材料与试剂

生物材料

动物
小鼠： Day-0 小鼠幼崽，C57BL/6（品系#000664，通用名 B6）获自杰克逊实验室
病毒： RSA59，鼠β冠状病毒（MHVA59）的同基因重组株[23]

试剂

1.Hank平衡盐溶液（HBSS）（10 ×）（Gibco，目录号：14185-052）
2.磷酸盐缓冲盐水 (PBS) pH 7.4 (10 × )（Gibco，目录号：70011-044）
3.碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（7.5％）（Gibco，目录号：25080-094）
警告： NaHCO 3对皮肤和眼睛有刺激性。佩戴合适的手套、护目镜和防护服。
4.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（粉末）（Gibco，目录号：12100-046）
5.胰蛋白酶 0.25% (1 × )（Gibco，目录号：15050-057）
6.L-谷氨酰胺 200 mM (100 × )（Gibco，目录号：25030-081）
7.0.5% 胰蛋白酶-EDTA (10 × )（Gibco，目录号：15400-054）
注意：组件包含胰蛋白酶可能会产生过敏反应。 EDTA 可能会刺激眼睛和皮肤。使用呼吸系统防护装置以及皮肤和眼睛防护装置。
8.热灭活马血清（产地：新西兰）（Gibco，目录号：26050-070）
9.青霉素-链霉素（Pen-Strep）（Gibco，目录号：15140-122）
10.蒸馏水（Gibco，目录号：15230-147）
11.无菌去离子 H 2 O
12.F12 营养混合物（火腿）培养基（Gibco，目录号：11765-054）
13.热灭活胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10082-147）
14.D-(+)-葡萄糖， Hybri -Max， ≥ 99.5%（Sigma-Aldrich，目录号：G5146）
15.来自牛胰腺的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T9201-5G）
16.来自 Engelberth-holm 群鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：L2020-1MG）
17.MEM非必需氨基酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M7145）
18.HEPES 缓冲液（1 M）（Gibco，目录号：15630-080）
注意：它可能会刺激皮肤、眼睛和上呼吸道。戴防护手套、护目镜和面罩。
19.来自牛胰腺的胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I6634-50MG）
20.聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P7886-100MG）
21.Neurobasal 培养基（NB）（Gibco，目录号：21103-049）
22.来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（Sigma-Aldrich，目录号：D5025-15KU）
警告：吸入可能会导致过敏或哮喘症状或呼吸困难。使用时请穿戴防护服、手套和口罩。不要涡旋，因为 DNase I 很容易发生物理变性。
23.B27 补充剂 50 × （Gibco，目录号：17504-044）
24.氯化镁（MgCl 2 · 6H 2 O）（SISCO Research Laboratories PVT LTD，目录号：1349130）
25.氯化钙（CaCl 2 · 2H 2 O）（SRL，目录号：10035-04-8）
26.L-甲状腺素钠盐五水合物（T4甲状腺素）（Sigma-Aldrich，目录号：T0397-1MG）
27.人载脂铁转铁蛋白（转铁蛋白）（Sigma-Aldrich，目录号：T-4382）
28.二盐酸盐腐胺（Sigma-Aldrich，目录号：P5780-5G）
29.黄体酮（Sigma-Aldrich，目录号：P8783-5G）
30.二氧化硒（Sigma-Aldrich，目录号：325473）
注意：吞咽或吸入有毒。长期或反复接触可能对器官造成损害。对水生生物毒性极大并具有长期持续影响。避免与皮肤，眼睛和衣服接触。使用面罩、安全眼镜、手套和呼吸防护用品。
31.生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B-4501）
32.0.15 M 硼酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：B6768-1KG）
33.99.9%乙醇，无水，分析CSS试剂（常熟松盛精细化学品，目录号：GB678-90）
警告：高度易燃液体可能会导致嗜睡和恶心。
34.氯化钠（NaCl）（SRL，目录号：7647-14-5）
35.氯化钾（ KCl ）（MERCK，目录号：7447-40-7）
36.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（MERCK，目录号：7558-79-4）
37.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（MERCK，目录号：7778-77-0）
38.台盼蓝（0.4%）（Gibco，目录号：15250061）

生长因子
1.神经生长因子（NGF）（Invitrogen，目录号：13257-019）
2.成纤维细胞生长因子（FGF）（R&D System，目录号：133-FB/CF）
3.血小板衍生生长因子（PDGF）（R＆D System，目录号：221-AA）
4.Neurotropin-3（NT3）（ PeproTech ，目录号：450-03-10UG）

免疫荧光试剂
1.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-100ml）
警告：吞食有害。导致皮肤刺激和严重的眼睛损伤。使用皮肤和眼睛保护剂。
2.牛血清白蛋白，用于分子生物学（BSA）（HIMEDIA，目录号：MB083-25G）
注意：原因皮肤和眼睛刺激；可能会引起过敏反应。避免接触皮肤和眼睛，并佩戴呼吸防护装置、手套和护目镜。
3.抗体
针对各种细胞标记物的一抗按照给定比例用 0.1% BSA（由 1% BSA 制备）稀释（表 1）。

表 1. 一抗
抗体名称稀释细胞标记物推荐储存条件
小鼠抗 GFAP（Sigma，目录号：G3893）1:100星形胶质细胞-20℃冰箱保存
兔抗波形蛋白（CST，目录号： D21H3）1:200脑膜成纤维细胞
兔抗 Iba1（SIGMA Wako，目录号：019-19741）1:600小胶质细胞
小鼠抗 NG2（MERCK，目录号： MAB5384-I）1:50原花青素
兔抗 MAP 2（SIGMA，目录号： M3696）1:200神经元
小鼠抗 NFM（SIGMA，目录号： N5389）1:100神经元
小鼠抗 Gal C (H8H9)（自制）1:20成熟少突胶质细胞
小鼠抗A2B5（自制）1:20原花青素
兔抗 Cx43（SIGMA，目录号： C6219）1:1,000间隙连接蛋白

针对小鼠或兔产生的荧光标记二抗按照给定比例稀释在 0.1% BSA（由 1% BSA 制备）中（表 2）。

表 2. 二抗
抗体名称稀释推荐储存条件
驴抗兔 A lexa Fluor 568（ Invitrogen，目录号： A10042）1:1,0004℃保存
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488（Invitrogen，目录号： A11001）1:1,000
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 546（Invitrogen，目录号： A11003）1:1,000

