材料与试剂

生物材料

请参阅 Giansanti、GM 等人。 [24]，可用于标记中央纺锤体/纺锤体中区和卵裂沟的标记蛋白列表。为了分析胞质分裂，下面列出了一些果蝇种群的例子（表 1）。

表 1. 标记质膜、中心纺锤体和肌动球蛋白收缩环的果蝇种群列表。
不蛋白质本土化飞行库存编号/参考号
1Steppke /Grp1的 PH 结构域在 Tub84B 启动子 ( tGPH )的控制下表达，与 PIP3 结合质膜，在卵裂沟膜的早期和晚期富集BDSC#8163
2Ubi-p63E-Feo-mCherry， mCherry标记的feo蛋白在泛素调控序列的控制下表达主轴中区/中央主轴BDSC#59277
3Sqh -GFP.RLC，标记 GFP 的肌球蛋白 II 调节轻链在其自身启动子控制下表达收缩环BDSC#57145
4UAS- mRFP -Scraps，包含 Anillin 蛋白的 PH 结构域，标记有在 UAS 控制下表达的mRFP卵裂沟/收缩环BDSC#52220
5UAS- PLCdels -PH-EGFP，人 PLCD1 的 PH 结构域，标记有在 UAS 控制下表达的 EGFP质膜和卵裂沟BDSC#39693

试剂

1.Shields 和 Sang M3 昆虫培养基（Sigma-Aldrich，目录号：S8398-1L）
2.适用于昆虫细胞培养的热灭活胎牛血清（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10082147）
3.青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
4.蒸馏水，1,000 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15230147）
5.聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（ Sigma-Aldrich，目录号：P0899）
6.碳酸氢钾（KHCO 3 ）（ Sigma-Aldrich，目录号：237205）
7.二甲亚砜（DMSO）（ Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
8.Dynasore水合物（ Sigma-Aldrich，目录号：D7693）
9.乙醇 (70%)
10.M3 媒体（参见食谱）

解决方案

1.200 μg /mL 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐，蒸馏水中
2.31 mM 或 10 mg/mL Dynasore水合物

食谱

1.M3媒体
在生物安全柜中准备此配方。将一瓶粉末培养基（Shields 和 Sang M3 昆虫培养基）分配到 1 L 烧杯中（注意：可能会刺激眼睛和皮肤），并添加 0.5 g KHCO 3和 800 mL 无菌蒸馏水。使用磁力搅拌器和棒将粉末完全溶解。随后，加入 100 mL 热灭活的 FBS 和 10 mL 青霉素/链霉素溶液，并在磁力搅拌器上充分混合。将最终体积补足至 1 L，并通过具有 0.2 μm 孔径膜的瓶顶过滤装置进行过滤灭菌。将过滤灭菌的介质等分到 50 mL Falcon管中并储存在-20 ℃ 。实验当天，在 37 °C水浴中解冻一份介质，并使用 0.2 μm注射器过滤器再次将介质过滤到新鲜的Falcon管中。进行实验时，介质应处于室温。多余的培养基可在 4 °C下保存长达 1-2 周。

实验室用品

1.玻璃底细胞培养皿，15 mm（NEST，目录号：801002）
2.玻璃孔板，9 个孔（Corning Life Sciences，目录号： 7220-85）
3.Dumont#5 陶瓷涂层钳（精细科学工具，目录号：11252-50）
4.解剖针，尖端直径 0.0175 mm（Fine Science Tools，目录号： 26002-15)
5.针座（精细科学工具，目录号：26018-17）
6.Lumox ®培养皿 50（Sarstedt，目录号：94.6007.410）
7.SecureSeal成像垫片，0.12 毫米深（Grace Bio-Labs，目录号：654008）
8.一次性无菌过滤器装置，500 mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：450-0020）
9.注射器过滤器，无菌，0.22 um（ GenClone ® ，目录号：25-244）
10.BD 10 mL 注射器，鲁尔锁尖端（BD，目录号：302995）
11.微管，透明 1.7 mL（奥林巴斯塑料，目录号：24-281）
12.Falcon，50 mL，无菌，聚丙烯锥形管，（Corning，目录号：352098）
13.15 mL离心管，无菌聚丙烯管（Corning，目录号：430052）

