材料与试剂

生物材料

1.免疫缺陷裸鼠 Foxn1 nu ，7周龄，雌性，20–25 g（杰克逊实验室，目录号：Nu/J 002019）
2.PS5A1 细胞系，由德克萨斯大学西南医学中心 Robert Bachoo 博士实验室产生（Singh 等人。 , 2017 ;高等人。，2020）
3.73C 细胞系，由德克萨斯大学西南医学中心 Robert Bachoo 博士实验室产生（Singh等，2017；Gao 等， 2020）
4.抗JAM-A 抗体 BV11，由 FIRC 分子肿瘤学基金会研究所的 Monica Giannotta 博士提供

试剂

玻璃器皿清洗试剂
1.盐酸 (HCl) 37% w/w（Fisher Scientific，目录号： 7647-01-0 ）
2.硝酸（HNO 3 ）70% w/w（Fisher Scientific ，目录号： 7697-37-2）

AuNP）试剂合成和抗体偶联
1.三水氯化金 (III) ( HAuCl 4 · 3H 2 O ) （Sigma-Aldrich ，目录号： 520918-1G ）
2.柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich ，目录号： S4641-500G ）
3.对苯二酚（Sigma-Aldrich ，目录号： H9003-100G ）
4.OPSS-PEG-SVA 3400 Da（ Laysan Bio, Inc.，目录号： OPSS-SVA-3400 ）
5.mPEG-硫醇1,000 Da（ Laysan Bio, Inc.，目录号：M-SH-1K ）
6.西蒂瓦 HyClone TM磷酸盐缓冲盐水（PBS）（ Fisher Scientific，目录号： SH3025801）
7.Pierce TM硼酸盐缓冲液（20 × ）（Fisher Scientific，目录号：PI28341）
8.无内毒素超纯水（Sigma-Aldrich，目录号： TMS-011-A ）

细胞培养试剂
1.Gibco TM DMEM 高葡萄糖GlutaMAX TM补充剂（Fisher Scientific，目录号： 10-566-016)
2.Gibco TM DMEM/F-12，不含谷氨酰胺（Fisher Scientific，目录号： 21-331-020 ）
3.Gibco TM Hanks'平衡盐溶液，不含钙，不含镁，不含酚红（HBSS）（Fisher Scientific，目录号： 14-175-095）
4.表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E4127）
5.重组人基本成纤维细胞生长因子（FGF2）（Sigma-Aldrich，目录号：F0291）
6.黄体酮（Sigma-Aldrich，目录号：P6149）
7.Gibco TM B-27 TM补充剂（50 × ），无血清（Fisher Scientific，目录号：17-504-044）
8.Gibco TM胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺 100 × （Fisher Scientific，目录号：51-500-056）
9.Gibco TM胎牛血清（FBS）（Fisher Scientific，目录号：A3160502）
10.Gibco TM青霉素-链霉素（Fisher Scientific，目录号：15-140-122）
11.吉布科TM 干普罗TM Accutase TM细胞解离试剂（Fisher Scientific，目录号：A1110501）
12.Gibco TM胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Fisher Scientific，目录号：25-200-056）

optoBBTB和药物输送试剂
1.0.9% 盐水溶液，无菌（Fisher Scientific，目录号：S5815）
2.异氟烷 USP（ Covetrus ，目录号： NDC 66794-017-25）
3.Cremophor ® EL（Millipore Sigma，目录号：61791-12-6）
4.无水乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP2818100）
5.紫杉醇Janelia Fluor®646 （ Tocris Bioscience，目录号：6266 ）
6.紫杉醇（Sigma-Aldrich，目录号：T7191）
7.丁丙诺啡 SR-LAB 5 mL（1 mg/mL）（ ZooPharm ，目录号：BSRLAB1）

用于组织采集和离体药物递送分析的试剂
1.多聚甲醛，4% 的 PBS 溶液（Fisher Scientific，目录号：AAJ61899AP ）
2.蔗糖（Millipore Sigma，目录号：57-50-1）
3.Hoechst 33342 溶液（Fisher Scientific，目录号：PI62249 ）
4.Scigen Tissue- Plus TM OCT 化合物（Fisher Scientific，目录号：23-730-571）
5.英杰公司 Fluoromount -G TM封固剂（Fisher Scientific，目录号：50-187-88）