解决方案

1.DMEM 解决方案（参见食谱）
2.星形胶质细胞特异性培养基（参见食谱）
3.汉克斯准备溶液（参见食谱）
4.用于制备溶液的血清（参见配方）
5.1 × PBS （参见食谱）
6.HBSS 解决方案（参见食谱）
7.NB/B27 培养基（参见食谱）
8.少突胶质细胞特异性培养基（参见食谱）
9.神经元特异性培养基（参见食谱）
10.DM 补充剂（参见食谱）
11.T4 甲状腺素（参见食谱）
12.30% 葡萄糖 (1.66 M) （参见食谱）
13.胰岛素（参见食谱）
14.生物素（参见食谱）
15.少突胶质细胞分化培养基（参见食谱）
16.DMEM 减号 (-) （参见食谱）
17.DMEM Plus (+) （参见食谱）
18.HBSS (+) 或 1% 葡萄糖 HBSS 溶液（参见配方）
19.DNase I 溶液（参见配方）
20.胰蛋白酶（参见食谱）
21.聚-D-赖氨酸 (PDL) 涂层（参见配方）
22.洗涤缓冲液（参见配方）
23.封闭血清 (1% BSA) （参见食谱）

食谱

1.DMEM溶液
将 DMEM 粉末溶解在 1 L 双高压灭菌的 Milli Q 水中进行制备；然后，添加NaHCO 3 。请按照下表进行准备。适当混合（以免结块），然后将 pH 值调整至 7.2–7.4。通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。该溶液可在 4 °C下保存长达 1 个月。
成分数量最终浓度推荐储存条件
DMEM粉1 袋13.4克/升4℃
碳酸氢钠33.7克/升44.04毫米室温（20–25 °C）
双高压灭菌 Milli QH 2 O1升不适用室内温度
最终体积1升4℃

2.星形胶质细胞特异性培养基
通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。始终准备新鲜的；该溶液在 4°C 下可保存约 1 个月。
成分数量最终浓度推荐储存条件
胎牛血清10毫升10%（体积/体积）-20℃
笔链球菌1毫升1%（体积比）-20℃
L-谷氨酰胺0.1毫升0.2毫摩尔-20℃
DMEM溶液89.9 毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

3.汉克斯准备溶液
使用前将溶液通过 0.22 µm 滤纸进行灭菌。该溶液可在 4 °C 下保存长达 1-2 周。
成分数量最终浓度推荐储存条件
HBSS (10 × )10毫升10%（体积/体积）4℃
1 M HEPES 缓冲液2.5毫升25毫米4℃
7.5%碳酸氢钠31毫升1%（体积比）4℃
笔链球菌1毫升1%（体积比）-20℃
双高压灭菌 Milli QH 2 O85.5毫升不适用室内温度
最终体积100毫升4℃

4.制备溶液用血清
使用前将溶液通过 0.22 µm 滤纸进行灭菌。该溶液可在 4 °C 下保存长达一周。
成分数量最终浓度推荐储存条件
热灭活胎牛血清10毫升10%（体积/体积）-20℃
非必需氨基酸溶液1毫升1%（体积比）4℃
L-谷氨酰胺1毫升2毫米-20℃
笔链球菌1毫升1%（体积比）-20℃
DMEM87毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

5.1 × PBS
将下列试剂按量溶解于 800 mL 蒸馏水中，调节 pH 至 7.2~7.4；然后定容至 1 L，用 0.22 µm 滤纸过滤除菌。
成分数量最终浓度推荐储存条件
氯化钠8克137毫米室内温度
氯化钾0.2克2.7毫米室内温度
Na 2 HPO 40.24克10毫米室内温度
KH 2 PO 41.44克1.8毫米室内温度
蒸馏水1升不适用室内温度
最终体积1升 4℃

6.HBSS解决方案
100 × Ca 2+ (90 mM)
将1.324 g CaCl 2 · 2H 2 O溶解在100 mL蒸馏水中。

100 ×镁2+ (104.8 毫米)
2.13 g MgCl 2 · 6H 2 O溶解在100 mL蒸馏水中。

2+和 Mg 2+的 HBSS
通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。该溶液在 4 °C 下可保存长达 1-2 个月。
成分数量最终浓度推荐储存条件
HBSS (10 × )10毫升10%（体积/体积）4℃
钙2+ (100 × )1毫升0.9毫米4℃
镁2+ (100 × )1毫升1.05毫米4℃
双高压灭菌 Milli QH 2 O88毫升不适用室内温度
最终体积100毫升1%（体积比）4℃

7.NB/B27 中型
将溶液通过 0.22 µm 滤纸进行灭菌。务必新鲜配制，溶液存放时间不要超过两周。
成分数量最终浓度推荐储存条件
B27 补充剂 50 ×2毫升2%（体积比）4℃
笔链球菌2.5毫升2.5%（体积比）-20℃
L-谷氨酰胺2.5毫升5毫米-20℃
注意93毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

8.少突胶质细胞特异性培养基
务必新鲜准备并根据您的实验计划使用。
关键步骤：不要过滤生长因子。始终添加生长因子在用于实验之前立即将其放入 NB/B27 不完整培养基中，并将生长因子立即放回 -20 °C 冰箱中。
成分数量最终浓度推荐储存条件
PDGF（1微克/毫升）100微升2纳克/毫升-20℃
FGF（10 微克/毫升）50微升10纳克/毫升-20℃
NT3（1微克/毫升）50微升1纳克/毫升-20℃
NB/B27 中型50微升不适用4℃
最终体积50微升4℃

9.神经元特异性介质
始终在实验前准备新鲜的溶液。
关键步骤：不要过滤生长因子。对于少突胶质细胞特异性培养基，应如上所述小心谨慎。
成分数量最终浓度推荐储存条件
NGF（100 微克/毫升）7微升50纳克/毫升-20℃
NB/B27 中型15毫升不适用4℃
最终体积15毫升4℃

