材料与试剂

1.Cas9-gRNA 表达载体（例如，pX330、PX458、PX459）
2.父修复模板（Dan Foltz 实验室的礼物）
3.BbsI位点克隆 sg 的有义寡核苷酸（5'-CACCG [sgRNA 目标序列]-3'）
4.用于在 BbsI 位点克隆的反义寡核苷酸（5'-AAAC [反向互补 sgRNA 目标序列] C-3'）

生物材料

1.DLD1-TIR1 细胞，结直肠腺癌细胞系（美国马里兰州巴尔的摩约翰·霍普金斯大学 Andrew Holland 赠送）
2.One Shot TM Stbl3 TM化学感受态大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，目录号： C737303）

试剂

1.杜尔贝科改进的伊格尔培养基（DMEM）（康宁，目录号：10-013-CV）
2.青霉素-链霉素 10,000 U/mL（Thermo Fisher Scientific，目录号： 15140122）
3.胰蛋白酶-EDTA，1 × （CORNING，目录号：25-052-CI）
4.磷酸盐缓冲盐水（PBS 1 × ）（CORNING，目录号： 21-040-CV）
5.Effectene转染剂（Qiagen，目录号：301425）
6.二甲亚砜（DMSO）（ Fisher Bio Reagents TM ，目录号： BP231-100）
7.生长素（吲哚-3-乙酸，IAA）（Sigma-Aldrich，目录号：15148-2G）
8.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
9.抗 GFP 小鼠单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号： A-11120）
10.抗Cdt1兔多克隆H-300（Santa Cruz Biotech，目录号： sc-28262 ）
11.抗微管蛋白抗小鼠单克隆DM1A（Santa Cruz Biotech，目录号： sc-32293）
12.HRP 缀合的兔/小鼠抗体（Azure Biosystems，目录号： AC2114 和 AC2115 ）
13.SuperSignal TM West Pico PLUS 化学发光底物（ Ther mo Scientific，目录号：34580）
14.质粒分离试剂盒（Qiagen，目录号： 27104）
15.凝胶提取试剂盒（质粒和 PCR 清理试剂盒）（Qiagen，目录号： 28704）
16.Quick-DNA 微量制备试剂盒（Zymo Research，目录号： D3020）
17.PCR Master Mix（2 × ）试剂（Thermo Scientific，目录号：K0171 ）
18.GeneRuler 1 kb DNA 梯（Thermo Scientific，目录号：SM0311 ）
19.TriTrack DNA 上样染料（6 × ）（Thermo Scientific，目录号：R1161）
20.T4 DNA 连接酶（NEB，目录号： M0202S）
21.用于 T4 DNA 连接酶的 10× 缓冲液（NEB，目录号： B0202S）
22.Bbs1 酶（NEB，目录号：R0539S）
23.溴化乙锭（Bio-Rad，目录号： 161-0433）
24.琼脂糖 HS（D enville Scientific Inc.，目录号： CA3510-8）
25.乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：03620）
26.十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号： BP166-500）
27.Tris-base（ChemCruz，目录号：77-86-1）
28.过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
29.TEMED（GE Healthcare，目录号： 17-1312-01）
30.丙烯酰胺/双丙烯酰胺，30% 溶液（ Sigma-Aldrich ，目录号： A3574）
31.6 × Laemmli SDS 样品缓冲液（Bioland Scientific LLC，目录号：SAB03-01）
32.Pierce IP 裂解缓冲液（Thermo Scientific，目录号：87787）
33.Halt蛋白酶抑制剂（100×）（Thermo Scientific，目录号：87786）
34.冰醋酸（Fisher Chemical，目录号：A38-212）
35.甘氨酸 99%（Thermo Scientific，目录号：A13816.36）
36.氯化钠（NaCl）（Fisher Chemical，目录号：S271-1）
37.氯化镁（ MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：208337-1KG）
38.SOC 培养基（Invitrogen，目录号：15544-034）
39.氨比西林钠盐（Fisher Scientific，目录号：69-52-3）
40.Luria 肉汤基料（Miller's LB 肉汤基料），粉末（Invitrogen，目录号：12795027）
41.LB琼脂（Lennox L Agar），粉末（Invitrogen，目录号：22700025）