解决方案

1.HAuCl 4溶液，1 M（参见配方）
2.HAuCl 4溶液，25 mM（参见配方）
3.柠檬酸钠溶液，112.2 mM（参见配方）
4.柠檬酸钠溶液，15 mM（参见配方）
5.对苯二酚溶液，25 mM（参见配方）
6.2 mM 硼酸盐缓冲储备液，pH = 8.5 （参见食谱）
7.10% 蔗糖储备液（参见配方）
8.20% 蔗糖储备液（参见配方）
9.30% 蔗糖储备液（参见配方）

食谱

1.HAuCl 4溶液，1 M
*注：开瓶后，迅速将HAuCl 4 · 3H 2 O转移至试管中，称重。将储备溶液等分到 0.5 mL Eppendorfs中，并用液氮快速冷冻溶液以供将来使用。库存可以储存在-80 °C。
试剂最终浓度数量或体积
HAuCl 4 · 3H 2 O1M1 克（见注释*）
超纯H 2 O不适用2.539毫升_
总计（可选）不适用不适用

2.HAuCl 4溶液，25 mM
注意：该溶液应新鲜配制。
试剂最终浓度数量或体积
HAuCl 4 (1 M)25毫米0.05毫升
超纯H 2 O不适用1.95毫升
总计（可选）不适用2毫升

3.柠檬酸钠溶液，112.2 mM
注意：该溶液应新鲜配制。
试剂最终浓度数量或体积
柠檬酸钠112.2毫米0.165克
超纯H 2 O不适用5毫升
总计（可选）不适用不适用

4.柠檬酸钠溶液，15 mM
注意：该溶液应新鲜配制。
试剂最终浓度数量或体积
柠檬酸钠15毫米0.022克
超纯H 2 O不适用5毫升
总计（可选）不适用不适用

5.对苯二酚溶液，25 mM
注意：该溶液应新鲜配制。
试剂最终浓度数量或体积
对苯二酚25毫米0.0138克
超纯H 2 O不适用5毫升
总计（可选）不适用不适用

6.2 mM 硼酸盐缓冲储备液，pH = 8.5
试剂最终浓度数量或体积
硼酸盐缓冲液 (20 × )2毫米0.2毫升
超纯H 2 O不适用99.8毫升
总计（可选）不适用100毫升

7.10%蔗糖储备液
*注：PBS 应以 10 mL 的增量添加。在添加更多 PBS 之前，让溶液完全混合。
试剂最终浓度数量或体积
蔗糖10%（重量/体积）10克
PBS（1 × ）不适用看注释*
总计（可选）不适用100毫升

8.20%蔗糖储备液
*注：PBS 应以 10 mL 的增量添加。在添加更多 PBS 之前，让溶液完全混合。
试剂最终浓度数量或体积
蔗糖20%（重量/体积）20克
PBS（1 × ）不适用看注释*
总计（可选）不适用100毫升

9.30% 蔗糖储备液 (100 mL)
*注：PBS 应以 10 mL 的增量添加。在添加更多 PBS 之前，让溶液完全混合。
试剂最终浓度数量或体积
蔗糖30%（重量/体积）30克
PBS（1 × ）不适用看注释*
全部的不适用100毫升

