材料与试剂

生物材料

裸鼠作为移植受体：纯合裸 Foxn1 nu ，以前的 Hfh11 nu ，雌性，6-8周（杰克逊实验室，Nu/J，#002019； https://www.jax.org/strain/002019 ）。或者，纯合 NOD- Prkdc scid小鼠可以作为移植受体（杰克逊实验室， NOD.Cg-Prkdc scid /J，#001303）。裸鼠和 NOD-SCID 小鼠品系均显示出人类细胞的有效植入。然而，NOD-SCID 小鼠在手术前以及通常在移植物收获前需要对背部进行脱毛。因此，应仔细考虑选择合适的小鼠品系进行免疫学研究，以确保与实验要求的兼容性，并尽量减少与脱毛相关的任何潜在混杂因素（Waldron-Lynch）等人。，2012；克里斯托瓦尔等人。，2021）。
注意：在准备细胞培养物之前，请确保所有小鼠都健康并完全适应该设施至少一周。确保小鼠的重量在 21 克以上。
成纤维细胞，原代，新生儿（ATCC，目录号：PCS-201-010）
人表皮角质形成细胞，原代，新生儿（ HEKn ）（ ThermoFisher ，目录号：C0015）

试剂

DMEM/F12 (1:1)（ ThermoFisher ，目录号 11320-033）
混合人 AB 血清来源（创新研究，ISERAB）
MEM-NEAA（ ThermoFisher ，目录号：11140050
GlutaMax （ ThermoFisher ，目录号：35050061）
2-巯基乙醇（ ThermoFisher ，目录号：21985023）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4544）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H0888）
抗生素/抗真菌剂（ ThermoFisher ，目录号：15240062）
人bFGF （ ThermoFisher ，目录号：PHG0263）
人 EGF（ ThermoFisher ，目录号：PHG0313）
EpiLife培养基（ ThermoFisher ，目录号： MEPI500CA）
EpiLife限定生长补充剂（EDGS）（ ThermoFisher ，目录号：S0125）
牛胶原蛋白溶液，I 型，3 mg/mL（Advanced BioMatrix ，目录号 5005 ）。
胎牛血清，合格，一次注射，原始（ ThermoFisher ，目录号：A31605-01）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A6279-10ML）
来自人血浆的纤维蛋白原（Sigma-Aldrich，目录号：F3879-1G）
来自人血浆的凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4393-100UN）
不含钙和镁的 DPBS（ ThermoFisher ，目录号：14190-144）
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（ ThermoFisher ，目录号：25200-056）
Accutase （干细胞，目录号：7920）
CRYO 定义的无动物成分冷冻介质，2 × （ ZenBio ，目录号：CNT-CRYO-50）
CryoStor CS10，1 × （干细胞，目录号：100-1061）
抗小鼠角蛋白 (K)1 抗体，兔，1:500 稀释（ BioLegend ，目录号：905602）
抗小鼠/人 K14 抗体，鸡，1:2,000 稀释（ BioLegend ，目录号：906004）
抗人 Loricrin 抗体，兔，1:2,000 稀释（Abcam，目录号：176322）
抗人波形蛋白抗体，小鼠，1:500稀释（Abcam，目录号：16700）
抗 Rabbit-488 二抗（Invitrogen，目录号：A11008）
抗Chicken-594二抗（Invitrogen，目录号：A11042）
抗 Mouse-594 二抗（Invitrogen，目录号：11032）
福尔马林溶液，中性缓冲，10%（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）

解决方案

库存解决方案
凝血酶储备液 (25 U/mL)：由粉末制成（参见配方）
纤维蛋白原储备液 (40 mg/mL)：由粉末制成（参见配方）
牛胶原蛋白溶液，I 型 (3 mg/mL)：即用型

工作解决方案
完整的FEM 培养基（成纤维细胞培养）（参见食谱）
完整的EpiLife培养基（角质形成细胞培养）（参见食谱）
胶原蛋白溶液（角质细胞培养涂层）（参见食谱）
含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶（参见食谱）
含有角质形成细胞的纤维蛋白凝胶（参见食谱）

食谱

库存解决方案的配方

凝血酶原液
2+和 Mg 2+ ）中以 25 U/ mL 的浓度重构凝血酶。制作等份并冷冻在-20°C。手术前一天，将凝血酶溶液在 2-8 ℃下解冻过夜 °C。在移植过程中将凝血酶用于水凝胶制备之前，将其置于冰上。溶液应及时使用；但是，它可以在 2-8°C 的冷藏条件下最多保存三天。

纤维蛋白原原液
在生物安全柜的无菌条件下工作，在无菌 DPBS（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）中以 40 mg/mL 的浓度逐步重构纤维蛋白原。首先，在温热（37 °C ）的DPBS上铺上一层薄薄的纤维蛋白原粉末，并在37 °C下浸泡5分钟；用其余的纤维蛋白原重复浸泡过程。其次，将装有纤维蛋白原盐溶液的试管放入 37 °C水浴中30-60 分钟，并每 10 分钟轻轻摇动一次试管。确保管壁上没有干纤维蛋白原团块。第三，将管子放在摇床上于2–8 °C 过夜，以完成纤维蛋白原储备溶液的制备。如果留下大量未溶解的团块，请在 37 °C下重复孵育 30 分钟。 37 °C孵育时间不要超过 1 小时。纤维蛋白原盐溶液不得涡旋。纤维蛋白原应使用 0.22 μm注射器过滤器进行过滤灭菌。不要使用真空过滤，因为这会导致过滤过程中分子的分解。制备 50–100 µL 等分试样并冷冻于 -20 °C。

注意：也可以使用牛纤维蛋白原和凝血酶。

工作解决方案的秘诀

完整的 FEM 介质（表 1）
通过向 DMEM/F12 补充 5% 人血清、0.5 × MEM-NEAA、0.5 ×来制备 FEM 培养基 GlutaMAX TM补充剂，55 µM Gibco TM 2-巯基乙醇，1 × HyClone抗生素/抗真菌剂、50 µg/mL 抗坏血酸和 1 µg/mL 氢化可的松。进行 0.22 µm 无菌过滤并在 4 °C 下保存长达 1 个月。使用前，添加人bFGF至终浓度 12 ng/mL，添加人 EGF 至终浓度 5 ng/ mL。

