITS 预混通用培养补充剂
7.5 mL HEPES (1 M)
0.4 µg/mL 地塞米松
7 ng/mL 胰高血糖素

3.50 mg/mL 纤维蛋白原溶液
1 g 来自牛血浆的纤维蛋白原
20 mL 的 1 × PBS

4.200 U/mL 凝血酶溶液
1,000 U 牛血浆凝血酶
5 mL 的 1 × PBS

5.15 mg/mL D-荧光素溶液
× PBS中将无菌 D-荧光素粉末重构至浓度为 15 mg/mL 。等分并储存在-20°C。注射前在室温下解冻。

实验室用品

1.CytoOne 35 × 10 mm TC 皿（USA Scientific Inc，目录号：CC76823340）
2.1.7 mL 微量离心管，PP（VWR，目录号：87003-294）
3.M 形折叠纸巾（McKesson，目录号：858231）

设备

组织培养设备
1.CellGard® ES Class II A2型生物安全柜（ NuAire , Inc.，型号：NU-475）
2.Heracell TM 150i CO 2培养箱（ Thermo Fisher Scientific，目录号：50116047）

手术设备
1.双程序回路/麻醉室（ VetEquip Inc.，目录号：921400）
2.VaporGuard活性炭过滤器（ VetEquip Inc.，目录号：NC9270393）
3.Germinator 500，干式灭菌器（Braintree Scientific, Inc.，目录号：GER 5287-120V）
4.凝胶加热垫（Fisher Scientific，目录号：14-370-223）
5.用于清除废弃麻醉蒸气的圆形罩（ Alsident System，目录号：1-7528）
6.手术光源 (Stryker Berchtold Chromophare F 300)
7.不锈钢数字动物秤（Kent Scientific Corporation，目录号：SCL-4000）
8.毛巾巾，无菌，18ʺ × 25ʺ（ Dynarex ，目录号：4410）
9.酒精制剂，中等，2层（ Webcol ，目录号：6818）
10.自封灭菌袋（VWR，目录号：89140-800）
11.PI 聚异戊二烯手术手套，无菌（ Protexis ，目录号：2D72PT80X）
12.透明手术胶带（MD Supplies，目录号：MPR-62201）
13.腹股沟疝修补网 Bard ®平板不可吸收聚丙烯单丝 3 × 6 英寸矩形样式白色无菌（McKesson，目录号：413782）
14.无菌棉头木质涂药棒（Patterson Veterinary，目录号：07-847-3562）
15.1 mL胰岛素注射器（Fisher Scientific，目录号：14-841-31）
16.锋利的手术剪刀（Fine Science Tools，目录号：14002-13）
17.Graefe镊子（Fine Science Tools，目录号：110049-10）
18.扁圆头镊子（Electron Microscopy Sciences，目录号：78333-33A）
19.Colibri 牵开器（Fine Science Tools，目录号：17000-03）
20.止血器（Fine Science Tools，目录号：13008-12）
21.Monocryl（聚卡普隆 25）缝合线（Ethicon，目录号：Y303H）
22.反射伤口夹（7毫米）（Fine Science Tools，目录号：12032-07）
23.反射夹去除钳（World Precision Instruments，目录号：500347）
24.IVIS 光谱 CT 体内成像系统（Perkin Elmer，目录号：128201）