实验室用品

AuNP 合成和抗体偶联用品
1.Fisherbrand TM多边形搅拌棒（ Fisher Scientific，目录号：14-512-127）
2.费希尔布兰德TM Isotemp TM搅拌器（ Fisher Scientific，目录号：S88850200 ）
3.PYREX TM短颈厚壁圆底沸腾烧瓶，标准锥形接头（ Fisher Scientific，目录号：10-068-1C）
4.PYREX TM窄口重型玻璃锥形瓶 250 mL（ Fisher Scientific，目录号：10-040F）
5.DWK Life Sciences Kimble TM KIMAX TM西冷凝器（ Fisher Scientific，目录号：K452000-2430）
6.PYREX TM结晶皿（ Fisher Scientific，目录号：08-741-D ）
7.Fisherbrand TM无菌聚苯乙烯一次性血清移液器，带放大镜条纹 10 mL（ Fisher Scientific，目录号：13-678-11E ）
8.Fisherbrand TM无菌聚苯乙烯一次性血清移液器，带放大镜条纹 50 mL（ Fisher Scientific，目录号：13-678-11F ）
9.Fisherbrand TM优质微量离心管 2.0 mL（Fisher Scientific，目录号： 05-408-138）
10.Fisherbrand TM优质微量离心管 1.5 mL（Fisher Scientific，目录号： 05-408-129）
11.热能科学TM 低蛋白结合微量离心管1.5 mL（ Fisher Scientific，目录号：PI90410 ）
12.热能科学TM Nunc TM 15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（ Fisher Scientific，目录号：12-565-269 ）
13.热能科学TM Nunc TM 50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（ Fisher Scientific，目录号：12-565-271 ）
14.0.22 μm注射器过滤器（VWR，目录号： 76479-030 )
15.用于生物技术级 CE 透析膜管 (1 m) 的Spectrum TM试用装套件，MWCO：20 kd （Fisher Scientific，目录号：08-801-251 ）

AuNP 表征耗材
1.Fisherbrand TM 384 孔聚苯乙烯板（Fisher Scientific，目录号：12-566-625）
2.Fisherbrand TM一次性比色皿（ Fisher Scientific，目录号：14-955-127 ）
3.电子显微镜科学碳支撑膜 5–6 nm 厚，位于方形 200 目铜网格上（ Fisher Scientific，目录号：NC9044609）

细胞培养用品
1.热能科学TM 努克TM EasYFlask TM细胞培养瓶 75 cm 2 （ Fisher Scientific，目录号：12-565-349 ）
2.热能科学TM NunclonTM _ 球体TM 细胞培养瓶75 cm 2 （ Fisher Scientific，目录号：12-566-440 ）

小鼠肿瘤细胞移植用品和optoBBTB
1.微量移液器拉拔器（Sutter Instrument，目录号：Co. P-1000）
2.Instech PE-20 管（ Fisher Scientific，目录号：50-890-048）
3.BD Micro- Fine TM IV 胰岛素注射器（ Fisher Scientific，目录号：14-829-1D ）
4.Med Vet International Exel蝴蝶输液器，带 27 G × 3/4 英寸针头，12 英寸管（ Fisher Scientific，目录号：50-209-2293 ）
5.Puritan TM棉头涂抹器（ Fisher Scientific，目录号：22-029-553 ）
6.Fisherbrand TM无菌酒精准备垫（ Fisher Scientific，目录号：22-363-750 ）
7.World Precision Instrument 小鼠解剖套件（ Fisher Scientific，目录号：50-822-920 ）
8.Henkel Loctite 4014医疗器械瞬间粘合剂透明（Henkel Adhesives，目录号：202152）
9.车身双标准套装（雷诺先进材料）

组织处理和离体药物输送分析用品
1.BD Vacutainer TM偏心尖端注射器（ Fisher Scientific，目录号：B300613 ）
2.费希尔布兰德TM Superfrost TM plus显微镜载玻片（ Fisher Scientific，目录号：12-550-15 ）
3.Fisherbrand TM盖玻片：矩形（ Fisher Scientific，目录号：12-544-18P ）