表 1. 完整 FEM 介质的成分
试剂库存集中度最终浓度数量
DMEM/F12 (1:1)92.763 毫升
人血清100%5%5毫升
MEM-NEAA100 ×0.5 ×0.5毫升
GlutaMax补充剂100 ×0.5 ×0.5毫升
2-巯基乙醇55毫米55微米0.1毫升
抗坏血酸50毫克/毫升50微克/毫升0.1毫升
氢化可的松5毫克/毫升1微克/毫升0.02毫升
抗生素/抗真菌剂100 ×1 ×1毫升
1. 使用0.22 µm过滤器灭菌； 2.过滤后如下所示添加bFGF和 EGF
试剂库存集中度最终浓度数量
成纤维细胞生长因子100微克/毫升12纳克/毫升0.012毫升
表皮生长因子100微克/毫升5纳克/毫升0.005毫升
全部的不适用不适用0.005毫升

完整的EpiLife培养基（表 2）
添加EpiLife限定生长补充剂 (EDGS)来制备完整的EpiLife培养基。添加抗生素/抗真菌剂。

表 2. 完整EpiLife培养基的成分
试剂库存集中度最终浓度数量
EpiLife基础培养基不适用不适用500毫升
EDGS100 ×1 ×5毫升
抗生素/抗真菌剂100 ×1 ×5毫升
全部的不适用不适用510毫升

胶原蛋白溶液
要准备用于组织培养皿涂层的胶原蛋白工作溶液，请将 3 mg/mL 牛胶原蛋白储备溶液在 1× DPBS 中稀释至 30 µg/mL 的最终工作浓度。使用新鲜的。

含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶（表 3）
要制备含有成纤维细胞的纤维蛋白凝胶，首先制备工作溶液 1。要制备工作溶液 1，请在 DMEM/F12 1:1 中添加 1 ×抗生素/抗真菌剂、1% 原始 FBS 和抑肽酶。在 Eppendorf 管中混合成分，并将管置于冰上直至准备好移植。在移植前，将溶液 1 与成纤维细胞混合，然后添加纤维蛋白原和凝血酶。混合成分并用于嫁接。
关键：在准备移植*之前，请勿将成纤维细胞、纤维蛋白原和凝血酶添加到溶液 1 中。

表 3. 含有成纤维细胞的凝胶的组成
试剂库存集中度最终浓度数量
解决方案1
DMEM/F12 (1:1)不适用不适用291.7微升
抗生素/抗真菌剂100 ×1 ×4微升
原始胎牛血清100%1%4.1微升
抑肽酶（3-7 TIU/毫克蛋白质）不适用23.5微升

在移植前，添加成纤维细胞、纤维蛋白原和凝血酶，如下所示。
试剂库存集中度最终浓度数量
成纤维细胞*不适用2 × 10 650微升
纤维蛋白原*40毫克/毫升1.73毫克/毫升17.3微升
凝血酶*25单位/毫升0.59单位/毫升9.4微升
全部的不适用不适用400 µL

纤维蛋白凝胶（表 4）
要制备含有角质形成细胞的纤维蛋白凝胶，首先制备工作溶液 2。要制备工作溶液 2，请在EpiLife培养基中添加 1 ×抗生素/抗真菌剂和抑肽酶。在 Eppendorf 管中混合成分，并将管置于冰上直至准备好移植。在移植前，将溶液 2 与角质形成细胞混合，然后添加纤维蛋白原和凝血酶。混合成分并用于嫁接。
关键：在准备移植之前，请勿将角质细胞、纤维蛋白原和凝血酶添加到溶液 2 中**。

表 4. 含有角质形成细胞的凝胶的组成
试剂库存集中度最终浓度数量
解决方案2
埃皮莱夫不适用不适用295.8微升
抗生素/抗真菌剂100 ×1 ×4微升
抑肽酶（3-7 TIU/毫克蛋白质）不适用23.5微升

在移植前，添加角质形成细胞、纤维蛋白原和凝血酶，如下所示。
试剂库存集中度最终浓度数量
角质形成细胞**不适用2 × 10 650微升
纤维蛋白原**40毫克/毫升1.73毫克/毫升17.3微升
凝血酶**25单位/毫升0.59单位/毫升9.4微升
全部的不适用不适用400 µL

注意：对于大规模实验，真皮层和表皮层的工作水凝胶溶液可以制备为组合混合物，以促进同时生成多个移植物。为了最大限度地提高效率，可以在一个实验装置中进行 2-4 个移植。可选：根据移植物的数量重新计算解决方案 1 和解决方案 2 的体积。

设备

硅胶腔室 [由Qure Medical, 1810 Renaissance Boulevard, Sturtevant, WI, 53177, (262) 417–1307, http://www.qure-med.com生产，根据以下尺寸：12 mm 内径 (ID) ，外径 (OD) 20 毫米，高 10 毫米（零件编号 12-24，上室）]。腔室由 Momentive LSR 2650 制成，这是一种用于注塑工艺的双组分液体硅橡胶（图 2A）。
注意：腔室可重复使用且可高压灭菌。使用 2 毫米活检打孔器在腔室的圆顶上手动打三个孔，以便在腔室位于皮肤下时进行气体交换。
尼康 Eclipse 90i + Photometrics Cool SNAP HQ2+ DS Fi1（尼康，型号：Ti2-E）
尼康日食Ti-U倒置显微镜（尼康，型号：Ti-U）
CO 2培养箱（ ThermoFisher ，型号：HERA cell VIOS 160）
直钳（VWR，目录号：82027-398）
手术剪刀（VWR，目录号：82027-584）
弯钳（VWR，目录号：89259-946）
移液器P1000（Gilson，目录号：F144059M）
移液器 P200（Gilson，目录号：F144058M）
移液器 P20（Gilson，目录号：F144056M）
无菌过滤系统（Corning，目录号：431097）
-80 °C 冷冻柜（ ThermoFisher ，型号：TSX 系列，带 V 驱动器）
加热垫-T/Pump Professional（ Gaymar ，目录号： TP700）
加热垫毯（Cincinnati Sub-Zero，型号：274）
液体绷带新皮肤（亚马逊，目录号：851409007011）

软件和数据集

NIS-elements 尼康 ( https://www.nikoninstruments.com/Products/Software )
Microsoft Excel（微软， https://products.office.com/en-us/excel ）
GraphPad Prism（GraphPad， https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
Adobe Illustrator ( https://www.adobe.com/products/illustrator/free-Trial-download.html )