软件和数据集

1.Living Image 3.2 软件（IVIS 成像系统）

程序

第一部分：肝水凝胶的构建

A.人肝细胞和成纤维细胞聚集体的制备

1.按照制造商的说明解冻冷冻保存的人肝细胞。解冻后立即用 0.4% 台盼蓝检查肝细胞活力。 70%–90% 的生存能力是可以接受的。
2.将肝细胞以 1.0 × 10 6 个细胞/mL 与在人白蛋白启动子下表达萤火虫荧光素酶的慢病毒颗粒一起重悬在 1.0 × 10 6 个细胞/mL 的基础 DMEM 培养基中，并在 15 mL 聚丙烯锥形管中放入 4 μg / mL 聚凝胺，放入组织培养箱中放置 1 小时。将锥形管水平放置在培养箱内，每 10 分钟轻轻翻转 5 次，以确保肝细胞和慢病毒颗粒适当混合。
注意：如果垂直放置在培养箱中，肝细胞会快速沉降到管底部，因此将 15 mL 聚丙烯管放在侧面非常重要。避免持续摇晃或翻转，以尽量减少对肝细胞的剪切力和机械应力。
3.×旋转肝细胞 g 10 分钟并弃去上清液。用 10 mL DMEM 清洗细胞并以 50 ×旋转 g 10 分钟。重复此步骤两次，并将细胞重悬于肝细胞培养基中。
× g的速度旋转肝细胞单细胞悬浮液，因为它们对机械应力敏感，这可能会降低活力。
4.在肝细胞培养基中重悬 1.2 × 10 5转导的人肝细胞和 0.6 × 10 5小鼠胚胎成纤维细胞 J2-3T3 细胞。将 1 mL 该细胞悬浮液放入AggreWell微孔板的每个孔中，并在 37 °C、 5% CO 2下培养。每两天更换一次介质。聚集体通常在四天后形成。然而，聚集体的移植是在共培养后 7 天进行的，因为它们比较紧凑并且表现出更好的存活率（图 1）。
注意：肝细胞形成致密聚集体的能力因供体背景而异。然而，无论供体背景如何，以 2:1 的比例与 J2-3T3 细胞铺板肝细胞总是形成聚集体。

图1。共培养 7 天后，肝细胞-成纤维细胞聚集。代表性的 (A) 低 (4 × ) 和 (B) 高 (10 × ) 放大图像描绘了一致的聚集体形成。聚集体的尺寸约为 200 µm。

B.肝水凝胶构建体的制备

1.使用 P1000 移液器吸头从AggreWell微孔板收集肝细胞-成纤维细胞聚集体。用 DMEM 基础介质冲洗孔两次，以确保收集所有聚集体。将收集的聚集体转移至 15 mL 锥形管中，并以 200 ×离心 G 。去除上清液并将肝细胞-成纤维细胞聚集体重悬于 DMEM 基础培养基中。 AggreWell板的每个孔包含 1,200 个肝细胞-成纤维细胞聚集体，每个聚集体包含100 个肝细胞和 50 个成纤维细胞。
注意：与单细胞悬浮液中的肝细胞相比，肝细胞-成纤维细胞聚集体对机械应力不太敏感。因此，共培养 7 天后获得的聚集体可以 200 × g离心。 P1000 和 P200 移液器吸头均具有良好的聚集体耐受性。
2.μ L来制备水凝胶。每个水凝胶含有约 4,800 个聚集体，相当于AggreWell板的四个孔。凝血酶必须作为最后一个成分添加，以引发纤维蛋白凝胶的凝胶化。通过移液快速混合并转移到无菌的不可润湿的封口膜片上以形成肝水凝胶结构的气泡。
注意：避免使用含有胎牛血清的培养基，因为在凝胶混合物中添加凝血酶后，它会阻碍纤维蛋白原的凝胶化。我们使用纤维蛋白，因为它是伤口愈合过程中存在的许多重要的细胞外基质蛋白之一，可提供宿主的结构支持和血管生成反应，以增强移植后肝组织的血管化。
3.将肝水凝胶结构立即放置在无菌网格上（〜尺寸为 5 毫米× 5 毫米）（图 2）。将构建体储存在装有肝细胞培养基的无菌培养皿中，并运输到小鼠设施进行外科手术。

图 2. 移植前的肝水凝胶。肝水凝胶 (A) 制备后和 (B) 移植前的图像，其中将其放置在无菌手术网上（比例尺：1 厘米）。 C. 肝水凝胶的放大图像，显示肝水凝胶内部的聚集体（比例尺：1 毫米）。

第二部分：将肝水凝胶植入肠系膜宫旁脂肪垫

A.术前准备

1.使用前对所有手术器械进行高压灭菌。
2.手术前使用二氧化氯 ( Clidox -S) 或酒精类清洁剂清洁工作空间。准备手术台，为麻醉诱导室、手术工作区、无菌手术器械、设备区域和可调灯提供专用空间。将无菌器械放置在外科医生工作空间的优势手侧，并确保照明充足（图 3）。