设备

1.New Era Pump Systems Inc 单通道注射泵（Fisher Scientific，目录号：NC1072839 ）
2.费希尔布兰德TM accSpin TM Micro 17微量离心机（Fisher Scientific，目录号：13-100-675 ）
3.BioTek Synergy 2 多模式读板器（The LabWorld Group，目录号：18531）
4.动态光散射 ( DLS)激光粒度仪nano zs（马尔文帕纳科）
5.电子显微镜（日本电子株式会社，型号：JEM-1400 plus）
6.二极管泵浦高能皮秒 Nd: YAG 激光器（EKSPLA，目录号：PL2230）
7.相干公司® LabMax触摸式功率和能量计（Coherent ® ，目录号：2256258）
8.相干公司® EnergyMax激光能量传感器（Coherent ® ，目录号：1110746）
9.异氟醚蒸发器（Kent Scientific，目录号：VetFlo-1231 ）
10.直流温度控制器系统（FHC，目录号：40-90-8D）
11.直肠热敏电阻探头（FHC，目录号：40-90-5D-02）
12.加热垫（FHC，目录号：40-90-2-07）
13.注射泵控制器（World Precision Instruments，目录号：micro-2T）
14.无刷微电机系统（Osada，目录号：EXL-M40 ）
15.双小动物立体定位仪（KOPF，目录号：902 ）
16.Zeiss Stemi 305显微镜（Zeiss，目录号：STEMI305-TB ）
17.HM525 NX 低温恒温器（ Epredia ，目录号： HM525 NX）
18.虚拟载玻片显微镜（奥林巴斯，型号：VS120）
19.转盘超分辨率显微镜（奥林巴斯，型号：SD-OSR）
20.IVIS ® Lumina 系列 III（PerkinElmer，目录号：CLS136334）

软件和数据集

1.ImageJ（版本 1.53c，2020 年 6 月 27 日）
2.GraphPad Prism（版本 9.5.0，2022 年 12 月 6 日）

程序

A.纳米粒子合成和缀合的一般准备

1.3在化学通风柜中制备新鲜王水。
2.将玻璃器皿、磁力搅拌棒和冷凝器浸泡在王水中至少 30 分钟。
注意：王水处理不当可能会导致重大危险，包括爆炸风险、皮肤灼伤、接触时眼睛损伤、吸入对粘膜和上呼吸道的伤害，以及摄入对内脏器官的潜在伤害。切勿将王水密封在密闭容器中，这一点至关重要，因为产生的气体会导致压力积聚并可能使容器过度加压。使用王水时，适当的个人防护装备 (PPE) 至关重要。
3.在化学通风柜中用微孔过滤水彻底冲洗玻璃器皿和磁力搅拌棒，然后在 2 级 A2 型生物安全柜中用无内毒素超纯水冲洗。
4.为了减少进一步体内实验中纳米颗粒污染的可能性，纳米颗粒的合成是在生物安全柜中进行的，遵循细胞培养过程中通常采用的所有严格预防措施。
关键步骤：为了避免纳米颗粒污染，合成中使用的所有塑料器具都应经过无内毒素认证。本工作中用于纳米颗粒制备的所有溶剂和其他试剂均在生物安全柜内严格打开。所有容器（即锥形瓶和透析容器）应用 70% 乙醇和Millipore 过滤水冲洗，并用一块消毒封口膜适当覆盖。除非另有说明，所有试剂溶液在使用前均在生物安全柜中通过 0.2 μm Millipore 注射器过滤器过滤。

B.15 nm 金种子的合成

1.将 98 mL 无内毒素超纯水添加到 250 mL 玻璃圆底烧瓶中。
2.将 1 mL HAuCl 4溶液 (25 mM) 添加到圆瓶烧瓶中。
3.将溶液回流煮沸并充分搅拌。
关键步骤：彻底有效的混合是实现均匀成核和生长以获得高单分散性纳米颗粒的关键步骤之一。
4.在搅拌的同时添加 1 mL 柠檬酸钠溶液 (112.2 mM)。
关键步骤：应快速添加还原剂以获得均匀的纳米颗粒生长和高的单分散性。
5.将溶液搅拌并煮沸 10 分钟。
6.关闭热量，并在搅拌的同时让系统冷却至室温 (23–25 °C)。所得金纳米粒子应呈现红宝石红色。
7.描述金种子的特征。
a.zetasizer nano zs）测量纳米颗粒尺寸和尺寸分布。测得纳米粒子的流体动力学直径约为17 nm。多分散指数（PDI）约为0.05。
关键步骤：种子的流体动力学直径应为 17-18 nm，具有相对较低的 PDI (<0.1)，以生长具有所需尺寸和质量的较大纳米粒子。
故障排除：如果观察到较大或多分散的纳米颗粒尺寸，请确保在添加还原剂之前将溶液煮沸。确保充分混合。
b.BioTek Synergy 2 读板器记录 UV-Vis-NIR 吸收光谱以进行浓度测量（Haiss等人，2007）。
c.使用透射电子显微镜（JEM-1400 加电子显微镜）测量纳米颗粒的尺寸和形态。纳米粒子的形状应为半球形，直径应约为15 nm。
暂停点：种子可在 4 °C下保存两周。在重新使用种子之前需要进行表征。