解决方案

1.1 M 生长素 (IAA) 溶液 Milli-Q 水
2.50× TAE 缓冲液（参见配方）
3.1% 琼脂糖凝胶（参见配方）
4.SDS-PAGE 10% 分离蛋白凝胶 (5 mL)
5.SDS-PAGE 5% 堆积蛋白凝胶（参见配方）
6.SDS-PAGE 缓冲液（参见配方）
7.100 mg/mL 氨苄西林储备液

食谱

1.50× TAE 缓冲液
试剂数量或体积
Tris碱基242克
醋酸57.1毫升
乙二胺四乙酸100 mL（0.5 M，8.0 pH）
Milli-Q水将体积调节至 1 L
全部的1,000 毫升
注意：制作琼脂糖凝胶和运行凝胶时，用Milli-Q水将 50 × TAE 稀释至 1 × TAE (1:50) 。

2.1% 琼脂糖凝胶 (100 mL)
试剂最终浓度数量或体积
琼脂糖粉1%1克
1 × TAE不适用100毫升
溴化乙锭0.5微克/毫升2–5 µL
全部的100毫升
a.在微波安全烧瓶中，将 1 g 琼脂糖粉末添加到 100 mL 1× TAE 缓冲液中。
b.以 20-30 秒的短暂间隔对烧瓶进行微波加热，在每个间隔之间旋转。将混合物煮沸直至琼脂糖完全溶解且溶液透明。小心不要让溶液过度沸腾和蒸发。
c.让混合物冷却，然后从 10 mg/mL 储备液中添加 5 µL 溴化乙锭，浓度为 0.5 µg/mL。旋转烧瓶进行混合。
d.将溶液倒入浇铸凝胶托盘中并插入井梳。让凝胶在室温 (RT) 下凝固。

3.SDS-PAGE 10% 分离蛋白凝胶 (5 mL)
试剂库存集中度体积
Milli-Q 水不适用1.9毫升
丙烯酰胺混合物30%1.7毫升
Tris碱基1.5 M，8.8 pH1.3毫升
安全数据表10%50微升
APS10%50微升
泰美德不适用2微升
全部的5毫升

4.SDS-PAGE 5% 堆积蛋白凝胶 (2.0 mL)
试剂库存集中度体积
Milli-Q 水不适用1.4毫升
丙烯酰胺混合物30%0.33毫升
Tris碱基1.0 M，pH 6.80.22毫升
安全数据表10%20微升
APS10%20微升
泰美德不适用2微升
全部的2毫升

5.SDS-PAGE 缓冲液
试剂电泳缓冲液（1 × ）传输缓冲区 (1 × )
甘氨酸14.4克2.9克
Tris碱基3.03克5.8克
安全数据表1.0克0.33克
Milli-Q 水1,000 毫升800毫升
甲醇不适用200毫升
全部的1,000 毫升1,000 毫升

实验室用品

1.96、24、12 和 6 微孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：130188）
2.15 mL 锥形 Falcon 管（Fisher Brand，目录号：07-200-886）
3.1.5 mL Eppendorf 管（Fisher Scientific，目录号：02-682-002）
4.BioLite TM细胞培养处理皿，35、60 和 100 mm 培养皿（Thermo Scientific，目录号：130180、130181 和 130182）
5.Whatman TM Uniflo TM无菌 PVDF 注射器过滤器 0.22 µm（Cytiva，目录号：9913-2502）
6.无菌聚苯乙烯一次性血清移液器（Fisher Brand，目录号：13-678-11E）
7.流式细胞仪管，迷你 35 µm（Olympus Plastics，目录号：28-154）
8.无菌玻璃撒布器

设备

1.离心机（Eppendorf，型号：5417C 和 5804R）
2.热循环仪（Eppendorf，型号：GX2）
3.NanoDrop One（Thermo Scientific，型号：Nanodrop One Spectrophotoshot Promo）
4.流式细胞仪（BD-FACS，型号：Melody Cell Sorter）
5.蛋白质印迹开发人员（Azure biosystems，型号：600）
6.琼脂糖凝胶电泳设备（Bio-Rad，型号： Mini-Sub Cell GT ）
7.蛋白质凝胶电泳设备（Bio-Rad，型号：Mini PROTEAN Tetra cell）
8.分光光度计（Vinmax，型号：721-VIS）
9.明场细胞计数器（DeNovix，型号：CellDrop BF PAYG）
10.倒置显微镜配备横河CSU-X1旋转盘、Andor iXon Ultra888 EMCCD相机和60×或100×1.4 NA平场复消色差DIC油浸物镜（尼康，型号：Eclipse TiE）