10.DM补充剂
使用 0.2 µm 过滤器合并所有成分后，对混合物进行过滤灭菌。将 1 mL 等分试样在 -20 °C 下储存约两个月。
成分数量最终浓度推荐储存条件
转铁蛋白5毫升250 毫克/5 毫升 DMEM-20℃
腐胺5毫升26.85 毫克/5 毫升 DMEM (33.3 毫米)室内温度
黄体酮10毫升3 mg/5 mL [95% EtOH (1.908 mM)]（在 10 mL DMEM 中稀释 25 µL）室内温度
二氧化硒5毫升3.3 mg/10 mL DMEM (2.974 mM)（在 5 mL DMEM 中稀释 40 µL）室内温度
最终体积25毫升-20℃

11.T4甲状腺素
等分并储存在 4°C。
成分数量最终浓度推荐储存条件
T4甲状腺素1毫克22.5微米-20℃
DMEM50毫升不适用4℃
最终体积50毫升4℃

12.30% 葡萄糖 (1.66 M)
将 30 g 葡萄糖溶解在 100 mL 无菌 ddH 2 O中。通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌并储存于 4°C。

13.胰岛素
将提供的胰岛素量混合在 DMEM 中，然后滴加 1 N HCl，直至混浊溶液澄清。过滤对溶液进行灭菌，并在 4°C 下储存 1 mL 等分试样。
成分数量最终浓度推荐储存条件
胰岛素25毫克4.36微米-20℃
DMEM10毫升不适用4℃
1N HCl不适用不适用室内温度
最终体积10毫升4℃

14.生物素
将生物素溶解在双蒸水 (ddH 2 O) 中（100 mL ddH 2 O中含有 5 mg ），制成 204.65 µM 的储备液。然后，按照以下说明制备 40.93 µM 工作液，并通过 0.2 µm 滤纸对溶液进行灭菌；储存于 4°C。
成分数量最终浓度推荐储存条件
生物素20毫升40.93 µM 4℃
DDH2O _ _80毫升不适用室内温度
最终体积100毫升4℃

15.少突胶质细胞分化培养基
混合所有给定的组分并将溶液储存在 4°C 下。
成分数量最终浓度推荐储存条件
T4甲状腺素4毫升0.9微米-20℃
30%葡萄糖2毫升33.4毫米4℃
L-谷氨酰胺2毫升4毫米-20℃
笔链球菌2毫升2%体积比-20℃
胰岛素1毫升4.36微米 4℃
DM补充剂1毫升1%体积比-20℃
生物素200微升81.86 µM 4℃
DMEM94毫升不适用4℃
F12中号94毫升不适用4℃
最终体积200毫升4℃

16.DMEM 减号 (-)
通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。
关键：务必新鲜制备并在 4 °C 下保存不超过 1-2 周。
成分数量最终浓度推荐储存条件
1 M HEPES 缓冲液1毫升10毫米4℃
笔链球菌 (100 × )1毫升1%（体积比）-20℃
非必需氨基酸溶液1毫升1%（体积比）4℃
DMEM97毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

17.DMEM 加 (+)
通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。
关键：新鲜制备并在 4 °C 冰箱中保存不超过 1-2 周。 FBS和HS应先过滤，防止滤纸堵塞。
成分数量最终浓度推荐储存条件
1 M HEPES 缓冲液1毫升10毫米4℃
笔链球菌 (100 × )1毫升1%（体积比）-20℃
非必需氨基酸溶液1毫升1%（体积比）4℃
热灭活胎牛血清5毫升5%（体积/体积）-20℃
热灭活马血清5毫升5%（体积/体积）-20℃
DMEM87毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

18.HBSS (+) 或 1% 葡萄糖 HBSS 溶液
通过 0.22 µm 滤纸对溶液进行灭菌。该溶液在 4 °C 下最多可保存 1 个月。
成分数量最终浓度推荐储存条件
HBSS (1 × )100毫升不适用4℃
葡萄糖1克（重量/体积）55.5毫米室内温度
最终体积100毫升4℃

19.DNA酶I溶液
DNase I 酶可以粉末形式市售。使用前将溶液通过 0.2 µm 滤纸进行灭菌。将溶液等分到 2 mL 管中并储存在 -20 °C。
成分数量最终浓度推荐储存条件
脱氧核糖核酸酶I3毫克0.1毫克/毫升-20℃
1 × PBS30毫升不适用4℃
最终体积30毫升-20℃

20.胰蛋白酶
使用前通过 0.2 µm 过滤器对溶液进行灭菌。将溶液等分在 2 mL 管中，并储存在 -20°C 下。
成分数量最终浓度推荐储存条件
来自牛胰腺的胰蛋白酶 300毫克10毫克/毫升-20℃
1 × PBS30毫升不适用4℃
最终体积30毫升-20℃

21.聚-D-赖氨酸 (PDL) 涂层
将 5 mg PDL 溶解于 100 mL 蒸馏水中，然后加入 400 mL 蒸馏水定容至体积。
将溶液通过 0.2 µm 滤纸进行灭菌。储存于 4°C。
涂层：
每 100 mL 的 PDL 溶液中添加 1 mL 0.15 M 硼酸盐（在 0.15 M NaOH 中，pH 8.4），并在室温下用 PDL 硼酸盐过滤涂层烧瓶至少 2 小时。
吸走塑料上的液体并在 37°C 下干燥过夜。

免疫荧光试剂设置

1.洗涤缓冲液
关键：始终在使用前新鲜制备并储存在 4 °C 下。
成分数量最终浓度推荐储存条件
1 × PBS49毫升不适用4℃
钙2+ (100 × )0.5毫升0.9毫米4℃
镁2+ (100 × )0.5毫升1.04毫米4℃
最终体积50毫升4℃

2.封闭血清（1% BSA）
使用涡旋器充分混合，并将溶液放置一段时间以沉淀泡沫。
关键：不要长时间涡旋，否则会导致溶液产生过多泡沫。
山羊血清也可代替BSA用于制备封闭血清和抗体稀释液。
成分数量最终浓度推荐储存条件
牛血清白蛋白1克1%（重量/体积）4℃
洗涤缓冲液100毫升不适用4℃
最终体积100毫升4℃