C.50 nm AuNP 的种子介导合成

1.将 95 mL 无内毒素超纯水添加到 250 mL锥形瓶中。
2.添加 963 μL HAuCl 4溶液(25 mM)。
3.在室温下搅拌的同时，添加 3.71 mL 准备好的金种子 (2.23 nM )。
关键步骤：对于不同浓度的金种子，使用摩尔计算来确定要添加的当量体积。
4.在充分混合下，快速添加 963 μL柠檬酸钠溶液 (15 mM) 和 963 μL对苯二酚溶液 (25 mM) 。
关键步骤：这两种还原溶液应快速连续添加以获得具有高单分散性的纳米颗粒。
5.搅拌过夜。用一块消毒的封口膜盖住烧瓶，以保护溶液免受污染。
6.表征纳米粒子。
a.zetasizer nano zs）测量纳米颗粒尺寸和尺寸分布。所制备的纳米颗粒的测量流体动力学直径约为 47 nm，PDI < 0.1。
b.BioTek Synergy 2 读板器记录 UV-Vis-NIR 吸收光谱。
c.使用透射电子显微镜（JEM-1400 加电子显微镜）测量纳米颗粒的尺寸和形态。纳米粒子的形状应为球形，直径应约为 50 nm。
故障排除：如果观察到多分散纳米颗粒尺寸，请确保还原剂是新鲜制备的。确保充分混合。
7.浓缩纳米颗粒。
a.将纳米颗粒分配到 2 mL 无内毒素 Eppendorf 中，并在室温下以 1,300 × g离心纳米颗粒30 分钟。
b.丢弃上清液并将纳米颗粒颗粒收集在 2 mL 无内毒素的 Eppendorf 中。
8.浓缩过程后表征纳米颗粒。
a.使用无内毒素的纯水将纳米颗粒稀释 100 倍，并进行 DLS 进行尺寸测量。测得的此类纳米粒子的流体动力学直径约为 50 nm，PDI < 0.1。
故障排除：离心后较大的纳米颗粒尺寸表明在浓缩步骤中发生聚集。确保适当的离心时间和速度。
b.使用稀释的纳米粒子记录紫外-可见-近红外吸收光谱以进行浓度计算。
暂停点：浓缩的纳米颗粒可以在 4 °C下保存两周。在重新使用纳米粒子之前需要进行表征。

D.聚乙二醇-抗体缀合物的制备

1.在冰上解冻 BV11（抗 JAM-A 抗体），在 PBS 中稀释至 0.5 mg/mL，然后在 pH 8.5 至 0.05 mg/ mL 的 2 mM 硼酸盐缓冲液中稀释。
注意：开始实验前，硼酸盐缓冲液和 PBS 应在冰上冷却。抗体溶液应保存在冰上。不要过滤抗体溶液。
2.将 OPSS-PEG-SVA 溶解在 2 mM 硼酸盐缓冲液中，并以 125:1 摩尔比快速添加到抗体溶液中。
注意： OPSS-PEG-SVA 溶液应保存在冰上。
3.将溶液转移至 15 mL Falcon 管中，短暂涡旋，并在冰上摇动 3 小时。
4.通过透析去除未反应的 OPSS-PEG-SVA。
a.用70%乙醇对塑料容器进行消毒，然后用Millipore过滤水冲洗，然后用无内毒素的超纯水冲洗。用 3 L 硼酸盐缓冲液（2 mM，pH 8.5）填充容器。用消毒的封口膜和铝膜覆盖容器。将缓冲器冷却至 4°C。
b.将 20 kDa MWCO 膜浸入硼酸盐缓冲液中至少 30 分钟以激活膜。
c.将抗体-PEG 混合物填充到透析袋中，然后在 4°C 下透析过夜，在温和搅拌下去除游离的 OPSS-PEG-SVA。
关键步骤：为了确保彻底去除游离的OPSS-PEG-SVA，可以在透析3小时后更换硼酸盐缓冲液。