程序

该协议中完整移植物的生成跨越 54 天，涉及几个不同的步骤，如图形概述中所示。在第 1 步中，持续第 1 天至第 12 天，冷冻保存的角质形成细胞和成纤维细胞被解冻、培养和传代培养。第 2 步发生在第 12 天，需要通过手术插入硅室并建立细胞接种的纤维蛋白水凝胶。在第 19 天进行的步骤 3 中，移除硅腔以促进移植物与周围组织的粘附。最后，在第 4 步，即第 19-54 天，移植物建立并成熟。

所描述的协议概述了进行单次手术的过程。

角质形成细胞解冻并铺板

用胶原蛋白涂覆两个 10 厘米组织培养皿。
在 1× DPBS 中将牛胶原蛋白储备溶液 (3 mg/mL) 稀释至最终工作浓度 30 µg/mL。对于每个 10 厘米培养皿，将 60 µL 胶原蛋白溶液重新悬浮在 15 mL 锥形管中的 6 mL 1× DPBS 中。移液器混合。
将 6 mL 稀释的胶原蛋白溶液添加到每个 10 cm (~60 cm 2 ) 组织培养皿中。来回摇动以确保完全覆盖。
放入37℃/5%CO 2培养箱中1小时。
准备完整的EpiLife培养基（参见食谱）。
EpiLife培养基等分试样预热至室温 (RT)。
从步骤 A1 中准备的 10 厘米培养皿中吸出非聚合胶原蛋白。立即添加 9 mL 的完整EpiLife培养基，并将培养皿转移到 37 °C/5% CO 2组织培养箱中平衡 30 分钟。
将 5 mL 的EpiLife移液至 15 mL 锥形管中。置于生物安全柜中。
取出含有约 5 × 10 5冷冻角质形成细胞的冷冻管，并立即将其放入 37°C 水浴中。快速解冻（大约 1-2 分钟），将盖子保持在水面以上以避免污染。
注意：冷冻细胞的解冻时间很大程度上取决于解冻细胞的体积。解冻一分钟后，轻轻摇动小瓶并快速观察内容物。如果大部分细胞悬液已融化，则可以继续下一步。
用 70% 乙醇喷洒整个小瓶，擦拭，然后在生物安全柜中严格无菌条件下进行。
将解冻的角质形成细胞转移到步骤 A5 中准备的锥形管中。
将细胞在 RT 下以 200× g离心 5 分钟。
轻轻地将沉淀重新悬浮在 1 mL 的完整EpiLife培养基中，并将 500 µL 含有 2.5 × 10 5角质形成细胞的细胞悬浮液转移到每个 10 cm 培养皿中，并使用步骤 A4 中制备的预平衡EpiLife培养基，以达到适当/所需的电镀密度4×10 3细胞/cm 2 。
通过交替上/下和左/右运动轻轻彻底地分散细胞。再重复这些动作两次，以确保分布均匀。不要旋转板进行混合。一旦细胞均匀分散，将板放入 37 °C/5% CO 2组织培养箱中。
第二天，在显微镜下检查细胞附着。
更换一次完整的EpiLife培养基，直到细胞达到约 60% 汇合，然后每天更换，直到角质形成细胞培养物达到 70%–80% 汇合，此时必须传代细胞。
3 /cm 2的密度正确铺板，培养物应在 5–7 天内准备好进行传代培养。
角质形成细胞必须进行传代培养才能在移植过程中表现更好（见下文）。其余的细胞可以冷冻以供将来的实验使用。

传代角质形成细胞

注意：两个 10 cm 培养皿中角质细胞融合度为 80%，产生约 2.4 × 10 6 个细胞（见图 1A）。由于每次手术需要 2.0 × 10 6 个角质形成细胞，因此两个 10 cm 培养皿足以获得此数量的细胞。

图 1. 准备收获用于移植的角质形成细胞和成纤维细胞培养物的代表性图片。角质形成细胞 (A) 和成纤维细胞 (B) 显示处于适合移植的汇合处。比例尺，50 µm。

让Accutase和完整的EpiLife培养基平衡至 RT。
准备两个 10 厘米组织培养皿，并按照步骤 A1 中所述的程序涂上牛胶原蛋白。放入37℃/5%CO 2组织培养箱中1小时。
孵育 1 小时后，从上面准备的 10 厘米培养皿中吸出非聚合胶原蛋白，并立即添加 9 mL 完整EpiLife培养基。将培养皿转移到 37°C/5% CO 2组织培养箱中平衡 30 分钟。
取出含有需要从组织培养箱中传代的角质形成细胞的培养皿，并吸出用过的培养基，而不干扰细胞单层。
添加 6 mL 的 DPBS，轻轻摇动培养皿以清洗细胞。吸出 DPBS。
添加 3 mL Accutase并在 37°C 下孵育 6–9 分钟。
注意：孵育 5-6 分钟后评估细胞。在此期间，许多细胞将开始分离或采用圆形形态。如果超过 30% 的细胞仍附着，轻轻拍打培养皿，然后将其放回培养箱中再培养 2-3 分钟。孵育 9 分钟后，几乎所有细胞都应分离。避免细胞长时间接触Accutase至关重要。不要超过 9 分钟。
关键：如果角质形成细胞在短短3-4分钟内完全脱离，这表明角质形成细胞已经开始分化。在这种情况下，它们不应该用于嫁接；从早期传代的角质形成细胞开始。
孵育后，轻轻敲击培养皿并添加 3 mL 完整EpiLife培养基以中和Accutase 。立即进行下一步。
在显微镜下观察。大多数细胞应该悬浮在悬浮液中。如果没有，请使用宽细胞刮刀收集所有部分附着的细胞，尤其是培养皿边缘的细胞。
稍微倾斜培养皿，并使用 10 mL 血清移液器轻轻移液角质形成细胞一到两次，确保所有细胞从培养皿表面清洗干净。在此过程中注意避免形成气泡。
将解离的细胞转移到新的无菌 15 mL 锥形管中。添加 6 mL 的 DPBS 以冲洗掉Accutase 。
将细胞在 RT 下以 200× g离心 5 分钟。
吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 1-5 mL 的新鲜EpiLife培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
每 cm 2 2.5–4.0 × 10 3 角质形成细胞转移到每个涂有胶原蛋白的 10 cm 培养皿中，并使用步骤 B3 中制备的预平衡EpiLife培养基。
通过交替上/下和左/右运动轻轻彻底地分散细胞。再重复这些动作两次，以确保分布均匀。不要旋转板进行混合。一旦细胞均匀分散，将板放入 37 °C/5% CO 2组织培养箱中，并使板不受干扰至少 24 小时，以使细胞附着到培养皿表面。
第二天，在显微镜下检查细胞附着。
每隔一天更换一次完整的EpiLife培养基，直到角质形成细胞培养物达到约 60% 汇合。一旦达到此密度，每天更换培养基，直到培养物达到 70%–80% 汇合。此时，细胞已准备好进行传代。
注意：如果角质形成细胞的铺板密度为 2.5–4 × 10 3 个细胞/cm 2 ，则培养物应在 4–5 天内准备好进行传代培养（参见图 1A）。