实验室用品

1.细胞过滤器（70 和 100 μm ）（Falcon，目录号：352350 和 352360 ）
2.15 mL 离心管（ Tarsons ，目录号：546021）
3.50 mL 离心管（ Tarsons ，目录号：546041）
4.血清移液器（5 mL和10 mL）（ Thermo Scientific Nunc，目录号：170355N和7128）
5.6孔板（Nunc Thermo ，目录号：140675）
6.35 毫米圆盘（Nunc Thermo Scientific，目录号：150460）
7.60 毫米圆盘（Nunc Thermo Scientific，目录号：150288）
8.100 mm 圆盘（Nunc Thermo Scientific，目录号：150350）
9.细菌培养皿（Tarson，目录号：460095）
10.移液器控制器（Gilson，目录号：101300）
11.注射器（Dispo Van，Hindustan 注射器和医疗设备，目录号： 840054SM1）
12.移液器吸头 [Tarson，目录号：521020 (200–1,000 µL)、521010 (2–200 µL)、521000 (0.2–10 µL)]
13.0.22 µm 过滤器（Merck，生命科学，目录号： B20345）
14.4 个室（安装在permanox上）载玻片（Nunc ，目录号： 120075LE 1007）

设备

1.生物安全罩（ Thermo Scientific， Heraguard ，目录号：41237696）
2.离心机（Eppendorf，型号：5702R，目录号：5703YH207703）
3.CO 2培养箱（ Thermo Scientific，型号： Heracell 150i，目录号：G-3168）
4.解剖显微镜（Nikon SMZ 745 型号 C-LEDS，目录号：226763）
5.显微镜（尼康，型号：Eclipse Ts2，目录号：137714）
6.分析天平（Sartorius PRACTUM213-10IN，目录号：S/N 003670729）
7.摇床培养箱（ZHICHENG，目录号：G-1377 ZHWY-103B）
8.带摇床的水浴（Jio Tech，目录号：G-3179）
9.镊子（精细科学工具，目录号： 00649-11）
10.精细镊子（Fine Science Tools，目录号： 11251-33、11252-40、11252-30）

软件和数据集

用于图像处理
1.ImageJ（美国国立卫生研究院）
2.Zen 2010 软件（卡尔蔡司，德国）

程序

实验设计
从第 0 天小鼠幼崽大脑（和脑膜）中分离脑膜成纤维细胞、神经元和各种神经胶质细胞（如星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）表明了当前方案用于机制和转化研究的潜力 [16,17,21, 22]。该协议依赖于从任何小鼠甚至大鼠品系的大脑中精确分离脑膜（富含成纤维细胞）和海马体（富含锥体神经元）。
该方案需要一窝（> 6-8 只幼崽）来收获足够的中枢神经系统驻留细胞。在研究所的动物设施中，饲养了一只 7-9 周大的雄性小鼠和一只 7-9 周大的雌性小鼠。目视确认怀孕后，将雌性小鼠与雄性小鼠分开，并观察它们的幼崽。在第 0 天收集新生幼崽以分离神经胶质细胞和成纤维细胞。小心地将幼崽斩首，并立即将头部放入冰冷的 Hanks 中以制备溶液。在解剖显微镜下，取出颅骨并将完整的脑组织收集在另一个冰冷的汉克斯中用于制备溶液。使用细镊子尽可能多地从脑组织中取出脑膜。然后应使用 5 mL 血清移液器机械切碎组织（参见图解概述面板 C），并使用 DNase I 和胰蛋白酶进行酶消化 30 分钟。
要计算细胞数，请充分混合细胞悬浮液，取出 20 µL 细胞悬浮液放入 Eppendorf 管中，并与台盼蓝染料混合。然后，使用细胞计数器对细胞进行计数。细胞计数完毕后，按照实验要求进行接种。
星形胶质细胞、OPC (P0) 和成纤维细胞可以直接铺板在细胞培养瓶上，而少突胶质细胞 (P1) 和神经元的板需要事先用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被进行实验（参见食谱）。将小胶质细胞直接铺在预涂室载玻片上进行实验。
除神经元外，分离的神经胶质细胞应在制备溶液的血清中保存（参见程序的步骤 45-47 ） 37°C（在 5% CO 2中） 24 小时，然后添加化学成分确定的培养基细胞类型。神经元将在 37 °C（5% CO 2中）下用 DMEM+ 培养基电镀 24 小时，然后更换为化学成分确定的培养基（步骤 31-33）。成纤维细胞可以直接铺板于星形胶质细胞特异性培养基中（步骤 15-16）（参见配方）（图 1）。

图1。显示分离程序实验设计的示意图

试剂和设备的准备（时间〜15分钟）
1.在进行实验之前，请准备好储备溶液（请参阅“配方”部分）。所有必要的试剂应保存在冰上或 4°C 下（例如，用于解冻的 DNase I 和胰蛋白酶）。
2.打开摇床水浴并将其设置为 37°C 进行预热。
3.打开层流罩并在开始程序之前进行 30 分钟的紫外线灭菌。然后，将程序所需的所有物品（离心管、板、移液器吸头、100 mm 板、细胞过滤器等）放入内部后，重复紫外线灭菌 30 分钟。
关键步骤：用 70% (v/v) 乙醇擦拭程序所需的所有解剖工具，然后在层流罩上进行紫外线消毒。
4.将 10–15 mL 的 Hanks 等分到 50 mL 离心管中（对于脑膜，收集在 15 mL 离心管中）并保存在冰上。对于神经元，将 HBSS+ 葡萄糖或 1% 葡萄糖 HBSS 溶液等分到 15 mL 离心管中。

组织收集（时间约 30 分钟）
5.收集第 0 天的幼崽并将其放在惠特曼滤纸中，然后再进行实验。
6.所有神经胶质细胞、脑膜成纤维细胞和神经元的初始程序都相当相同。
7.小心地斩首幼崽并将其头部立即放入冰冷的汉克斯制备溶液中，以有效分离神经胶质细胞。
警告：动物处死必须按照研究所批准的方案进行。
8.在显微镜下观察时，使用一对锯齿状细钳小心地取出皮肤和颅骨，尽量减少对大脑的损伤。
9.取出颅骨后，挖出大脑（图 2A）并将其转移到含有汉克斯制备溶液的新鲜 100 毫米培养皿中。