图 3.肝水凝胶植入手术的手术台设置。 A. 手术台设置。 (1)烟罩、(2)消毒剂( Clidox -S)喷雾瓶、(3)进气口、(4)定时器、(5)异氟烷蒸发器、(6)聚光灯、(7)显微镜、(8)活性炭吸附过滤器、(9) 麻醉室、(10) 聚维酮碘、(11) 眼药膏、(12) 酒精垫、(13) 棉签、(14) 手术手套、(15) 手术胶带、(16) 毛巾巾、(17) 纸巾、(18) 针头开盖器、重新盖盖器和注射器支架、(19) 热珠灭菌器、(20) 肝水凝胶结构、(21) 药物注射、(22) 伤口夹、(23) 缝合线、 (24)无菌工具，(25)加热垫。 B. 放大手术所需的无菌工具。 (1) Colibri 牵开器、(2) 锯齿状镊子、(3) Graefe 镊子、(4) 手术剪刀、(5) 止血钳、(6) 伤口施夹器和 (7) 伤口夹去除器。 C. 放大查看药品和用品。 (1) 无菌培养皿中的肝水凝胶构建体，其中装有肝细胞培养基和用于注射的注射器 (2) 盐酸布比卡因、(3) Ethiqa XR 和 (4) 美洛昔康。

3.确保罐内有足够的医用氧气以进行手术，并在每个病例前按要求向小动物麻醉系统蒸发器中添加异氟烷。设置麻醉清除机。
4.称量动物并记录体重。根据各动物的体重准备药物剂量。
注意：对于批量手术，在无菌操作区域附近放置玻璃珠灭菌器，并在手术之间将工具尖端插入加热室 15 秒，进行快速干热灭菌。

B.手术过程

注意：该协议的实施需要事先进行手术培训。培训所需的时间取决于外科医生的能力。通过实践，积极主动的研究者可以轻松获得所需的外科专业知识。

1.通过将鼠标放入使用 3%（体积/体积）异氟烷和 1 L/min 氧气流速的诱导室中，使用吸入异氟烷蒸气诱导全身麻醉。
2.通过轻轻捏脚趾确认鼠标已到达麻醉手术平面。用眼药膏润滑双眼，以防止手术期间角膜干燥，将麻醉系统的鼻锥放在动物的鼻子上，并将异氟烷蒸气降低至 2%（体积/体积）。
注意：在整个手术过程中每 15 分钟监测一次麻醉深度，以确保与手术操作和捏脚趾相关的呼吸频率没有变化，以确认没有运动。
3.将鼠标放在仰卧位置的加热垫上，尾巴朝向外科医生，并用手术胶带固定前肢和后肢。将少量 (0.1 mL) 局部麻醉剂（如布比卡因）注入预期切口线附近的组织中，并皮下注射 2 mg/kg 美洛昔康和 3.25 mg/kg Ethiqa XR 用于超前镇痛。
4.通过执行三组 10% 聚维酮碘和 70% 乙醇或 70% 异丙醇交替擦洗来消毒手术部位。用 10% 聚维酮碘涂皮肤，并用无菌手术巾盖在预期切口部位上，切口约为 2 cm 2 。
注意：手术过程中一定要戴上无菌手术手套。
5.使用 Graefe 钳夹住皮肤，切开腹部侧面皮肤和肌肉切口（约 1-2 厘米长）以暴露腹膜。消毒的 Colibri 牵开器用于保持腹膜腔打开（图 4A 和 4B）。
6.使用剪刀剪开腹膜（〜1-2厘米）。识别并暴露宫旁脂肪垫（图 4C 和 4D）。
注意：在穿过腹膜的大血管之间进行切口，以避免造成意外出血。切开过程中要小心，不要损伤腹部器官。
7.小心地将携带肝水凝胶的无菌网放置在宫旁脂肪垫的顶部（图4E）。
8.使用 5-0 Monocryl 缝合线通过缝合四个角将肝水凝胶牢固地夹在宫旁脂肪垫和手术网之间（图 4F）。在手术过程中，用无菌 PBS 冲洗该区域以防止干燥，并使用无菌棉签浸泡任何多余的缓冲液。
注意：尽可能轻柔地处理宫旁脂肪垫，以避免刺穿或撕裂组织。
9.一旦肝水凝胶牢固地缝合到宫旁脂肪垫上，请使用 Graefe 钳轻轻地将脂肪垫返回腹膜腔内（图 4G）。
10.使用可吸收的 5-0 Monocryl 缝合线（图 4H）关闭腹膜并取出牵开器。
11.使用 7 毫米伤口夹闭合皮肤，并用聚维酮碘擦拭手术部位周围的皮肤（图 4I）。