解冻并铺板成纤维细胞

如上所述准备完整的 FEM 介质（参见配方）。
将完整 FEM 介质的 25 mL 等分试样预热至 RT。
将 9 mL 完整的 FEM 介质添加到两个 10 cm 培养皿中，并将其转移到 37 °C/5% CO 2组织培养箱中预平衡 30 分钟。
将 5 mL 的完整 FEM 介质移入 15 mL 锥形管中。置于生物安全柜中。
约 5 × 10 5冷冻成纤维细胞的冷冻管，并立即将其放入 37°C 水浴中。快速解冻（大约 1-2 分钟），注意将盖子保持在水位上方以避免污染。
注意：解冻时间取决于冷冻细胞的体积。一分钟后，摇动小瓶并快速观察内容物。如果大部分细胞悬液已融化，则可以继续下一步。
用 70% 乙醇喷洒整个小瓶，擦拭，然后在生物安全柜中严格无菌条件下进行。
将解冻的成纤维细胞转移到带有步骤 C4 中准备的 5 mL 完整 FEM 介质的锥形管中。
将细胞在 RT 下以 200× g离心 5 分钟。
轻轻地将颗粒重新悬浮在 1 mL 的完整 FEM 介质中，并将 500 μL 含有 2.5 × 10 5 成纤维细胞的细胞悬浮液转移到每个 10 cm 培养皿中，并使用步骤 C3 中制备的预平衡 FEM 介质，以达到适当/所需的电镀密度4×10 3 个细胞/cm 2 。
通过交替上/下和左/右运动轻轻彻底地分散细胞。再重复这些动作两次，以确保分布均匀。不要旋转板进行混合。一旦细胞均匀分散，将板放入组织培养箱中，并使其不受干扰至少 24 小时，以使细胞附着在培养皿上。
第二天，在显微镜下检查细胞附着。
每隔一天更换一次完整的 FEM 培养基，直到细胞达到约 80% 汇合。一旦达到这个密度，就将细胞传代。
注意：如果成纤维细胞在含 FBS 的培养基中培养，则应将其转变为 FEM 培养基（参见配方，表 1）。在完全 FEM 培养基中培养成纤维细胞四天足以成功转变，这将导致成纤维细胞表型发生变化并加速这些细胞的生长，如图 1B 所示。
成纤维细胞必须进行传代培养才能在移植过程中表现更好（见下文）。其余的细胞可以冷冻以供将来的实验使用。

传代培养成纤维细胞

注意：一个 10 cm 的成纤维细胞融合度为 85% 的培养皿可产生大约 2.5 × 10 6 个细胞（见图 1B）。由于每次手术需要 2.0 × 10 6成纤维细胞，因此一个 10 cm 培养皿足以获得这一数量的细胞。
准备一个 10 cm 组织培养皿，让胰蛋白酶-EDTA 和完全 FEM 培养基平衡至 RT。
将 9 mL 的完整 FEM 介质添加到培养皿中，并将其转移到 37 °C/5% CO 2组织培养箱中平衡 30 分钟。
取出装有需要从组织培养箱中传代的成纤维细胞的培养皿，并吸出用过的培养基，而不干扰细胞单层。
添加 10 mL DPBS，轻轻摇动培养皿以清洗细胞。吸出 DPBS。
添加 3 mL 胰蛋白酶-EDTA，并在组织培养箱中 37°C 孵育 2-3 分钟。
孵育后，轻轻拍打培养皿并添加 6 mL 完整的 FEM 培养基以中和胰蛋白酶-EDTA。
在显微镜下观察细胞。大多数细胞应该悬浮在悬浮液中。或者，使用宽细胞刮刀收集所有部分附着的细胞，尤其是培养皿边缘的细胞。
倾斜培养皿，用 10 mL 血清移液器轻轻移液一到两次，以清洗培养皿表面的所有成纤维细胞。避免形成气泡。
将解离的细胞转移到新的无菌 15 mL 锥形管中。添加 3 mL 的 DPBS 以稀释胰蛋白酶-EDTA。
以 200× g将细胞离心5 分钟。
吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 1-5 mL 新鲜的完整 FEM 培养基中，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。
每 cm 2.5 × 10 3 成纤维细胞转移到步骤D2中制备的预平衡 FEM 介质的培养皿中。
通过交替上/下和左/右运动轻轻彻底地分散细胞。再重复这些动作两次，以确保分布均匀。不要旋转盘子。一旦细胞均匀分散，将板转移到 37°C/5% CO 2组织培养箱中，并使板不受干扰至少 24 小时，以使细胞附着到培养皿上。
第二天，在显微镜下检查细胞附着。
每隔一天更换一次完整的 FEM 介质，直到细胞达到约 70%–80% 汇合（图 1B）。
3 /cm 2的密度铺板，则培养物应在3天内准备好进行传代培养。