图 2. 从脑膜中分离脑膜成纤维细胞的详细分步可视化。 A. 从第 0 天的幼鼠身上解剖的脑组织的代表性图像。脑膜完整。 B.将脑膜与大脑分离并单独保存用于成纤维细胞培养。收集脑膜后，取出无脑膜的大脑进行神经胶质细胞和神经元分离（参见图3）。 C. 对脑膜进行机械切碎，然后以 200 × g离心10 分钟。用 HBSS 重悬后，收集的d 细胞沉淀通过 70 µm 细胞滤网过滤，并再次以 200× g离心10 分钟。收集最终的重悬沉淀进行细胞计数，然后根据个别实验要求进行铺板。

脑膜切除（时间约 10 分钟/脑）
10.小心地从大脑中取出脑膜，同时使用超细镊子在解剖显微镜下观察。脑膜可以与脑组织区分开来，因为血管看起来呈红色，而大脑则呈乳白色。
注意：应小心去除脑膜，不要干扰脑组织块，否则隔离海马以进行神经元隔离将很困难。
关键步骤：这是至关重要的一步，因为脑膜去除不充分可能会导致星形胶质细胞培养物中成纤维细胞的交叉污染（因为两种细胞的生长培养基相同）。
11.将脑膜收集在含有 13 mL HBSS 的 15 mL 离心管中。
暂停点：收集的脑膜可立即用于成纤维细胞分离，或可在冰上保存几分钟（约 30-45 分钟）。

脑膜成纤维细胞的分离（时间约 30 分钟）
12.使用 5 mL 血清移液器将收集的脑膜均质化；将其通过 70 μm细胞过滤器。（使用注射器柱塞让细胞通过。）
13.将滤液收集于 15 mL 离心管中，用 HBSS 冲洗过滤器，并在 200× g下离心10 分钟。沉淀物是脑膜细胞。
14.再次添加 HBSS 洗涤细胞，重新悬浮沉淀，通过 70 µm 过滤器过滤，并再次 200× g离心10 分钟。（重复此步骤两次。）
15.洗涤完成后，将沉淀重新悬浮在星形胶质细胞特异性培养基中。
16.将细胞铺板并使其生长 72 小时。我们更喜欢在T75烧瓶中进行培养，但您也可以根据实验要求在T25烧瓶和其他细胞培养板中进行培养。
17.72小时后，在显微镜下观察贴壁细胞。
18.用1× HBSS（也可以使用1× PBS）轻轻清洗，去除未贴壁的细胞和碎片，并添加新鲜培养基。
19.每 2-3 天更换一次培养基，直至汇合。

海马体分离（时间约 20 分钟/脑）
20.在显微镜下观察无脑膜的大脑并去除嗅球和小脑。将这些组织保存在含有汉克斯制备溶液的 50 mL 离心管中，最后分离大脑半球。
21.将大脑半球切成两半，并将海马体从皮质内侧表面切开（参见图3A）。置于冰上含有 13 mL HBSS+ 的 15 mL 离心管中。
注意：海马体是一个神经元密集的区域。海马体的低效隔离可能导致其他神经胶质细胞的污染。
故障排除：海马体在光学显微镜下看起来是半透明的，因此，为了获得更好的可视性，请在培养皿下方使用黑色表面或使用 DMEM-以保持大脑半球，因为它会使周围环境呈红色。
22.分离海马体后，将剩余的脑组织质量收集在您之前收集小脑和嗅球组织的同一个 50 mL 离心管中。
23.这些剩余的组织将用于神经胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞）的分离。

图 3. 神经胶质细胞分离过程的详细分步可视化。 A. 脑膜完整的大脑（之前的步骤如图 2A 和 2B 所示）；去除脑膜（用于成纤维细胞培养），并取出无脑膜的大脑用于主要神经胶质细胞和神经元培养。收集海马区用于神经元分离，而剩余的组织块（分离脑膜和海马后）用于主要神经胶质细胞分离。 B. 将用于神经胶质细胞分离的组织进行机械切碎（海马不会被切碎）。 C. 将神经胶质细胞和海马组织的切碎组织与 DNase I + 胰蛋白酶在 37°C 下在振荡水浴中以 180 rpm 孵育 30 分钟。使用 FBS 对酶消化的组织进行中和，然后在 RT 下以 600 × g离心10 分钟。 D.收集的细胞沉淀，用 Hanks 制备溶液重悬后，通过 70 µm 细胞滤网过滤。根据各个实验要求对最终产量进行计数和铺板。图 3 中未提及酶消化、中和、离心、过滤和细胞铺板程序的步骤号，因为它们会因特定细胞类型而异（请参阅“程序”部分）。

神经元的分离（时间约 30 分钟）
24.取含有 HBSS+ 的 15 mL 离心管以及先前收集的海马组织，并在 4°C 下以 100× g离心5 分钟。
25.弃去上清液，并向管中添加 1 mL 胰蛋白酶和 300 µL DNase I。充分混合并在室温下孵育 15 分钟。
26.添加 3 mL DMEM+ 介质以停止反应（中和酶）。
关键步骤：酶过度消化可能会损坏培养物，因此请勿将其保存时间超过所需时间。
27.g离心5 分钟。
28.弃去上清，加入DMEM+；轻轻地上下吹打，直至形成细胞悬浮液。
29.然后，将细胞悬浮液通过 50 mL 离心管上的 70 µm 细胞过滤器，并用等体积的介质（例如 5 mL 悬浮液/5 mL 介质）冲洗过滤器。
30.使用细胞计数器计数细胞数，并用 DMEM+ 将其稀释至 10 6 个细胞/mL。
31.含有适当数量细胞的PDL/层粘连蛋白包被（参见配方）的组织培养板中。
32.在 37 °C 和 5% CO 2下孵育板。
33.24小时后，将介质更改为神经元特异性介质（参见食谱）并观察神经元的轴突生长。
34.每 2-3 天更换一次培养基。大约 5 天后，神经元就可以进行实验了。