软件和数据集
1.Broad Institute sgRNA 设计工具（ https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design ）。或者，您可以使用 CHOPCHOP ( http://chopchop.cbu.uib.no/ ) 或 Crispor ( http://crispor.tefor.net/crispor.py )

程序

A.设计引导 RNA (gRNA)

1.从 NCBI 下载您感兴趣的基因的基因组 DNA 序列。在本例中，这是 Cdt1。前往网站 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/81620和 http://useeast.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000167513;r=16:88803789-8880
2.打开全长基因，包括内含子和外显子，并根据 RefSeq（NCBI 数据库）中的位置定位翻译起始位点 (ATG) 和终止位点 (TGA)。
3.对于 N 端标记，选择并复制 ATG 上游约 15 个碱基对和 ATG 下游约 150 个碱基对。该序列窗口将提供选择靠近修饰点的最佳 gRNA 的选项。
4.对于 C 端标记，如前所述，选择并复制 TGA（终止密码子）下游约 15 个碱基对和终止密码子上游约 150 个碱基对。
5.将选定的序列粘贴到 Broad 研究所提供的 Crispor 或/和 CHOPCHOP sgRNA 设计工具中。不要忘记选择合适的生物体基因组，它提供 SG 评分、脱靶和有价值的参数。
6.将 sgRNA 设计的结果下载为 .txt 文件并将其导入电子表格中。
7.审查从设计工具获得的 sgRNA 结果，并优先考虑在 ATG 之后（对于 N 端修饰）或接近终止密码子（对于 C 端修饰）50 个碱基对内切割的指导，优先考虑那些没有或较少关闭的指导-目标。
8.重点关注特定列，例如“切割后的碱基位置（基于 1）”、“sgRNA 目标序列”、“目标排名”和“脱靶排名”，以选择得分较高的指导。
9.选择至少三个高级指南用于克隆到 SG 主干质粒中（表 1）。

表 1. 顶级 sgRNA 评分表
sgRNA #方向sgRNA 剪切位置sgRNA序列sgRNA 上下文序列聚丙烯酰胺顺序估计的正好秩偏离目标排名综合排名
1感觉168GGCCCACCAGACACGTGCTGGCCTGGCCCACCAGACACGTGCTGAGGAGGAGG351
2感觉173ACCAGACCGTGCTGAGGAGGCCCACCAGACACGTGCTGAGGAGGGGCTG格格793
3感觉171CCACCAGACACGTGCTGAGGTGGCCCACCAGACACGTGCTGAGGAGGGGCAGG131511

B.将 Bbs1 位点的 SG 序列克隆到 pX330 载体中以生成 sgRNA 构建体

1.sgRNA 序列的5 '和 3 '末端添加 Bbs1 限制酶突出端。
上游切割：5′ (CACCGG)GTCTTC、3′ (CC)CAGAAG
下游切割：5′ GAAGAC(CT) 3′、3′ CTTCTG(GACAAA) 5′
2.根据目标区域选择 sgRNA 序列：为有义链和反义链订购寡核苷酸，包括 sgRNA 目标序列及其反向互补序列（表 2 和表 3）。
有义寡核苷酸：5′- CACCG [sgRNA 靶序列]-3′
反义寡核苷酸：5′- AAAC [反向互补 sgRNA 目标序列] C -3′
从您选择的公司（例如 IDT）订购寡核苷酸，并将其重悬于高压灭菌的 Milli-Q 水中，最终浓度为 100 µM。
注：使用 NCBI 爆炸特征重新确认了 Cdt1 的 SG 序列，所有三个序列的第一个命中是来自人类的 Cdt1 基因。

表 2. 具有 Bbs1 兼容粘性末端的前 3 个 sgRNA 的引物列表
sgRNA#sgRNA序列带有突出端的 sgRNA
1GGCCCACCAGACACGTGCTG意义 5 ′ CACCGGGCCCACCAGACACGTGCTG 3 ′
反义 3 ′ CCCGGGTGGTCTGTGCACGACCAAA 5′
2ACCAGACCGTGCTGAGGAG感测 5 ′ CACCGACCAGACACGTGCTGAGGAG 3 ′
反义 3 ′ CTGGTCTGTGCACGACTCCTCCAAA 5 ′
3CCACCAGACACGTGCTGAGG意义 5 ′ CACCGCCACCAGACACGTGCTGAGG 3 ′
反义 3 ′ CGGTGGTCTGTGCACGACTCCAAA 5 ′