移植用工作液和细胞的制备（针对一根移植物）

将凝血酶原液 (25 U/mL) 在 4 °C冰上解冻过夜。
使用前将纤维蛋白原等份在冰箱中解冻约 1 小时。
手术当天，根据表 3 和表 4 准备工作溶液 1 和溶液 2（参见工作溶液配方）。立即将所有组件放在冰上，同时准备细胞和小鼠进行手术。
分别从 B 部分和 D 部分收集扩大的角质形成细胞和成纤维细胞。
注意：重要的是，角质形成细胞和成纤维细胞都具有良好的质量，并且在手术当天分别在 75% 和 85% 的汇合度内（图 1A-1B）。使用分化或衰老细胞将导致移植失败。在手术前立即收集细胞。
按照步骤 D1–D10 中所述收集 2.0 × 10 6成纤维细胞，使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后离心细胞以获得沉淀。将颗粒重新悬浮在 50 μL 的完整 FEM 介质中，并将含有重新悬浮的成纤维细胞的管放在冰上。立即用于手术以保持细胞活力。
收集 2.0 × 10 6角质形成细胞，使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后离心细胞以获得沉淀。将沉淀重新悬浮在 50 μL 完整EpiLife培养基中，并将含有重新悬浮的角质形成细胞的管放在冰上。立即用于手术以保持细胞活力。
（可选）如果移植冷冻然后解冻的角质形成细胞和成纤维细胞，请按照以下步骤操作（针对一个移植物进行描述）：
解冻 2.0 × 10 6角质形成细胞和 2.0 × 10 6 成纤维细胞，分别如步骤 A6–A9 和 C5–C8 中所述。离心前对细胞进行计数，以确保使用正确数量的活细胞。
小心地将含有解冻成纤维细胞的颗粒重新悬浮在 50 μL 完整 FEM 介质中，并将含有解冻角质形成细胞的颗粒重新悬浮在 50 μL 完整EpiLife介质中。将重悬的细胞置于冰上并立即将其用于手术以保持细胞活力。
注意：在最佳条件下冷冻和解冻细胞对于确保细胞活力和功能至关重要。请参阅下面的补充信息。
将以下物质放在冰上运输到动物设施进行嫁接。下面显示的所有体积均针对一个移植物：
溶液 1 323.3 µL
成纤维细胞悬浮液 50 µL
溶液 2 323.3 µL
角质形成细胞悬浮液 50 µL
纤维蛋白原（40 mg/mL 库存）50 µL
凝血酶（25 U/mL 库存）25 µL

嫁接程序

按照 Diette 等人中概述的将硅胶室插入裸鼠的方案进行操作。 (2020) 或参见图 2B–2D 和视频 1。简而言之：

视频 1. 腔室插入程序

按照动物方案，通过腹腔注射制备的麻醉溶液对小鼠进行麻醉。
用酒精棉签擦拭麻醉小鼠的背部皮肤，让皮肤干燥。
使用镊子捏住皮肤并将其抬高到背部平坦区域上方。用弯剪刀剪一块皮肤，形成一个圆形切口，大小约为 1 厘米（图 2B）。
将 200 μL 滴含有抗生素的无菌 DPBS 涂在打开的肌肉筋膜上以提供润滑。用镊子提起边缘，轻轻释放切口周围的皮肤边缘（约 5 毫米）。同时，用 1 mL 尖端沿着切口边缘滑动，将皮肤与下面的肌肉筋膜分开。
使用直钳，拉起切口附近的皮肤边缘，在皮肤和肌肉筋膜之间形成细长的狭缝状开口。同时，用弯曲的镊子抓住硅胶室，并稍微挤压室的圆顶。
将腔室边缘的一侧滑动到狭缝一侧的皮肤下方（图 2C）。
用镊子轻轻地将皮肤拉过狭缝另一侧的腔室边缘，同时释放弯曲的镊子。释放两个钳子，并通过确保边缘在皮肤下平坦（图2D）将腔室的整个下边缘固定在皮肤下方。
成功插入腔室后，将鼠标转移到放置在加热垫上的干净笼子中，无需送丝机。
立即按照 G 部分所述进行细胞移植程序。
关键：确保植入室内的创面床在手术过程中不会干燥。

图 2. 嫁接过程的可视化表示。 (A) 显示了硅胶室的尺寸。 (B) 将小鼠皮肤切割成周长约 1 厘米的孔，用于腔室植入。然后将腔室插入伤口（C-D），并输送包含成纤维细胞的纤维蛋白水凝胶以形成真皮层（E）。真皮层聚合后，包含角质形成细胞的纤维蛋白水凝胶被递送到顶部（F）。

含有成纤维细胞的凝胶的递送

使用前将所有装有工作溶液、纤维蛋白原、凝血酶和细胞悬浮液的试管置于冰上。用 70% 乙醇喷洒小瓶，擦拭，然后在生物安全柜或动物设施的洁净手术室中严格无菌条件下进行。
关键：为了保持样品的完整性和活力，必须迅速执行所有步骤，确保试剂和材料在整个过程中保持在冰上冷冻。

使用移液器，将全部体积的冷工作溶液 1 (323.3 µL) 转移到含有步骤 E4a 中制备的悬浮成纤维细胞的管中（如果使用解冻的细胞，则为 E5）。轻轻混合内容物，注意避免形成气泡。
在转移到植入室之前，将 9.4 μL 25 U/mL 凝血酶和 17.3 μL 40 mg/mL 纤维蛋白原添加到步骤 G1 的细胞悬浮液中。通过移液 2-3 次轻轻重悬，避免产生气泡（参见表 3）。
立即使用窄头 1 mL 移液器将最终混合物 (400 µL) 转移到腔室中。
轻轻摇动鼠标，以促进水凝胶溶液在整个伤口床上的分布。
注意：通过安全和正确的室放置，纤维蛋白凝胶在硅胶室的下部应该稍微可见（图2E）。
将鼠标放在笼子里的加热垫上，并让它在那里停留 15 分钟。这个时间范围允许纤维蛋白水凝胶进行聚合，从而形成真皮层。重要的是要为水凝胶提供足够的时间来固化并建立所需的结构完整性。

含有角质形成细胞的凝胶的输送

当真皮层凝固时，制备含有角质形成细胞的表皮纤维蛋白凝胶。
使用移液器，将全部体积的冷工作溶液 2 (323.3 µL) 转移到含有步骤 E4b（或 E5，如果使用解冻细胞）中制备的角质形成细胞悬浮液的管中。轻轻混合内容物，注意避免形成气泡。
在移植到具有真皮层的植入室之前，将 9.4 μL 25 U/mL 凝血酶和 17.3 μL 40 mg/mL 纤维蛋白原添加到细胞悬浮液中。通过移液 2-3 次轻轻重悬，避免产生气泡（表 4）。
立即将最终混合物 (400 µL) 转移到含有成纤维细胞的固化纤维蛋白凝胶顶部的室中。
注意：转移混合物时避免拉动或倾斜硅室。小心处理腔室以防止移植材料受到任何破坏或移位非常重要。
轻轻摇动鼠标，确保含有水凝胶的角质形成细胞均匀分布在先前转移到硅胶室中的含有成纤维细胞的固化水凝胶上。
注意：通过安全和正确的室放置，水凝胶应该可见并填充硅胶室的二分之一到四分之三（图2F）。
将小鼠放入笼子中的加热垫上，并让它在那里停留 15-40 分钟，让纤维蛋白凝胶聚合形成表皮层。
关键：确保鼠标保持平静约 15 分钟，以使每一层聚合。此外，应用两个纤维蛋白层后，让鼠标不受干扰至少 1 小时。因此，最佳麻醉时间为 2 小时。
将室放在小鼠身上 7 天。
注意：手术后的前 10 天，定期检查小鼠并每天为它们提供湿润的食物。这有助于确保小鼠水分充足并支持其术后恢复。