图 4. 用于附着到宫旁脂肪垫的肝水凝胶植入技术的分步视觉描绘。 A. 穿过皮肤切一个小切口（黑色箭头所示）。 B. 放置 Colibri 牵开器以拉伸打开皮肤。通过切口（黑色箭头所示）打开腹膜，以 (C) 定位并 (D) 暴露宫旁脂肪垫。 E. 轻轻展开脂肪垫，为植入做准备。黑色箭头指向携带肝水凝胶的手术网。 F. 将手术网的边缘缝合到脂肪垫上。 G. 使用 Graefe 镊子小心地将脂肪垫放回腹膜腔。 H.通过缝合封闭腹膜开口。 I. 使用伤口夹闭合皮肤。

C.术后程序

1.将鼠标放在加热垫上并进行监测，使其在干净的笼子中恢复，直到它恢复知觉。检查是否恢复正常呼吸模式、正常眨眼反射以及是否开始行走。添加 2-4 个湿润的颗粒饲料以确保小鼠进食。手术后继续间歇性监测小鼠和切口部位的状况至少 30 分钟，并在当天结束前再次监测。小鼠术后应单独饲养在标准实验室条件下，并可随意获取食物和水。
2.填写手术卡上的详细信息并将其附加到鼠标笼上。
3.在接下来的 48 小时内每 12 小时给予美洛昔康（2 mg/kg；皮下注射）。在接下来的 72 小时内每天至少监测小鼠两次。

第三部分。通过生物发光成像验证

1.× PBS中的 250 μL 15 mg/mL D-荧光素腹腔注射到小鼠中。
2.15 分钟后，将小鼠放入含有 2%–3%（体积/体积）异氟醚和 1 L/min 氧气流量（约 5 分钟）的麻醉诱导室中。
3.用眼药膏润滑双眼，以防止成像过程中角膜干燥，并将麻醉小鼠置于 IVIS 光谱 CT 体内成像系统成像室样品台的仰卧位。这个位置有助于获得最高的生物发光信号。
4.使用 Living Image 软件在 IVIS 光谱 CT 体内成像系统上采集图像并量化生物发光信号。通过将发光曝光设置为 60 秒并根据需要增加它来开始图像采集。
注意：生物发光成像最早可以在移植后72 小时进行，然后每周进行一次，以监测肝水凝胶在体内的存活情况。

图 5. 裸鼠移植肝组织的生物发光图像。没有任何肝组织植入物的对照小鼠（左）和有肝组织植入物的小鼠在移植后第 7 天进行成像。

数据分析

IVIS 光谱 CT 活体成像系统获取的生物发光信号可以通过 Living Image 软件进行量化。生物发光的强度对应于工程组织的存活和肝功能。参考史蒂文斯等人。 [4] 或 Baranski 等人。 [5]，具有代表性的生物发光图像。

协议验证

该协议的部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•史蒂文斯等人。 [4]。 InVERT成型用于组织微结构的可扩展控制。《自然通讯》（图 4，面板 e 和 f）。
•巴兰斯基等人。 [5]。血管网络的几何控制可增强工程组织的整合和功能。美国国家科学院院刊（图 4，e 版）。
•史蒂文斯等人。 [6]。在慢性肝病小鼠模型中原位扩增工程化人类肝组织。科学转化医学（图 1，a 和 d 部分）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.所有试剂均为分子生物学级，必须按照制造商的说明进行储存。
2.使用雌性小鼠，因为它们的脂肪垫比雄性更大。
3.确保手术程序得到机构动物护理和使用委员会的批准，并且仅使用可最大限度减少疼痛和痛苦的方法。
4.所有手术器械在使用前均应消毒。
5.每只小鼠的手术大约需要 20-25 分钟。将肝水凝胶结构的所有四个角缝合到脂肪垫上大约需要 5-8 分钟。我们强烈建议在执行此步骤时保持耐心，因为脂肪组织非常脆弱，在缝合时必须格外小心，不要破裂组织。
6.如果切口大于 1-2 厘米，可以使用额外的伤口夹和/或缝合线。
7.手术后必须每天监测小鼠两次至少 72 小时。
8.呼吸困难、呼吸频率降低和/或喘气是手术失败的迹象。