设备

1.蔡司SteREO Discovery 显微镜（蔡司集团，型号：V12）
2.Leica DMi8 显微镜底座 (Andor) 上的旋转盘共焦

软件和数据集

1.Andor Fusion （版本 2.3.0.44）（https://andor.oxinst.com/downloads/view/fusion-release-2.3）
2.Imaris （版本 10.0）(https://imaris.oxinst.com/)
3.斐济/ImageJ (https://imagej.net/software/fiji/downloads)
4.棱镜 9 (https://www.graphpad.com/features)

程序

A.分离精母细胞囊肿中雄性减数分裂胞质分裂的体外活细胞成像。

1.成年果蝇睾丸的解剖
a.2垫上收集大约 10-20 只新封闭的雄性苍蝇。
b.使用刀片斩首苍蝇头并将苍蝇转移到 Eppendorf。
c.将 400 μL M3 介质移入玻璃孔板中。我们建议在整个过程中使用 M3 介质。然而，施耐德的媒体可以作为替代选择。
d.在一个单独的井中，分配断头的苍蝇，并使用镊子，以腹部腹侧朝上的方式握住苍蝇胸部（图2A-C和视频2）。
e.将苍蝇浸入 M3 细胞培养基中，并使用另一把镊子捏住腹侧腹部皮肤的远端（图 2D 和视频 2）。
f.使用镊子，抓住男性终末并慢慢拉开，使整个男性生殖系统释放到介质中（图2E、F和视频2）。
g.使用镊子将睾丸与生殖系统的其他部分分开。果蝇睾丸可以通过其特征性的螺旋形状轻松识别（图 2 G、H 和视频 2）。
h.重复此过程，直到在 M3 细胞培养基中解剖出 10-20 对睾丸。

图 2. 睾丸和种系囊肿的解剖。 (A) 斩首的雄性果蝇。 (B、C) 将苍蝇腹侧向上放置，并用镊子固定胸部。 (D) 用另一把钳子捏腹腹部皮肤。 (E) 用镊子握住雄性终端。 (F) 慢慢拉开雄性终端。 (G) 将睾丸与附属腺体和集合管分开。 (H) 用 M3 介质清洗睾丸。 (I-M) 在高放大倍率下，聚焦于单个睾丸，并使用一对针，撕开睾丸肌鞘。 (N-O) 轻轻搅动所有撕开的睾丸，将囊肿释放到介质中。 (P) 在解剖井中心收集的囊肿。

视频 2.果蝇睾丸解剖、单个种系包囊的分离以及安装在盖玻璃底皿上的详细程序

2.雄性减数分裂精母细胞囊肿的分离
a.μ L ，重复 3 次），冲洗睾丸。
b.用剪刀剪断移液器尖端，并通过吸入和排出来用 M3 介质预湿。
c.使用预切和预湿的移液器吸头，将清洗后的睾丸转移到含有 400 μL M3 介质的新鲜孔中。
d.将 SteRio V12 显微镜调整至高放大倍数 (63 × )，同时聚焦于单个睾丸。
e.使用一对携带尖端直径为 0.0175 mm 的钨针的持针器，撕开睾丸肌鞘，将所有分化的生殖细胞囊肿（包括减数分裂精母细胞阶段）释放到介质中（图 2I-M 和视频 2 ）。重复此过程，直到其余的睾丸被撕开（图2N）。请注意，这是该过程中最困难的部分，可以通过练习来掌握。我们建议在解剖部位附近以十字交叉方式握住针，以抓住睾丸，然后用一根针戳并固定睾丸，并用另一根针撕裂（图 2I-M 和视频 2）。
f.所有撕开的睾丸都被捆绑起来，通过用针轻轻搅动，松散地附着在睾丸肌肉壁上的所有囊肿都会落入介质中。随后，用针将所有其他睾丸碎片从介质中推出，包括精子束和肌鞘（图 2N-O 和视频 2）。
g.用新鲜介质移液，轻轻地将玻璃孔板底部的生殖细胞囊肿冲洗到板的中心（图 2P 和视频 2）。用新鲜介质更换旧介质 3 次（3 × 400 μL ），清洗集中在孔中心的包囊。如果实验需要用药物进行处理，请用含有适当药物的新鲜培养基替换旧培养基，并轻轻摇动孵育所需的时间。例如，我们用Dynasore处理精母细胞囊肿，Dynasore 是一种动力抑制剂，可阻断网格蛋白介导的内吞作用 [23]，在 M3 培养基中浓度为 80 μM /mL，并在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。对于对照，我们使用了相似体积的载体来溶解药物，在本例中为 DMSO (2.5 μL /mL)。如视频 3 所示，与对照相比， Dynasore处理的精母细胞在胞质分裂的早期阶段显示出中央纺锤体组装缺陷，这表明动力活性以及可能的内吞作用在雄性减数分裂胞质分裂中发挥着至关重要的作用。