腔室移除、伤口愈合和植皮成熟

手术后第 7 天（第 19 天），按照 Diette 等人所述，从移植小鼠中取出腔室。 (2020) 或参见视频 2。简单地说：

视频 2. 腔室拆除程序

按照动物方案，通过腹腔注射制备的麻醉溶液对小鼠进行麻醉。
用酒精棉签擦拭腔室周围的皮肤和腔室的圆顶。
用无菌镊子小心地松开腔室周围的皮肤。
用干净、戴手套的手指轻轻挤压硅胶室的圆顶，并小心地将一侧从皮肤下拉出。使用镊子小心地松开边缘的一侧。
确保移植物没有附着在腔室的内部，并且正在形成的皮肤移植物留在伤口中。
笔记：
如果移植物的边缘及其周围的结缔组织仍然附着在硅胶腔上，请沿着腔室的硅胶唇运行另一对镊子以释放移植物。
所得移植物应显示为灰白色塞子，没有黄色区域，这表明组织腐烂最小（图 3A-3D）。伤口表面可能表现出不同程度的干燥，这不会显着影响移植物的形成。
将新皮肤液体绷带涂在开放性伤口周围的小鼠皮肤上，以防止小鼠皮肤收缩。
将鼠标放入干净的笼子（没有送丝机）中，该笼子已放在加热垫上至少 1 小时。小鼠从麻醉中恢复后，取出加热垫并监测小鼠的愈合持续时间（手术后约六周）。
注意：腔室移除后形成的痂会在 2-2.5 周内自然脱落。
手术后六周（方案第 54 天）收获移植物进行组织学分析或活体内研究。
注：腔室移除后人体皮肤移植物的尺寸受到腔室尺寸的限制，直径范围为 1.0 至 1.5 厘米（图 3A-3D）。愈合后，移植物的直径通常在 0.4 至 1.2 厘米之间（图 3E-3H）。这种尺寸适合各种应用，例如评估皮肤细胞功能、模拟皮肤疾病的表型、研究伤口愈合阶段、研究衰老和评估皮肤屏障功能。如有必要，可以在手术后五周更早地分析移植物。

图 3. 愈合过程不同阶段的移植物的代表性图像。使用（A，E） 2.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 2.0 × 10 6进行基于纤维蛋白的移植新鲜培养的成纤维细胞； (B, F) 1.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 1.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞，以及 (C, G) 2 × 10 6冷冻然后解冻的角质形成细胞和 2 × 10 6冷冻然后解冻的成纤维细胞。作为对照，显示了使用经典移植室测定法使用5.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 5.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞生成的移植物（D，H）。顶部显示了腔室移除当天（第 7 天）形成移植物的代表性图像，底部显示了移植后 5 周时相应完全建立的移植物。 OW——腔室移除后开放的伤口，CW——在植皮收获当天闭合的伤口。

人类皮肤异种移植物的组织学检查

根据机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的方案，在收获当天（第 54 天）对小鼠进行安乐死。
使用永久性记号笔标记移植物的边界，并小心地切割移植物周围的小鼠皮肤，与移植物边缘保持 5 毫米的距离。
轻轻地剥去皮肤并将其转移到 Whatman 纸上以确保其平整。
将带有皮肤移植物的切片在 10% 福尔马林缓冲溶液中固定 24 小时，然后将其转移到 70% 乙醇中。
固定的组织可以石蜡包埋并切片以进行进一步的组织学分析。如果进行组织学分析，请准备 7 μm切片，其中包括移植物的中心部分和边缘部分。
(H&E)染色的组织切片进行常规组织学分析，确认人类皮肤移植物的存在（Yanez等人， 2015）。在这种染色方法中，表皮在皮肤顶部显示为薄而致密的多层结构，呈现深粉色并覆盖角质层（图4A）。真皮呈现为表皮下方的浅粉色实质层，其细胞核染成紫色。值得注意的是，与邻近的小鼠皮肤相比，人类移植物通常表现出更厚的角质层和表皮（图4A、4D、4G和4J）。
按照 Yanez 等人概述的方案进行免疫组织化学分析。（2015）。要标记表皮，请使用1:2000 稀释的抗 K14 抗体 ( BioLegend 906004)。以 1:500 稀释度与抗小鼠 K1 抗体 ( BioLegend 905602)共染色有助于描绘人类移植物边界（参见图 4B、4E、4H 和 4K，其中 K14 以红色表示，K1 以绿色表示））。为了可视化人类真皮，请使用 1:500 稀释度的人类特异性抗波形蛋白抗体 (ab16700)。当与抗人 Loricrin 抗体 (ab176322) 以 1:2000 稀释度共染色时，人波形蛋白染色可深入了解人表皮下人真皮的正确定位（见图 4C、4F、4I 和 4L），Vimentin 以红色表示，Loricrin 以绿色表示）。使用试剂部分中所列的 1:300 稀释度的相应二抗。使用配备 Photometrics Cool SNAP HQ2+ DS Fi1 Nikon 共焦系统或其他类似显微镜系统的 Nikon Eclipse 90i 显微镜捕获图像。

图 4. 人类皮肤异种移植物的组织学检查。使用 2.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 2.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞（A–C）、1.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 1.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞（D–）生成的基于纤维蛋白的移植物的代表性图像F)，以及 2.0 × 10 6冷冻然后解冻的角质形成细胞以及 2.0 × 10 6冷冻然后解冻的成纤维细胞 (G–I)。作为对照，还分析了使用经典移植室测定法生成的移植物，其中包含5.0 × 10 6 个新鲜培养的角质形成细胞和 5.0 × 10 6 个新鲜培养的成纤维细胞（J-L）。移植物的 H & E 染色（A、D、G、J）。使用小鼠特异性角蛋白 (K)1（moK1；绿色）和人/小鼠特异性 K14（红色）进行免疫荧光染色。请注意，moK1 抗体仅对小鼠表皮进行染色（B、E、H、K）。使用人类特异性 Loricrin（Lor；绿色）进行免疫荧光染色可检测人类表皮，而人类特异性 Vimentin（Vim，红色）可检测人类真皮（C、F、I、L）。细胞核用 DAPI 染色（蓝色）。比例尺，100 μm 。