E.AuNPs 与聚乙二醇-抗体缀合物的功能化

1.硫醇化抗体收集在 15 mL Falcon 管中，并将溶液与浓缩 AuNP 以 200:1 摩尔比混合。将纳米颗粒抗体溶液在冰上摇动 1 小时。
2.添加6 PEG/nm 2的mPEG -硫醇溶液 (1,000 Da)以回填 AuNP 的空白空间。将溶液在冰上摇动 1 小时。
3.用冰冷的硼酸盐缓冲液（2 mM，pH 8.5）离心（1,300× g ，30分钟，4°C）纯化所得的AuNP-BV11缀合物。重复该过程三次以去除多余的抗体。
4.使用硼酸盐缓冲液 (2 mM) 将纳米颗粒稀释 500 倍，并通过 DLS 和 UV-Vis-NIR吸收光谱表征纳米颗粒。这些纳米颗粒的测量直径应约为 70 nm，纳米颗粒浓度约为 20 nM。 AuNP 和 AuNP-BV11 的代表性表征如图 1 所示。
暂停点： AuNP-BV11 可在 4 °C 下保存长达两周。

图 1. 金纳米颗粒 ( AuNP)的表征。 (A) 通过透射电子显微镜表征 AuNP 核的形态和尺寸。使用 ImageJ 通过手动计数 100 个颗粒来测量纳米颗粒的尺寸 (50 ± 4 nm)。 (B) AuNP 和 AuNP-BV11 的局域表面等离子体共振峰通过 UV-Vis-NIR 光谱进行表征。 (C) 通过动态光散射表征 AuNP 和 AuNP-BV11 相对强度的流体动力学直径分布。 AuNP 和 AuNP-BV11 的 Z 平均值分别为 49 nm 和 69 nm。使用 GraphPad Prism 软件绘制数据。该数据首次发表于 Cai 等人。（2023）并进行了修改。

F.神经胶质瘤细胞培养

1.胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺的 DMEM/F12 培养基中的自由浮动神经球。移植前两天将胶质瘤细胞传代至70%~80%汇合后使用。
2.在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 高糖培养基中培养 73C 胶质瘤细胞。移植前2天将胶质瘤细胞传代至70%~80%汇合后使用。
3.细胞移植前，分别用细胞解离试剂和胰蛋白酶-EDTA解离PS5A1和73C胶质瘤细胞，并重悬于HBSS中。
4.5 个细胞/ μL的密度。

G.一般术前程序

1.在手术程序开始时和手术之间，用珠消毒器对手术工具（世界精密仪器小鼠解剖套件）进行消毒 15 分钟。
2.用70%乙醇清洁手术台，并用无菌布覆盖，创造放置无菌工具的无菌环境。
关键步骤：在整个手术过程中保持无菌。
3.对于所有程序，用 2%–3% 异氟烷（空气中）麻醉小鼠，并将它们放在 37°C 的加热垫上。
注意：一旦鼠标对疼痛刺激（例如尾巴捏）没有反应，就开始实验。管理不当的异氟烷可能有害；长时间接触可能会对操作员的健康造成不利影响，包括头晕、头痛、呕吐和恶心等症状。为了在手术过程中有效去除多余的异氟烷，必须使用排气系统。
4.用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。