表 3. 可供订购的包含 Bbs1 兼容粘性末端的前 3 个 sgRNA 的引物列表
sgRNA #sgRNA序列正向和反向引物序列
1GGCCCACCAGACACGTGCTGFP-5 ′ CACCG GGCCCACCAGACACGTGCTG 3 ′
RP-5 ′ AAAC CAGCACGTGTCTGGTGGGCC C 3 ′
2ACCAGACCGTGCTGAGGAGFP-5 ′ CACCG ACCAGACACGTGCTGAGGAG 3 ′
RP-5 ′ AAAC CTCCTCAGCACGTGTCTGGT C 3 ′
3CCACCAGACACGTGCTGAGGFP-5 ′ CACCG CCACCAGACACGTGCTGAGG 3 ′
RP-5 ′ AAAC CCTCAGCACGTGTCTGGTGG C 3 ′

3.订购 CRISPR/Cas9-EGFP sgRNA 载体 (pX330) 并准备克隆。
质粒详细信息： pX330，质粒大小：8,484 bp ( https://www.addgene.org/42230/ )。将8 µg pX330溶解在 16 µL Milli-Q水中，以达到 0.5 µg/µL 的最终浓度。
4.通过 BbsI 酶线性化 pX330 质粒。
Milli-Q水27.00 µL
10 × NE 缓冲液 5 µL
BbsI 酶 2 µL
pX330 主干 16.00 µL (8 µg)
总计 50 µL
5.37°C 孵育 2 小时。
6.65°C 20 分钟灭活酶。
7.凝胶提取试剂盒通过凝胶纯化纯化消化的质粒。
a.准备 1% 琼脂糖凝胶（参见配方）。
b.将 1 µL 梯子与 1 µL 6× 负载染料和 4 µL Milli-Q水混合。将整个体积 (50 µL) 加载到凝胶上。将 2 µL 未切割的 pX330 质粒样品与 0.4 µL 6× 加载染料混合。将整个体积加载到凝胶上。
c.将 2.5 µL BsbI 切割 pX330 质粒样品与 0.5 µL 6× 加载染料混合。将整个体积加载到凝胶上。
d.90 V 运行凝胶 45 分钟。

C.sgRNA 退火和连接

1.准备 gRNA 引物的库存解决方案。
a.Milli-Q水中稀释以达到 0.6 µg/µL 浓度。按 1:100 稀释 gRNA 引物以达到 6 ng/μL 的浓度。
b.反向 gRNA 引物含有 170 µg DNA，并在 200 µL Milli-Q水中进行类似稀释，以达到 0.85 µg/µL 的浓度。按 1:100 稀释反向 gRNA 引物，以达到 8.5 ng/μL 的浓度。
2.在退火缓冲液中准备每对寡核苷酸的退火反应，如表 4 和表 5 所示。

表 4. 退火缓冲液
试剂体积
Milli-Q水45微升
1M HEPES2.5微升
1 M 氯化镁20.5微升
2.5M 氯化钠2微升
全部的50微升

表 5. 退火反应
试剂体积
退火缓冲液48微升
正义寡核苷酸1微升（6 毫克/毫升）
反义寡核苷酸1微升（6 毫克/毫升）
全部的50微升

3.在 PCR 仪中按以下条件运行反应：
a.90°C 4 分钟
b.70℃10分钟
c.以 2 °C/min 的速率从 70 °C 冷却至 37 °C
d.10℃1分钟
e.保持在 4°C
4.如表 6 所示，准备 pX330 和 sgRNA 的连接反应。如表 7 所示，准备不含 sgRNA 的阴性对照。

表 6. 1:2 pX330 ：寡核苷酸连接反应
试剂体积
Milli-Q水4.68微升
10× T4 DNA 连接酶缓冲液 1微升
线性化pX3302.82微升
T4连接酶0.5微升
退火的 sgRNA 寡核苷酸1 µL （0.5893 ng）1:200 稀释
全部的10微升

表7. 阴性对照
试剂体积
Milli-Q水5.68微升
10× T4 DNA 连接酶缓冲液1微升
线性化pX3302.82微升
T4连接酶0.5微升
全部的10微升