视频 3.用媒介 DMSO 或动力抑制剂Dynasore (80 μM /mL)处理的分离成年果蝇精母细胞囊肿的体外实时成像。从普遍表达tGPH （Grp1/Step 的 PH 结构域）和 FeomCherry 的果蝇睾丸中分离出包囊。由于囊肿细胞膜包膜的丢失，tGPH 主要定位于细胞质。使用 63 倍水浸物镜和 1024 × 1024 AOI 进行实时成像，每隔 2 分钟重复 120 次。此处显示的视频表示 10 帧/秒。

3.将囊肿安装到盖玻片底皿上
a.通过吸入和排出，用 M3 介质预湿 200 μL移液器吸头。
b.使用预湿的 200 μL移液器吸头，吸出集中在玻璃孔板中心的囊肿，并以液滴形式分配在盖玻璃底皿的中心（图 3A、B 和视频 2）。
注意：聚 L-赖氨酸被证明对雄性生殖细胞囊肿有害（Gartner 等人，2014 年）；因此，我们不建议在玻璃底皿上涂上聚L-赖氨酸/聚D-赖氨酸。在我们手中，用低浓度的聚 D-赖氨酸 (50 μg/mL) 包被，然后用水彻底清洗，对胞质分裂没有显示出太大影响 [3]。然而，在涂有较高浓度聚 D-赖氨酸 (200 μg /mL) 的玻璃底培养皿中，即使在彻底清洗后，细胞分裂缺陷也很明显，特别是在减数分裂 II 胞质分裂中（视频 4）。

图 3. 将雄性种系包囊安装在盖玻片底皿中，并移至转盘共焦显微镜载物台上。 (A) 用预湿的移液器吸头吸出预洗的雄性生殖系包囊。 (B) 囊肿被分配在玻璃底盖皿 ( Ø 15 mm) 的中心。 (C) 轻轻地添加 200 μL M3 培养基，不要干扰中心的包囊。 (D) Leica DMi8 显微镜底座设置。 (E) 用磁力夹安装在载玻片/培养皿支架上的玻璃底培养皿。将一滴水滴在 63 ×水浸物镜上（箭头）。 (F) 将载玻片/培养皿支架轻轻插入显微镜载物台上。

视频 4.解剖的成年果蝇精母细胞囊肿在涂有聚 D-赖氨酸（200 μg /mL，室温下过夜，然后用蒸馏水清洗3次）的玻璃底培养皿中经历减数分裂 I 和减数分裂 II 胞质分裂的体外实时成像）。从普遍表达tGPH （Grp1/Step 的 PH 结构域）和 FeomCherry 的果蝇睾丸中分离出包囊。使用 63 倍水浸物镜和 1024 × 1024 AOI 进行实时成像，每隔 2 分钟重复 120 次。此处显示的视频表示 10 帧/秒。

c.缓慢将 200 μL的新鲜 M3 介质添加到盖玻片底皿的观察区域，而不干扰中心的囊肿（图 3C 和视频 2）。（注：添加的培养基体积可能会有所不同，具体取决于实验中使用的盖玻片底皿的观察面积）。用盖子盖上培养皿，轻轻地将其移至共焦成像站（图 3D 和 F）。确保囊肿保留在培养皿的中心；如果介质水平太低或太高，囊肿往往会扩散到角落。
d.如果需要，可以用针轻轻地将每个囊肿从池中推开，然后用预湿的移液器吸头将其吸出，并分配到每孔含有 100 μL 介质的盖玻璃底部 94 孔板中，从而单独分离囊肿。可以在倒置共聚焦显微镜下检查沉降在每个孔中的单个包囊，以确定感兴趣的分化阶段。这种方法只需向孔中添加多聚甲醛 (PFA)（最终浓度应为 4%）即可将囊肿阻止在所需的分化阶段 [3]。