H.胶质瘤细胞移植

1.手术前向小鼠皮下注射丁丙诺啡 (1 mg/kg)。
2.微移液器拉拔器准备具有 50 μ m尖端的玻璃微移液器（图 2A）。将玻璃微移液器与纳米注射器连接，并将注射速度设置为 30 nL /min。
关键步骤：缓慢注射以避免颅内压急剧升高并促进液体扩散。
3.胶质瘤细胞注射：
a.带耳杆的小动物立体定位仪上。用镊子轻轻探测，检查解剖范围下的稳定性。
关键步骤：头骨相对于耳杆不应有任何移动。
b.用酒精准备垫对头皮进行消毒。
c.使用小剪刀在头皮上做一个中线切口。
d.使用无菌棉签去除头骨顶部的膜。
e.在头骨和周围皮肤上涂上一层薄薄的胶水（汉高乐泰 4014 医疗器械瞬间粘合剂透明）。等待 5-10 分钟，让胶水粘合到皮肤和头骨上。
f.使用手持式钻头，在注射部位的头骨上打一个钻孔（图 2B）。
关键步骤：仅使用轻微的动作并避免直接向下施压。每 20-30 秒停止钻孔一次，使用压缩空气去除骨粉。
g.用肿瘤细胞悬浮液填充玻璃微量移液器。将微移液器与毛刺孔对齐（图 2C）。
h.降低微量移液器，直到尖端接触皮质表面，并使用该点作为零。将微移液器降低至所需深度（皮质表面以下 0.5 毫米）。
i.小心地将 368 nL的 PS5A1 神经胶质瘤细胞悬浮液或 92 nL的 73C 神经胶质瘤细胞悬浮液注射到小鼠皮质中。
j.注射后，再休息 2-5 分钟，然后再开始抽出微量移液器。
k.用盒蜡密封毛刺孔，并在头骨上涂上一层身体双层以进行保护（图2D）。
4.在开始实验之前，将小鼠放置三天 (73C) 至两周 (PS5A1)，以允许肿瘤生长。

图 2. 胶质母细胞瘤细胞移植。 (A) 玻璃微量移液器。比例尺代表50 μm 。 (B) 头骨上有钻孔的小鼠。箭头表示毛刺孔的位置。 (C) 神经胶质瘤细胞注射的设置。放大图像显示玻璃微量移液器与毛刺孔的精确对准。 (D)注射后身体双层覆盖在头部的小鼠。

I.optoBBTB的最小皮肤开口和大脑激光刺激

1.PE-20 管静脉注射（尾静脉）AuNP-BV11 到 GEMM（ PS5A1 和 73C GEMM 的生理盐水中分别为18.5 和 37 μg / g），蝶形输液器，带 27G × 3/4 英寸针头。
2.optoBBTB的程序：
a.纳米颗粒注射一小时后，将身体双重剥离以暴露头骨。使用盐水保持头骨湿润。
b.使用最小激光功率 (1%) 将激光束与肿瘤区域对齐。
c.通过肿瘤区域上方的头骨应用一皮秒激光脉冲（532 nm，40 mJ /cm 2 ，6 mm 光束尺寸）（图 3）。

optoBBTB的设置。 (A) optoBBTB皮秒激光器示意图。 (B) 照片捕捉小鼠在optoBBTB过程中接受激光激发。激光器配置为连续模式，以精确对准其位置。