5.连接反应在 16°C 下孵育过夜或在 RT 下孵育 2 小时。
6.在 65°C 下热灭活连接反应 10 分钟（可选）。

D.连接质粒 pX330 + gRNA 和载体对照的转化

1.将水浴设置为 42°C。
2.在冰上解冻 Stbl3 细胞 10 分钟。
3.将 3 μL 连接质粒或载体对照添加到 50 μL Stbl3 细胞中。
4.将细菌和 DNA 混合物在冰上孵育 20 分钟。
5.在 42°C 水浴中热激 45 s。
6.将混合物在冰上冷却 2 分钟。
7.将 400 μL SOC 介质添加到混合物中。
8.置于 37°C 振荡培养箱中，以 200 rpm 振荡 1 小时。
9.在 RT 下以 13,000 rpm 旋转管 1 分钟以沉淀。
10.从颗粒中取出 300 μL 介质。将沉淀重新悬浮在剩余体积的介质中。
11.使用灭菌涂布器将 100 μL 细胞铺在 LB + Amp 板上（氨苄青霉素工作浓度 100 μg/mL）。
12.标记板并在 37°C 培养箱中孵育过夜。

E.克隆的筛选

1.检查平板上的菌落形成情况。
2.在新的 LB + Amp 板上，使用记号笔在板的背面绘制 4 × 5 网格。将单个菌落划入网格上自己的位置。
3.将网格板在 37°C 培养箱中孵育过夜。
4.第二天，将网格上生长的 4-5 个菌落接种到 50 mL Falcon 管中的 10 mL LB + Amp 肉汤中，以分离质粒进行测序。
5.将 Falcon 管放入 37°C 摇动培养箱中，以 200 rpm 过夜。
6.第二天，按照制造商的方案使用质粒分离试剂盒（Qiagen）分离质粒。
7.发送质粒样本（表 8）进行测序以确认克隆。

表 8. 测序样品
试剂体积
推定的 pX330候选质粒（20 ng/ μL ）10微升
U6 引物 (10 ng/μL)2微升
全部的12微升

F.将Cdt1基因和AID+YFP标签合成到修复模板载体中

我们在 Cdt1 序列中 Cas9 切割位点的每一侧合成了包含 800 bp（500 至 1 kb 之间）同源区域的 DNA 片段；具有YFP序列的AID被插入到这两个同源臂之间（由Gene Universal合成）。然后，我们使用 KpnI-HindIII 限制性位点（来自美国伊利诺斯州埃文斯顿西北大学 Daniel Foltz 博士的善意礼物）将此产物克隆到载体 HJURP 中。 Cdt1 同源臂内的PAM序列发生突变并用同义密码子替换，但不改变蛋白质序列。

G.转染 sgRNA 克隆的 pX330 质粒和 Cdt1 的修复模板 (HJURP-AID-YFP)

1.在 60 mm 板上含有 1×青霉素-链霉素和 10% FBS 的完整 DMEM 培养基中培养 DLD1-TIR1 细胞。孵育直至转染当天达到 60%–70% 的汇合度。
2.在 Eppendorf 管中，添加含有 Cdt1 sgRNA/Cas9 和 Cdt1 修复模板的每个质粒所需的等摩尔比例 (1 μg)。
3.添加转染试剂盒中的 150 μL EB 缓冲液。
4.添加 8 μL 增强剂。涡旋 1 秒以混合。
5.在 RT 下孵育管 2-5 分钟。
6.添加 25 μL Effectene 转染试剂。涡旋 10 秒。
7.室温孵育 5-10 分钟。
8.将 1 mL 含有 10% FBS 且不含青霉素-链霉素的不完整 DMEM 介质添加到 Eppendorf 管中。通过移液器轻轻混合。
9.取出 60 毫米板中的全部介质。用 1 mL 的不完整介质清洗板。
10.将转染管内容物逐滴添加到细胞中。
11.在 37 °C、5% CO 2下孵育。
12.6 小时后，将 2 mL 不完整介质添加到板中。
13.将板在 37°C、5% CO 2下孵育 24 小时。
14.从板上取出不完整的介质。
15.将 4 mL 的完整介质添加到板中。
16.2下孵育 24–48 小时。
17.汇合后，将细胞放大到 100 mm 板中。
18.转染后五至七天，收获细胞进行分选。