故障排除

1.大血管穿过腹膜，肉眼可见。切开时，避免切穿这些血管，以防止出血过多。然而，如果在切口时意外割伤任何大血管，请使用干燥的无菌棉签止血，然后使用无菌 1× PBS 对该区域进行补水。
2.如果裸鼠没有足够的宫旁脂肪垫或手术网太大而无法正确贴合宫旁脂肪垫，我们建议在缝合前使用无菌剪刀仔细修剪手术网的边缘。
3.如果小鼠需要很长时间才能从麻醉中正常恢复，则手术过程可能比应有的时间要长。皮下管理 200 μL 无菌 PBS。
4.如果鼠标拉下伤口夹，则可能没有正确执行这些夹子。用异氟醚短暂麻醉（3% vol/vol 用于诱导，2% vol/vol 用于维持），用盐水溶液清洗切口部位，并重复伤口夹闭。用10%聚维酮碘溶液消毒。
5.如果有疼痛或痛苦的迹象（即驼背姿势、皱褶毛发、食欲不振、脱水），将小鼠放在热灯下，并皮下和腹膜内注射 1 mL 温热无菌盐水。应给予额外的镇痛剂并提供DietGel Recovery 以快速改善。如果压力迹象持续存在，请咨询指定的兽医。

致谢

这项工作基于我们之前在 Stevens 等人发表的工作。 (2013) [4] 我们感谢 Baranski 等人的工作。 (2013) [5]，作为适应的基线。作者要感谢威尔康奈尔医学院的研究动物资源中心 (RARC)。这项工作部分得到了 NIH 向 Robert E. Schwartz（R01CA234614、2R01AI107301、R01AA027327 和 R01DK121072）、DOD W81XWH-21-1-0978 和 Paul G. Allen 家庭基金会 UWSC13448 的资助。人物是用BioRender.com创建的。

利益争夺

Miromatrix Inc. 和 Lime Therapeutics的科学顾问委员会成员，也是 Alnylam Inc. 的发言人和顾问。其余作者没有需要声明的利益冲突。

道德考虑

进行的所有动物实验程序均经威尔康奈尔医学机构动物护理和使用委员会根据协议 #2023-0020 批准。

参考

1.Starzl, TE、 Groth , CG、Brettschneider, L.、Penn, I.、Fulginiti, VA、Moon, JB、Blanchard, H.、Martin, AJ 和 Porter, KA (1968)。人类肝脏原位同种移植。安.外科医生。 168（3）：392-415。
2.Sinha, S.、Hassan, N. 和 Schwartz, RE (2023)。肝纤维化过程中细胞器应激和细胞器间串扰的变化。肝病学：e0000000000000012。
3.李TT、王ZR、姚WQ、令狐EQ、王FS和石L. (2022)。慢性肝病的干细胞疗法：进展与挑战。干细胞翻译。医学。 11（9）：900-911。
4.Stevens, KR、 Ungrin , MD、Schwartz, RE、Ng, S.、Carvalho, B.、Christine, KS、Chaturvedi, RR、Li, CY、Zandstra, PW、Chen, CS 等人。（2013）。 InVERT成型用于组织微结构的可扩展控制。纳特。交流。 4（1）：1847。
5.Baranski, JD、Chaturvedi, RR、Stevens, KR、 Eyckmans , J.、Carvalho, B.、Solorzano, RD、Yang, MT、Miller, JS、Bhatia, SN、Chen, CS 等人。（2013）。血管网络的几何控制可增强工程组织的整合和功能。过程。国家。阿卡德。科学。美国110(19)：7586–7591。
6. Stevens, KR、Scull, MA、Ramanan, V.、Fortin, CL、Chaturvedi, RR、Knouse, KA、Xiao, JW、Fung, C.、Mirabella, T.、Chen, AX 等。（2017）。在慢性肝病小鼠模型中原位扩增工程化人类肝组织。科学。译。医学。 9（399）：eaah5505。