4.转盘共焦显微镜上的延时成像
我们使用Andor转盘共焦显微镜和Leica DMi8底座进行成像；然而，下面描述的协议可以适用于任何其他成像设置。该显微镜配备横河电机 CSU-W1 共焦扫描仪 8 条激光线，还提供落射荧光、明场和差分界面 (DIC) 成像模式。它还具有带压电 Z 扫描仪 (ASI) 的电动 XY 平台、Andor Zyla4.2 + sCMOS相机以及一系列物镜，包括 5 ×空气、10 ×空气、20 ×空气/油、63 ×油、25 ×水和 63 ×水（1.2 NA，WD 0.30 毫米）。
a.打开旋转盘共焦显微镜和计算机。
b.在计算机上，单击 ASI 控制台应用程序，选择MS2000 单击“连接” ，将 x、y 和 z 速度设置为 5，然后退出 ASI 控制台。
c.双击 Andor Fusion 应用程序打开该软件。
d.将玻璃底皿放入幻灯片/培养皿支架中，并用磁性夹锁定培养皿（图 3D，F）。
e.返回 Fusion 软件。在导航窗口中，通过单击三个点输入图像名称并保存位置，如图 4A 中第一个箭头所示。
f.在“协议”窗口中，如果存在以前保存的协议，请选择并重新加载它，如图 4A 中的第二个箭头所示。
g.在显微镜窗口（箭头 3）中，选择感兴趣的目标。我们一般先选择10 ×空气物镜。转至活动通道窗口（箭头 4）并选择明场眼（BF 眼）。返回显微镜，使用目镜定位并聚焦于孤立的囊肿（图 5A）。使用操纵杆移动平台 x 和 y 位置，并根据需要在 z 轴上移动的精细/路线调整（图 3D）。
h.返回到融合。在“活动通道”窗口中的下拉列表（箭头 4）中，选择明场相机并按实时模式（图 4B，箭头 6）。将曝光时间调整为 100毫秒（箭头 4 下面），然后按自动对比度调整对比度（图 4B，箭头 7）。如果需要，拍摄图像（图 5A）（图 4B，箭头 10）。
i.将目标切换到显微镜窗口上的 63 ×水浸（图 4A，箭头 3），并从活动通道下拉列表中选择明场眼（箭头 4）。走到显微镜前，轻轻提起载玻片/培养皿支架，在物镜上滴一两滴双蒸水，然后将培养皿支架放回原来的位置（图 3D，F）。请注意，在较长时间的成像过程中（>4 小时），物镜上的水往往会蒸发。使用明场和目镜，寻找正在进行胞质分裂的包囊或可能在接下来的 10-15 分钟内进行减数分裂胞质分裂的精母细胞。前期/中期精母细胞在明场中通常有一个圆形核（图 5B、C）。前期精母细胞具有均匀分布的mCherry 细胞核中的fascetto （图 5E，F）（视频 5）。在中期，核膜破裂/穿孔；结果， mCherry fascetto从细胞核易位到细胞质（视频 5）。后期细胞通常呈椭圆形，细长的细胞核被梭旁膜包围（图 5G，H）。

图 4. Andor 转盘共聚焦显微镜上的延时成像。 Andor Fusion 软件 (2.3.0.48) 工作站显示采集控制、通道管理器窗口 (A) 和协议管理器窗口 (B)。