J.optoBBTB效率评估

1.optoBBTB后泰素Janelia Fluor® 646 (Taxol646)输送的荧光成像（图 4A 和 4B，左）：
a.将 Taxol646 溶解在 Cremophor EL:无水乙醇（1:1 v/v，作为载体）的混合器中至 6 mg/mL，然后用盐水稀释至 2 mg/mL。
b.optoBBTB后立即静脉注射荧光 Taxol646 (12.5 mg/kg)。
c.注射后三十分钟，用冰冷的 PBS (20 mL) 灌注小鼠，然后用 4% PFA (20 mL) 灌注。
d.提取大脑并在 4 °C下用 4% PFA (15 mL) 后固定大脑过夜。
e.用 10 mL 的 10%、20% 和 30% 蔗糖使大脑脱水，直到沉到管底部。
关键步骤：在用蔗糖冷冻保存之前，应先用 PFA 很好地固定大脑，因为 10% 以上的蔗糖溶液是高渗的，如果组织未完全固定，会导致水从细胞中流出，导致组织萎缩。
f.将大脑速冻在干冰上。
暂停点：大脑可以用铝箔包裹并储存在-20 °C。
g.将两滴 OCT 放入塑料冷冻模具中。将大脑放在中心并倒 OCT 以嵌入大脑。将模具置于-20 °C 下冷冻。
h.将大脑切成 20 μm厚的切片。
暂停点：载玻片可保存在 -20 °C 的载玻片存储盒中。
i.将脑切片用 Hoechst 染色（PBS 中 1:2,000）在室温下染色 10 分钟，然后用 PBS 冲洗 3 次（每次冲洗 5 分钟）。
j.从载玻片的非样品表面吸去多余的 PBS。
k.在载玻片上缓慢添加 150 μL的安装介质，并用盖玻片盖住载玻片。
关键步骤：添加封固剂时避免产生气泡，并将盖玻片降低到适当的位置。
l.成像前将载玻片在室温下固化至少 1 小时。
2.optoBBTB和紫杉醇 (Taxol) 递送的治疗效率评估（图 4A，中，右）：
a.在 14 dpi 时，将小鼠随机分为四组：（1）载体对照； (2)游离紫杉醇对照(12.5mg/kg)； (3) optoBBTB+车辆； (4) optoBBTB+紫杉醇(12.5毫克/千克)。每组准备五只小鼠。
b.如上所述执行optoBBTB 。
c.optoBBTB后立即向小鼠静脉注射载体或紫杉醇。
d.每四天重复治疗三次。在 42 dpi 处死小鼠。
e.用 PBS 灌注小鼠，提取大脑，并通过荧光成像对肿瘤大小进行成像。
f.为了分析生存率，使用相同的治疗组，每组七只小鼠。根据批准的动物方案，如果荷瘤小鼠出现体重减轻（> 20％）、毛发丧失、癫痫发作或局灶性运动缺陷，则应对其实施安乐死。
3.optoBBTB和紫杉醇 (Taxol) 递送的治疗效率评估（图 4B，中，右）：
a.在 4 dpi 时，将小鼠随机分为四组：（1）载体对照； (2)游离紫杉醇对照(12.5mg/kg)； (3) optoBBTB+车辆； (4) optoBBTB+紫杉醇(12.5毫克/千克)。每组准备五只小鼠。
b.按照描述执行optoBBTB 。
c.optoBBTB后立即向小鼠静脉注射载体或紫杉醇。
d.每四天重复治疗三次。在 15 dpi 处死小鼠。
e.用 PBS 灌注小鼠，提取大脑，并通过荧光成像对肿瘤大小进行成像。
f.为了分析生存率，使用相同的治疗组，每组七只小鼠。根据批准的动物方案，如果荷瘤小鼠出现体重减轻（> 20％）、毛发丧失、癫痫发作或局灶性运动缺陷，则应对其实施安乐死。

图 4. optoBBTB后紫杉醇递送的评估。 (A) 左图： OptoBBTB促进 PS5A1 GEMM 中 Taxol646 的递送。肿瘤由 GFP 荧光（箭头）表示，BBB 开放的特点是 Taxol646 渗漏（星号）。比例尺代表 1 毫米。中：通过 GFP 荧光成像的肿瘤大小。右：Kaplan-Meier 生存分析。每组N = 7 只小鼠。 (B) 左： OptoBBTB促进 Taxol646 在 73C GEMM 中的递送。肿瘤由高密度 Hoechst 染色（箭头）表示，BBB 开口的特点是 Taxol646 渗漏（星号）。比例尺代表 1 毫米。中：通过 GFP 荧光成像的肿瘤大小。右：Kaplan-Meier 生存分析。每组N = 7 只小鼠。使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析。该数据首次发表于 Cai 等人。（2023）。

协议验证

该协议在 Cai 等人的 Nature Communications (2023), DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40579-1中得到验证。

致谢

这项研究得到了德克萨斯州癌症预防和研究所 (CPRIT) 拨款 RP190278 和 RP210236、国防部拨款 W81XWH-21-1-0219、美国心脏协会拨款 19CSLOI34770004、美国国立卫生研究院拨款 RF1NS110499、国家科学基金会的部分支持拨款 2123971，尤金·麦克德莫特 (Eugene McDermott) 教授职位为 ZQ 插图人物提供的资金是通过Biorender.com创建的。图 1 和图 4 首次发表于 Cai 等人。 (2023) 并针对本出版物进行了修改。

利益争夺

所有作者均声明不存在竞争利益。

道德考虑

严格遵循德克萨斯大学达拉斯分校动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的动物伦理准则，确保小鼠在脑肿瘤超过预定最大体积 1 cm 3 时或达到时被安乐死。其体重减轻超过20%。

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