H.收获细胞进行分选

1.从 100 mm 板中生长的细胞收集介质，并用 0.22 μm 过滤器过滤到 15 mL Falcon 管中。这将用于制作条件培养基。
2.在新的 15 mL Falcon 管中，通过将 5 mL 过滤介质与 5 mL 含有 20% FBS 的完整介质相结合来制作条件介质。使用 0.22 μm过滤器过滤条件介质。
3.用 1× PBS 清洗 100 mm 细胞板。
4.添加 1 mL 0.05% 胰蛋白酶并孵育直至细胞分离。
5.添加 9 mL 的完整介质来清洗板并分离细胞。
6.将细胞收集到 15 mL Falcon 管中，并以200× g离心5分钟以沉淀。
7.去除上清液并用 5 mL 1% FBS-1 × PBS 重悬细胞。
8.将细胞以200× g离心 5分钟。
9.去除上清液并从 1 mL 完全培养基开始重悬细胞。
10.进行细胞计数；然后，添加额外的完全培养基，使每毫升有 10 × 10 6 个细胞。
11.在 96 孔板中，每孔添加 100 μL 条件培养基进行单细胞分选。
12.使用荧光激活细胞分选将单个细胞分选到 96 孔板中，流速为 1,000 个事件/秒 (evt/s)。

I.通过共聚焦显微镜、PCR 和蛋白质印迹筛选单克隆系

1.进行 PCR。
a.一旦细胞在 96 孔板中汇合，将细胞接种到 24 孔板中，然后接种到 12 孔板中，最后接种到 6 孔板中，以确保单克隆的充分增殖。
b.一旦细胞在 6 孔板中汇合，胰蛋白酶消化并收集每个克隆的细胞。
c.按照制造商的说明，使用 Quick-DNA Microprep 试剂盒分离每个克隆的基因组 DNA。
d.测量 DNA 浓度并用作 PCR 模板。
e.使用PCR方法设计引物以检查CRISPR-Cas9产生的目标内源基因位点的修饰（图1 ）。

图 1. 通过 PCR 确认纯合和杂合敲入事件的策略。如图所示，内部引物设计用于扩增带有 Cdt1 基因的序列（野生型引物）和带有 Cdt1 基因的 AID-YFP 插入序列（突变型引物 3）。

f.克隆中敲入事件的纯合性和杂合性也将通过 PCR 进行评估。我们从所选公司 (IDT) 订购了用于筛选克隆的定制引物。
g.将引物溶解在Milli-Q水中，如表 9 所示，以达到 100 μM 的浓度。

表 9. 用于确认纯合和杂合克隆的 PCR 反应混合物
试剂体积
PCR 混合 (2 × )10μL（1×）
底漆12.0微升
入门22.0微升
入门32.0微升
基因组DNAX µL （25–50 纳克）
Milli-Q水高达 20 μL
全部的20微升

h.在 PCR 仪中按以下条件运行反应 25 个循环：
95 °C 5 分钟（初始变性）
95 °C 30 s（变性）
55 °C 30 s（退火）
72℃1分钟（延长时间）
72°C 5 分钟（最终延伸）
保持在 4°C
注意：基因组 DNA 体积取决于浓度。退火温度取决于引物TM 。
i.分析凝胶上扩增的 DNA 并检查扩增曲线。对照 DLD-1 基因组 DNA 将产生 0.5 kb 的单条带。对于纯合敲入，单个条带应位于 1 kb，而对于杂合敲入，会在 0.5 kb 和 1 kb 处看到两个条带。
j.为了进一步确认敲入事件，纯化 PCR 产物并对产物进行测序。
k.PCR 阳性克隆可以通过共聚焦显微镜确认 GFP 阳性细胞。
2.PCR 阳性候选菌株的蛋白质印迹分析确定了表达 AID-YFP 标记蛋白的最佳候选菌株。
a.仅在 60 mm 平板中培养 DLD-1 细胞（用于对照）和 AID 阳性纯合克隆，并孵育直至汇合。胰蛋白酶消化细胞并收集在 15 mL 管中。
b.将细胞以 200× g离心 3 分钟以沉淀并弃去上清液。
c.用 100 μL 含有 1 μL 停止蛋白酶抑制剂的 Pierce IP 裂解缓冲液裂解细胞沉淀 100×。保持在冰上。
d.将细胞在冰上孵育 10 分钟。
e.将细胞在 4 °C 下以 18,000× g离心 20 分钟。
f.将上清液收集到新的 Eppendorf 管中并测定浓度。
g.将 6× Laemmli SDS 样品缓冲液添加到等浓度的每个样品中。
h.将样品在 95 °C 下加热 5 分钟。
i.将等体积的样品与预染色的蛋白梯一起加载到 SDS-PAGE 凝胶上（参见配方）。
j.转移到膜上并用 1× PBS 中的 2% BSA 进行封闭。使用一抗 GFP 和抗 Cdt1 抗体进行探针，然后使用二抗 HRP 缀合的抗小鼠或抗兔抗体进行探针。按照制造商的说明使用化学发光底物试剂盒开发印迹，以确认 AID 的整合。
k.通过共聚焦免疫荧光显微镜验证 GFP 阳性细胞克隆，并确认添加 IAA 后 GFP-AID 在这些细胞中被降解。准备 AID 克隆以进行功能表型分析，如 Rahi 等人所进行的。（2023）[12]。