数据分析

为了评估移植物的质量，可以评估几个参数，例如（1）发育的人体皮肤移植物的长度和（2）使用组织学分析和免疫荧光染色的表皮和真皮的厚度，以及（3）伤口收缩。为了比较移植组之间的移植测量平均值，请进行方差分析测试 (GraphPad Prism)。

移植物测量

伤口收缩
使用数码相机和以厘米为单位校准的无菌尺，横向放置在移植物下方，在取出腔室后第 19 天捕获开放伤口 (OW) 的图像，并在移植物收获前第 54 天捕获闭合伤口 (CW) 的图像（图 3D 和3H）。
使用Adobe Illustrator 中的测量工具，确定照片中标尺上相当于 1 厘米的像素数。建立像素到厘米的转换。
确定代表 OW 和 CW 直径的像素数。
使用之前建立的像素到厘米的转换，将伤口直径重新计算为厘米。
将计算出的伤口直径除以二即可得出伤口的半径 (r)。
重新计算伤口面积 (cm 2 )，如下所示：

Wound area=πr^2

伤口收缩百分比定义如下：

% of wound contraction=(1-(Closed wound aria)/(Opened wound aria))×100

皮肤层测量
使用 NIS-elements Nikon 软件合并颜色并设置 100 µm 比例尺（图 4）。
利用Adobe Illustrator 中的测量工具根据皮肤层的免疫组织化学染色来测量人体移植物的尺寸以及表皮和真皮的厚度。

协议验证

为了建立这种嫁接方法，总共进行了 28 次嫁接程序。使用2 × 10 6 个新鲜培养的角质形成细胞和2 × 10 6 个新鲜培养的成纤维细胞进行了8次移植手术，成功率100%。当培养细胞数量减少时，移植成功率下降至80%。具体而言，用1 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和1 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞一起进行5次移植手术，并成功形成4个移植物。重要的是，使用 5 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 5 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞的经典室移植测定的典型成功率也在 60% 和 80% 之间波动（Wang等人，2000 年；Diette等人）等，2020）。因此，与其他皮肤移植方法相比，我们的移植方法可以用更少的细胞数量实现更一致的人体皮肤移植形成。
有趣的是，当使用2 × 10 6冷冻然后解冻的角质形成细胞与 2 × 10 6冷冻然后解冻的成纤维细胞一起进行移植时，我们的方法获得了 72% 的成功率（11 个移植物中有 8 个成功植入），提供在皮肤移植中使用冷冻然后解冻的皮肤细胞的可行性数据。此外，作为对照，还进行了四种经典的植皮室测定。
本手稿中描述的程序目前正在我们的实验室至少三个不同的项目中使用，并且可以在多个实验室成员之间复制。
人体移植物的质量，特别是表皮和真皮的大小和厚度，是影响移植物持久性和下游应用有效性的重要因素。我们绘制了不同条件下生成的移植物的不同测量结果，发现所得移植物的参数存在显着差异（图 5A-5D）。术后第 6 周对每组的 4 个移植物进行分析。
首先，我们分析了移植物愈合过程中伤口区域的收缩情况。小鼠皮肤收缩的程度会显着影响人类异种移植物愈合后的大小。我们的实验数据显示，用2.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和2.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞产生的移植物表现出52.8% ± 11.2%的伤口收缩，而用1.0 × 10 6 培养的角质形成细胞和1.0 × 10 6一起产生的移植物表现出52.8 % ± 11.2%的伤口收缩。新鲜培养的成纤维细胞表现出 88.7% ± 3.7% 的收缩。 2×10 6的利用率冷冻然后解冻角质形成细胞以及 2 × 10 6 冷冻然后解冻的成纤维细胞导致 62% ± 5.2% 的收缩。相比之下，使用 5.0 × 10 6培养的角质形成细胞和 5.0 × 10 6培养的成纤维细胞进行经典室测定产生的对照移植物表现出 60.9% ± 4.7% 的收缩率（图 5A）。通过并行组织学分析证实了移植物尺寸测量的准确性，结果表明，由 2.0 × 10 6 个新鲜培养的角质形成细胞和 2.0 × 10 6 个新鲜培养的成纤维细胞生成的移植物表现出最大的表面积（图 4A-4C 和图 5B）。
我们报告的移植物的收缩率与使用其他基于水凝胶的方法的其他报告一致（Del Rio 等人。，2002年；拉梅斯等人。，2004年；卡利亚纳拉曼和博伊斯，2009；马丁内斯-圣玛丽亚等人。，2012；亚内兹等人。 , 2015;约根森等人。，2020）。例如，Kalyanaraman 和 Boyce (2009) 报道，用 4 cm 2成纤维细胞填充的胶原糖胺聚糖海绵作为真皮成分生成的移植物的收缩率约为 64%–70%（Kalyanaraman 和 Boyce，2009）。另一项研究表明，当 6.25 平方厘米的伤口被三层纤维蛋白生物打印皮肤覆盖时，到第 3 周收缩率达到 50%（Jorgensen）等人。，2020）。同样，当应用于 2.5 cm² 伤口时，3D 打印的胶原蛋白移植物在第 6 周时表现出 62.5% 的收缩率（Yanez 等人。，2015）。
移植物的厚度至关重要，因为它会影响创面床内随时间的收缩程度，并影响初始愈合阶段营养物质从创面床的扩散。我们根据组织学分析测量了移植物中真皮和表皮的厚度。我们的移植物内的平均真皮层厚度范围为 314.2 至 621.4 µm，处于天然人类皮肤真皮厚度的下限，移植变体之间没有显着差异（图 5C）。表皮厚度在34.2~92.3μm之间，也处于天然人类皮肤表皮厚度的下限（ Lintzeri）等人。，2022）。与该数字的唯一偏差是在使用 2 × 10 6生成的移植物中观察到的冷冻然后解冻的角质形成细胞以及 2 × 10 6冷冻然后解冻的成纤维细胞。这些移植物形成了更厚的表皮，范围为 128 至 140 µm（图 5D）。用冷冻然后解冻的细胞产生的移植物与用新鲜培养的细胞产生的移植物的参数差异可能是由于冷冻和解冻过程中的功能改变造成的。
观察到的移植物特性差异凸显了细胞数量和处理方法在皮肤移植过程中实现预期结果的重要性。
总之，用 2.0 × 10 6新鲜培养的角质形成细胞和 2.0 × 10 6新鲜培养的成纤维细胞生成的移植物是可重复的且质量优异。因此，该组合物成为本研究中描述的移植方案中的最佳变体。如果需要，用冷冻然后解冻的角质形成细胞和成纤维细胞制成的移植物也可以作为适当的替代方案。