分离大脑驻留神经胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞）（时间：根据细胞类型而变化）
35.取由汉克斯组成的 50 mL 离心管用于制备溶液（5 mL 用于多个大脑）以及剩余的脑组织质量（脑膜和海马分离后）。
关键期：将脑膜（参见步骤 10）与脑实质分离并保持分开，以避免星形胶质细胞培养物中成纤维细胞的交叉污染。
36.使用 5 mL 血清移液器上下移液 10 次以破碎组织（组织切碎）。
37.每个大脑添加 0.25 mL 胰蛋白酶和 0.25 mL DNase I。
38.在 37°C 的振荡水浴中孵育 30 分钟（参见酶消化步骤）。
39.消化后，每个大脑添加 0.25 mL 的 FBS 和 5 mL 的 Hanks 作为准备溶液。
40.使用移液器适当混合并以 600× g离心10 分钟。
41.用温和的真空吸去上清液。
警告：弃上清时请勿搅动沉淀，否则会影响细胞数量。
42.添加 5–10 mL 的 Hanks 作为制备溶液，并再次以 600× g离心10 分钟。
43.再次用温和的真空吸去上清液。
44.添加 5–10 mL 的 Hanks 作为制备溶液，重新悬浮沉淀，并通过 70 µm 细胞过滤器。再次以 600× g离心10 分钟（再重复该步骤一次）。
45.将沉淀重新悬浮在血清中以制备溶液。
46.在细胞计数器中对细胞进行计数，并将细胞置于未包被的组织培养瓶中（通常每个 T-75 瓶有 3 个大脑）。
47.将种子细胞在制备溶液的血清中在 5% CO 2培养箱中于 37°C 下孵育 24 小时。

细胞特异性培养基变化
48.24小时后，用HBSS洗涤细胞加入Ca 2+和 Mg 2+并将星形胶质细胞特异性培养基（参见配方）放入要生长星形胶质细胞的烧瓶中，将少突胶质细胞特异性培养基放入要生长 OPC 的烧瓶中（对于 OPC，请转至步骤 55）。

星形胶质细胞的富集以及从混合胶质细胞中分离小胶质细胞
49.一旦混合的胶质细胞形成汇合的单层，停止添加新鲜培养基 10 天（饥饿），以允许星形胶质细胞和小胶质细胞的差异粘附。饥饿导致小胶质细胞显着生长。在这些文化中，峰值出现在 12-14 天。
50.饥饿完成后，在 37°C 下以 180 rpm 的转速彻底搅拌轨道培养瓶中的培养瓶 45 分钟，以从紧密粘附的星形胶质细胞中去除粘附较少的小胶质细胞。
51.快速去除带有非贴壁细胞的介质并将其收集在 15 mL 管中（转到步骤 54）。

小胶质细胞分离（时间约 10–12 天）
52.将悬浮在培养基中的细胞放入 15 mL 管中，并在 4 °C 下以 300× g离心5 分钟。
53.重悬离心沉淀，用新鲜的星形胶质细胞特异性培养基稀释，使细胞终浓度为8×10 5个细胞/mL；向 4 孔室玻片的每个孔中添加 0.5 mL，或向 6 孔板的每个孔添加 2 mL。

星形胶质细胞富集（时间约 10–12 天）
54.小胶质细胞摇动后，用无菌 PBS 清洗后将烧瓶保持在星形胶质细胞特异性培养基中。对于星形胶质细胞分离，胰蛋白酶消化剩余的粘附单层星形胶质细胞，并将其用作富集的星形胶质细胞培养物以进行进一步实验。

OPC 分离（时间约 2 小时）
55.24小时后（步骤47），用含Ca 2+和Mg 2+的HBBS洗涤去除非贴壁细胞。
56.去除制备培养基血清 24 小时后，将少突胶质细胞特异性培养基（参见配方）添加到细胞中。
57.将这些混合神经胶质培养物维持在少突胶质细胞特异性培养基中直至汇合（大约一周）。
58.OPC 主要生长在混合神经胶质细胞培养物（主要是星形胶质细胞层）的顶部，并且比星形胶质细胞的粘附性相对较差，应通过冲洗方法去除。
59.将脱落的少突胶质细胞接种到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上（参见食谱），并维持在少突胶质细胞特异性培养基中，直到培养物达到 80% 汇合。

OPC 的分化（时间约 7-10 天）
60.OPC 完全汇合后移除介质；然后，用 1× HBSS 和 Ca 2+ Mg 2+清洗 OPC ，并添加少突胶质细胞分化培养基（参见配方）7-10 天。
61.第 7 天后，这些可以用于实验。

数据分析

使用先前描述的协议进行免疫荧光实验 [24]。使用 4% PFA 固定 70%–80% 汇合培养物）。然后，用含有 0.5% Triton X-100 的 PBS 透化细胞，然后用 1% BSA 封闭。将细胞与一抗在 0.1% BSA 溶液中孵育 1 小时，然后使用含Ca 2+和 Mg 2+的 PBS 清洗，然后用二抗在 0.1% BSA 溶液中标记 1 小时（参见配方）。清洗细胞并用 DAPI（ VectaShield ，Vector Laboratories）安装，并使用落射荧光显微镜 [NIKON eclipse Ti2 显微镜和 DS Qi2 设备相机 (TYO)] 或共聚焦显微镜（蔡司共聚焦显微镜 LSM710）进行可视化。使用 ImageJ 和 Zen 2010 软件（Carl Zeiss，德国）处理图像。
脑膜成纤维细胞是最大的分离细胞，在明场显微镜下观察时呈透明状。生长中的小胶质细胞具有短的突起和梭形形状，而星形胶质细胞在培养物中形成单层，具有致密的展开细胞体。分化的少突胶质细胞和OPCs的形态结构存在显着差异； OPC 通常是具有明亮细胞质和短突起的小细胞，而分化的少突胶质细胞是多分支结构。在整个生长阶段，神经细胞表现出多种形态。在早期阶段，它们的分支较少且尺寸较小，但随着时间的推移，它们与其他神经元形成网络。

协议验证

实验验证
从第 0 天小鼠幼崽大脑中分离和富集的原代神经胶质细胞在其整个生长期表现出特征性形态。这些细胞可以通过使用其细胞特异性标记进行免疫标记来进一步表征，以验证其独特性（图 4 和 5）。脑膜成纤维细胞需要星形胶质细胞特异性培养基作为生长培养基。这些细胞在铺板后第 5-7 天左右显示出细长的结构（在所有其他细胞中最大）。这些细胞在明场显微镜下看起来是透明的（图 4A）并表达 III 型中间丝蛋白波形蛋白（图 5A）[16, 25]。