J.AID系统的验证

1.将纯合 GFP 阳性克隆分入 60 mm 板中。 DLD-1 细胞将以类似的方式用于阴性对照。
2.细胞生长 24-48 小时至 60%-70% 汇合后，用 500 μM 生长素 (IAA) 处理细胞所需的持续时间（0、30、60 和 120 分钟）以诱导蛋白质降解。
注意：生长素的使用浓度范围为 50 至 500 μM，如从之前发布的方案中获得的，但这应该针对特定的 AID 敲入细胞系进行优化。最好的使用方法是从最低浓度的生长素开始，以防止潜在的副作用，同时仍然有效地消耗目标蛋白质。治疗持续时间可能会根据 AID 标记蛋白的不同而有所不同，这样蛋白水平就会被耗尽，而不会导致活力丧失。
3.生长素处理后的不同时间点（0、30、60 和 120 分钟）收获细胞。
4.使用抗微管蛋白抗体作为上样对照或其他适当的蛋白质分析技术进行蛋白质印迹以评估蛋白质降解。
可以在冷冻培养基（90% FBS 和 10% DMSO）中制备冷冻克隆储备液并储存在液氮中。

数据分析

分析蛋白质降解动力学并确定 AID 系统控制蛋白质表达的效率。 AID 测定为研究哺乳动物细胞中的蛋白质降解及其调节机制提供了强大的工具。通过适当的优化和控制，该技术可以对蛋白质周转和功能产生有价值的见解。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：Rahi 等人。（2023）。 Ndc80-Cdt1-Ska1 复合体是一个中央加工着丝粒-微管耦合单元。 J 细胞生物学。（图 1，B 版，图 S1，B 版）[12]。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.确保供体质粒/修复模板中的 PAM 序列发生突变。
2.确保所使用的 TIR1+ 哺乳动物细胞 (DLD1/HCT-116/HeLa/293T) 适合要采用的表型或功能表征实验。

故障排除

问题1：杂合克隆和纯合克隆之间的选择。
解决方案：对于纯合选择（双等位基因），请使用两个包含不同选择的供体质粒（例如，一个带有 GFP 的质粒，另一个带有 m-Cherry 的质粒）。插入后可以对单元格进行排序，以确认它们包含两种颜色。

问题2：生长素难以诱导蛋白质降解。
解决方案：优化生长素的浓度，从最低浓度开始，然后增加浓度。

问题3：不添加生长素的自动/渗漏降解。
解决方案：使用仍然能够正确结合生长素 (IAA/5-Ph-IAA) 的 mini-AID (7 kD) 或 AID 突变体 (AID2)。

致谢

这项工作得到了国家普通医学科学研究所 (NIGMS) 授予 D. Varma 的 R01GM135391 拨款的支持，并且源自 Kanemaki 实验室进行的原始工作，该工作已被适当引用。我们对Shashi Kumar Suman（法国斯特拉斯堡斯特拉斯堡大学 IGBMC）在准备这项工作时所提供的帮助表示深深的谢意。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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3.Ashley, GE、Duong, T.、Levenson, MT、Martinez, MAQ、Johnson, LC、Hibshman, JD、Saeger, HN、Palmisano, NJ、Doonan, R.、Martinez-Mendez, R. 等。（2021）。扩展的生长素诱导降解子工具包秀丽隐杆线虫。遗传学217(3)：e1093/遗传学/iyab006。
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