图 5.数字平面测量。 A 中显示了伤口收缩率的各个图。通过分析 6 周时发育的移植物的免疫荧光图像来确定移植物的长度 (B)、真皮的厚度 (C) 和表皮的厚度 (D)手术后（****p < 0.0001；***p < 0.002；**p < 0.0094；*p < 0.02）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

我们的研究首次报告了皮肤细胞在体内成功的逐层移植。它显示了移植分层皮肤的可行性，无需进行 3D 皮肤生物打印或在培养皿中生成复杂的 3D 皮肤等效物，这既费力又需要专门的设备（Cooper等，1993 ；乔根森等人。，2020）。因此，通过进一步修改，所提供的方法可以作为皮肤移植新临床方案的基础。与涉及角质形成细胞片、半分裂或脆弱的全层移植物的移植方法相比，我们的方案预计将产生更好的结果。
我们的方案专门针对第二代人类新生儿角质形成细胞和成纤维细胞的使用进行了优化。然而，它可以针对在后来的传代中收集的皮肤细胞（角质形成细胞高达第四代，成纤维细胞高达第六代）和不同来源（数据未显示）进行定制。
我们的方案还允许冷冻然后解冻的角质形成细胞和成纤维细胞成功植入（图 3C 和 3G）。这是第一份报告，显示使用冷冻然后解冻的皮肤细胞成功生成体内全层皮肤移植物，而无需事先进行细胞培养扩增。由于冷冻细胞比体外生产的皮肤等效物更容易运输和储存，因此移植冷冻皮肤细胞的可行性可能会大大简化烧伤患者和慢性伤口患者的皮肤移植。
用该方案生成的人类皮肤移植物在移植到免疫功能低下的小鼠身上后可持续至少三个月。
基于人纤维蛋白的水凝胶通常用作组织生物工程和皮肤移植的基质，并已获得 FDA 批准。为了确保我们的方法的临床适用性和成功，我们在该方案中使用高纯度且经过细胞培养测试的人血浆来源的纤维蛋白原和凝血酶。
在我们改进的室测定中，纤维蛋白原的最终浓度为 1.73 mg/mL，凝血酶浓度为 0.59 U/ mL。这些浓度明显低于临床和研究应用的推荐范围，其中纤维蛋白原浓度通常为 5 至 80 mg/mL，凝血酶浓度范围为 1 至 125 U/ mL。然而，我们配方中使用的浓度产生的软凝胶会在 15 分钟内固化。软凝胶结构具有相对较大的孔径，有利于细胞在凝胶内迁移。此外，丰富的周围培养基的存在可促进细胞活力。凝胶的最终硬度不会影响移植物的尺寸，并且凝胶有效地覆盖整个伤口区域。因此，这些条件可能会增强细胞活力，支持细胞分裂和迁移，并促进细胞在有利的环境中重排。
我们提出的方法的一个潜在限制是形成水凝胶封装细胞所需的时间。与标准室测定相比，在我们的方法中创建真皮层和表皮层导致将细胞从组织培养皿转移到伤口表面的过程延迟15分钟。然而，这种延迟不会影响细胞活力，与标准室测定 (60.1%) 相比，我们的方法导致移植物收缩较小 (52.8%)

故障排除

移植失败。角质形成细胞的质量对于成功植入至关重要。防止角质形成细胞达到高于 75% 的汇合水平至关重要。超过这个阈值可能会导致细胞的终末分化，阻碍它们的有效植入。同样，成纤维细胞在用于手术之前不应达到 85% 汇合，因为它们在移植时应具有有丝分裂活性。至少进行三个生物重复。
成纤维细胞的数量不足以进行手术。可以用少于 1.0 × 10 6的成纤维细胞成功生成真皮成分，而不会影响该方法的再现性（数据未显示）。
角质形成细胞的数量不足以进行手术。我们的方案可以使用低至 0.5 × 10 6培养的角质形成细胞和 0.5 × 10 6培养的成纤维细胞进行。然而，这些移植物的成功率较低，约为 40%（数据未显示）。
冷冻细胞的移植效率不如新鲜培养的细胞。正确冷冻和解冻细胞对于其成功植入至关重要。我们的方案使用 Cryo50 ( ZenBio ) 冷冻保存角质形成细胞，使用CryoStor CS10 ( StemCell Technologies) 冷冻保存成纤维细胞。冷冻和解冻程序是根据制造商的建议进行的，补充材料中对此进行了进一步描述。
在移植过程中，纤维蛋白凝胶粘附到硅室上。在移植过程中，一个潜在的挑战是纤维蛋白凝胶对硅室壁的粘附。为了防止这种情况发生，在引入纤维蛋白凝胶之前，请确保腔室清洁且没有碎屑或水分。避免腔室超载，并遵循实验方案推荐的细胞凝胶体积。腔室过度填充会导致过量的凝胶接触壁，从而增加凝胶粘附的可能性。认真遵循该协议并使用指定体积的凝胶溶液将有助于整个过程的成功，并最大限度地减少与凝胶粘附到腔室壁相关的任何问题。

致谢

我们感谢以下机构的资助支持：美国国立卫生研究院（ R01AR059947、R01AR078551 和 U01AR075932）、国防部 (DOD) (W81XWH-18-1-0706) 、大疱性表皮松解症 (EB) 研究合作伙伴、 EB 医学研究基金会、Cure EB 慈善机构、国际营养不良性大疱性表皮松解症研究协会 (DEBRA)、盖茨前沿基金和 AVITA Medical。该协议部分基于 Diette, N.、Kogut, I. 和 Bilousova, G. (2020) 的工作。在免疫缺陷小鼠上生成全层人类皮肤等效物。分子生物学方法2109：169–183。

利益争夺

DRR 拥有 AVITA Medical 的股权。 KB 是 AVITA Medical 的员工，AH 是进行研究时的员工。 AVITA Medical 可能会从此处介绍的研究结果中受益。其他作者没有任何需要声明的潜在利益冲突。

道德考虑

所有动物均按照科罗拉多大学安舒茨医学校区动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 的规定进行饲养和处理。所有研究均经 IACUC 委员会批准进行。

参考

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补充资料

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