图 4.分离的原代神经胶质细胞和脑膜成纤维细胞的形态学特征。明场图像显示在培养过程中观察到的特定神经胶质细胞和成纤维细胞。 A. 脑膜成纤维细胞（铺板五天后）。 B. 饥饿前的混合神经胶质细胞。 C. 饥饿后。 D、E. 丰富的星形胶质细胞和小胶质细胞。 F，G. 分别在冲洗之前和之后的少突胶质细胞前体细胞。 H.分化的少突胶质细胞。 I. 处于不同发育阶段的神经元（第 2 天至第 10 天）。所有明场图像的比例尺均为 50 µm，图 3E 的比例尺为 20 µm）。

图 5. 分离的原代神经胶质细胞和脑膜成纤维细胞的免疫荧光表征。 A.脑膜成纤维细胞。 B. 星形胶质细胞用波形蛋白（红色）和 GFAP（绿色）标记。星形胶质细胞对 GFAP 和波形蛋白呈双阳性，而脑膜成纤维细胞仅对波形蛋白呈阳性，对 GFAP 呈阴性。 C. 小胶质细胞用 Iba1 标记（红色）。 D. 神经元细胞显示 NFM（绿色）和 MAP2（红色）双阳性。 E、F。OPC 和分化的少突胶质细胞使用 NG2（绿色）和 Gal C+ A2B5-（Gal C 为绿色，A2B5 为红色）进行表征。对于双重免疫染色，使用 Alexa Fluor 488、546 和 568 二抗（参见配方），并用 DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。 A 和 B 中的比例尺为 20 µm，D 和 E 中的比例尺为 50 µm，C 和 F 中的比例尺为 100 µm 。

饥饿后，根据实验要求在星形胶质细胞特异性培养基中铺板星形胶质细胞。星形胶质细胞是星形细胞，其特征是密集展开的细胞体（颜色较深）在铺板后第 10-12 天左右形成单层（图 4B 和 4D）。当混合的胶质细胞完全汇合并遭受饥饿（饥饿促进小胶质细胞生长） [22]10-12天时，在单层上可见小而明亮的小胶质细胞（图4C）。分离后，小胶质细胞应铺在有室载玻片上。这些细胞显示出特征性纺锤形（梭形）形状，具有短突起（图 4E），并且离子钙结合接头分子 1 (Iba1) 蛋白呈阳性（图 5C）[26, 27]。富集的星形胶质细胞的特点是使用抗 GFAP（胶质纤维酸性蛋白）和抗波形蛋白抗体进行双重免疫标记。星形胶质细胞是两种标记物的阳性细胞 [21, 28]（图 5B）。
如前所述，星形胶质细胞和少突胶质细胞仅通过在单独的细胞特异性化学成分确定的培养基中生长而从相同的 CNS 组织中分离出来。 OPC 的特点是具有明亮细胞质的小结构和从中央细胞质出现的两个突起（图 4F 和 4G）。一旦 OPC 分化为成熟的少突胶质细胞，它们就会获得髓鞘形成行为并表现出更多的分支结构；这些分支从中央明亮的细胞质辐射出来（图4H）。 OPC 和分化的少突胶质细胞分别阳性表达蛋白聚糖神经/神经胶质抗原 2 (NG2) [29, 30] 和半乳糖脑苷脂( GalC ) [31]（图 5E 和 5F）。
神经元在铺板后可能需要 1-2 周才能生长。在最初的日子里，这些细胞看起来很小，细胞质明亮，突起很少，但逐渐形成更多分支的结构，网络连接增加（图 4I）。这些神经元的特征是存在神经元特异性标记物神经丝 (NFM) 和微管相关蛋白 2 (MAP 2)（图 5D）[32, 33]。
这些分离程序使我们能够进行大量的下游实验，例如蛋白质定位研究，例如成纤维细胞上的 Connexin 43 定位（图 6A）、蛋白质运输或基因表达（RNA 和蛋白质）研究。之前有许多研究使用这些细胞来了解肝神经营养性 β 冠状病毒（RSA59 病毒：MHVA59 的同基因重组株）的神经胶质细胞趋向性 [10] 以及病毒诱导的原代细胞中蛋白质表达的改变 [16] ，21]。我们的研究结果表明，在 MOI 2 时，RSA59 病毒感染所有神经胶质细胞（图 6B-6E）以及脑膜成纤维细胞（图 6A）。这些受感染的神经胶质细胞可以收获下游 RNA 和蛋白质，然后可以根据每个单独研究的需要进行检查。

文献验证
星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的神经胶质细胞，有助于调节 pH 和 K+ 缓冲，并与其他神经胶质细胞沟通以维持中枢神经系统稳态。神经胶质细胞无法维持这种稳态对于中枢神经系统来说是致命的[1, 34]。星形胶质细胞与多种神经退行性和神经炎症性疾病有关，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症和多发性硬化症。使用当前方案，研究表明，原代星形胶质细胞的鼠冠状病毒（MHVA59）感染通过阻碍星形胶质细胞间隙连接蛋白Cx43的微管运输来改变该蛋白的表达[参见图2和图7（Basu等人，2017 ）] [35] .还发现体内 Cx43 的下调对应于少突胶质细胞间隙连接蛋白 Cx47 的耗竭[参见图 10 和图 11 (Basu et al., 2017)] [21, 35] 。 β-淀粉样蛋白 (Aβ) 肽会阻碍原代星形胶质细胞中功能性间隙连接的活性[参见图 1 (Maulik 等人，2020)] [36] 。相似地， MHV-A59 感染还会降低脑膜成纤维细胞中的 Cx43 表达，导致间隙连接通讯改变 [参见图 5 (Bose et al., 2018)] [16]，这可能会影响血脑屏障的完整性 [16, 37] ]。因此，该过程提供了一个研究血脑屏障完整性和蛋白质定位以及神经胶质细胞和成纤维细胞中蛋白质运输的平台。它还有助于开发针对阿尔茨海默病的靶向疗法，重点关注 Cx43 通道 [16, 36]。原代星形胶质细胞中的 MHV-A59 感染会增加内质网 (ER) 应激，同时下调 ER 驻留伴侣蛋白 Erp29。此外，已证明 4-PBA 治疗可通过增强分子伴侣 Erp29 的表达来减少 ER 应激[参见图 1、2 和 3 (Bose 等人，2023)][38]。这表明当前的隔离程序也可用于理解神经胶质细胞特异性应激反应[38] 。
研究发现，受损的少突胶质细胞谱系与多种神经病理学有关，包括脱髓鞘疾病和代谢疾病 [39, 40]。在原代培养中，小鼠冠状病毒 RSA59（脱髓鞘毒株）和 RSMHV2（非脱髓鞘毒株）以不同方式感染 OPC 和成熟少突胶质细胞。 RSA59 感染两个谱系（OPC 和成熟的少突胶质细胞）；相反，RSMHV2 仅感染 OPCs [参见图 3 和 4 (Kenyon et al., 2015)] [17]。少突胶质细胞谱系有助于神经元的髓鞘形成并增强神经元功能[41]。最近的研究还表明，OPC 是炎症脱髓鞘过程中重要的细胞毒性靶标，参与抗原呈递，并具有免疫学属性[42]。因此，该程序也将有助于通过使用原代少突胶质细胞的体外研究剖析病毒诱导脱髓鞘背后的细胞机制。

图 6. 分离的神经胶质细胞和脑膜成纤维细胞的下游应用。所有神经胶质细胞都被重组鼠冠状病毒 (RSA59) 感染，细胞感染后显示 EGFP 表达（绿色）（图 A-E）。感染的细胞用4% PFA固定并进行免疫荧光实验。 A. Cx43 是一种表面间隙连接形成蛋白（红色），在 RSA59（绿色）感染脑膜成纤维细胞后被内化。 B-D。 RSA59 病毒（绿色）显示出对星形胶质细胞、OPC 和小胶质细胞的趋向性，分别使用细胞特异性标记 GFAP、A2B5 和 Iba1（红色）进行了证实。 E. 共聚焦图像显示 RSA59 病毒（绿色）也具有由神经元特异性标记 NFM（红色）标记的神经元向性。对于双重免疫染色，如前所述使用 Alexa Fluor 488、546 和 568 二抗（参见配方）； DAPI 标记细胞核（蓝色）。 A、B、D 和 E 中的比例尺为 20 µm，C 中的比例尺为 100 µm。

小胶质细胞是大脑驻留的骨髓细胞，执行多种动态功能，例如抗原呈递、吞噬作用和细胞因子生成[43]。用 TNF α 处理的原代星形胶质细胞和小胶质细胞导致两种细胞的差异功能激活[参见图 5（Marek 等人，2008） ]，并证明原代细胞的特异性分离适合差异功能活性分析 [22]。除了它们在大脑中的独特功能外，一些报告还表明，神经元与神经胶质细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞的相互作用可以增强体外髓鞘形成[44]。根据早期报道，胚胎产前大鼠幼仔的海马体 [19, 45] 和神经元培养需要成年大鼠的海马体[46]；然而，通过这种分离程序，可以从出生后第 0 天的幼犬大脑中分离出神经元以及各种中枢神经系统胶质细胞和脑膜成纤维细胞，从而绕过了雌性小鼠的牺牲。原代神经元还被用于研究小鼠β冠状病毒的四种同基因重组株（RSA59PP、RSA59P、RSMHV2PP和RSMHV2 P）的差异感染性[参见图1（ Safiriyu等人，2023）] [20]。
所提出的协议已广泛应用于多项已发表的研究工作（参考文献如下），以便通过 RT-qPCR、蛋白质印迹和 ELISA 进行各种基于细胞和生化实验，包括免疫荧光和基因表达（RNA 和蛋白质）研究。
Bose 等人完成了脑膜成纤维细胞的分离。（2018）[16]； Basu 等人进行了星形胶质细胞的分离。（2016 年和 2017 年）[21, 35]； Kenyon 等人完成了 OPC 和分化少突胶质细胞的分离。（2015）[17]； Marek 等人完成了小胶质细胞的分离。（2008）[22]； Safiriyu等人完成了初级神经元的分离。（2023）[20]。

一般注意事项和故障排除

故障排除（表 3）

表 3.此处列出了故障排除建议
步问题可能的原因可能的解决方案
11脑膜成纤维细胞产量低脑膜切除不当、脑组织污染使用一对锋利的细镊子正确分离脑膜，分开保存以减少星形胶质细胞污染

35星形胶质细胞培养中的成纤维细胞污染脑膜去除不充分尽可能小心地去除脑膜

36脑组织太大切碎不良，剪刀功能减弱切碎时间较长，使用锋利的剪刀

41神经胶质细胞产量低去除细胞沉淀和上清液（含有粘性髓鞘碎片）观察沉淀，小心弃去上清液；如有疑问，重新过滤上清液并再次离心

44网孔堵塞切碎不当会产生较大的组织碎片使用新的 70 µm 细胞过滤器重新过滤

致谢

作者贡献：手稿写有 SKS、MS 和 JDS。图准备 SKS、MS 和 JDS。所有作者都对本文做出了贡献，并阅读并批准了提交的版本。
我们要感谢 CSIR 为 SKS 和 MS 提供研究金。我们还感谢加尔各答 IISER 的中央成像设施和动物设施为我们的实验提供的所有必要支持。我们还要感谢 SERB-POWER 拨款：SPG/20220/000454（促进女性探索性研究机会）计划为 JDS 提供研究资金，以结构化努力增强研究多样性，确保印度女性获得平等机会和权衡机会从事研究和开发活动的科学家。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
该程序已广泛用于先前的几项研究工作：Bose 等人进行了脑膜成纤维细胞的分离。 (2018) [16]，Basu 等人进行了星形胶质细胞的分离。 (2016 和 2017) [21, 35]，Kenyon 等人进行了 OPC 和分化少突胶质细胞的分离。 (2015)，Marek 等人进行了小胶质细胞的分离。 (2008) [22]， Safiriyu等人完成了原代神经元的分离。（2023）[20]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

所有动物实验均得到加尔各答印度科学教育与研究学院 (IISER) 伦理委员会的批准。动物实验严格按照研究所动物伦理委员会的指导方针进行。 IAEC 协议号： IISERK/IAEC/AP/2019/29.01 SL NO-43。

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