j.多场窗口上标记感兴趣的囊肿位置（图4B，箭头12和16）。查找最多 2-4 个囊肿位置并将其添加到多视野窗口中。
k.返回 Fusion 软件，从活动通道菜单（图 4A，箭头 4）切换到明场相机（BFC）/差分相间模式（DIC），然后按实时模式（图 4B，箭头 6）。使用操纵杆将感兴趣的囊肿定位并定位到视野中心，并更新多位置设置中每个感兴趣的囊肿的坐标（图 4B，箭头 16，箭头）。
l.从明场相机模式切换到共焦预览模式（从图 4A 中的下拉菜单箭头 4 中选择）并选择适当的激光通道。将激光功率调整在 0.2% 和 2% 之间，曝光时间范围从 50 到 300毫秒，以可视化囊肿中的荧光（箭头 4）。通过设置最小值 (100) 和最大值 (150) 来调整贴图通道窗口中的对比度（图 4B，箭头 8 和 9）。
m.在实时模式下，使用显微镜上的微调来扫描 Z 平面并确定每个感兴趣囊肿的起始 z 位置；在 z 扫描设置菜单中将其设置为“0”（图 4B，箭头 15），并在多位置窗口中更新它（箭头 16，箭头）。将感兴趣的激光通道添加到协议通道（图 4B，箭头 13）；本例中选择共焦 488 和共焦 561 通道（图 4B，箭头 13）。从活动通道下拉菜单中选择各个协议通道，并调整其激光功率和曝光时间。例如，在我们的实验中，488 激光功率设置为 5%， tGPH 的曝光时间设置为30 ms 。同样， mCherry的561 激光功率设置为 10%，曝光时间设置为 30 ms 法塞托。
n.转到时间重复窗口（图 4B，箭头 14）并设置延时成像以每 2 分钟捕获所有位置的 Z 堆栈 120 次（或您感兴趣的任意次数）。
o.转到 Z 扫描设置（图 4B，箭头 15）并将 Z 扫描厚度设置为 41 μm ，光学切片步长设置为 0.5 μm 。
p.最后，转到运行协议窗口并按采集按钮（图 4B，箭头 17）开始成像。可以通过图像窗口中的选项以 3D 形式查看实时数据，也可以以 2D 形式查看各个通道（图 4B，箭头 18 和 19）。
q.在上述条件下，我们能够同时对三个独立的囊肿进行长达 4 小时的成像，而不会造成严重的光毒性。

图 5. 进行减数分裂胞质分裂的雄性种系包囊的鉴定。 (A) 孤立囊肿的低放大倍数明场图像 (10 × )。 (B, C) 可能进行细胞分裂的精母细胞的高放大倍率 (63 × ) 的明场图像。注意前期（B）具有特征性圆形核的精母细胞和中期具有伸长核的精母细胞，如箭头（C）所示。 (D, F) 前期精母细胞囊肿的荧光图像，显示 Grp1 的 GFP 标记的pleckstrin同源结构域，该结构域与磷脂酰肌醇 3,4,5 三磷酸 (PIP3) 结合，并定位于质膜，在微管蛋白启动子（绿色）和中心纺锤体的控制下表达带有mCherry标记的结合蛋白fascetto ，在泛素启动子（红色）的控制下表达。请注意， mCherry-fascetto均匀分布在前期精母细胞的细胞核中，并且随着细胞进入中期， fascetto易位到细胞质。结果，净荧光因fascetto的扩散而减少（箭头）。 (GI) 经历胞质分裂的精母细胞的明场图像。 (G) 后期精母细胞显示整体细长的细胞形状和纺锤体包膜，称为围绕分离染色体的梭旁膜（箭头）。 (H) 末期早期的精母细胞显示出卵裂沟（箭头）。 (I) 由于胞质分裂不完全，末期后期的精母细胞通过细胞质桥保持相互连接（箭头）。

视频 5. 成年果蝇睾丸减数分裂 I 和减数分裂 II 胞质分裂的离体实时成像。 Grp1/Step ( tGPH ) 的 GFP 标记 PH 结构域和mCherry标记的fascetto ( feo ) 普遍表达。使用 63 ×水浸物镜进行实时成像，AOI 为 1024 × 1024，每隔 3 分钟重复 100 次。此处显示的视频表示 10 帧/秒。

B.成人睾丸减数分裂胞质分裂的离体活细胞成像

本节中描述的协议重点是整个成人睾丸的离体成像；然而，我们相信这种方法可以适用于所有发育阶段的睾丸和其他组织类型，例如幼虫大脑。
1.准备用于成像的透气膜盘
a.取 50 mm Lumox ®培养皿并将其倒置，使其平坦的膜底座朝上（图6 C）。
b.将SecureSeal成像垫片贴纸放在平膜底座上（图 6D）并将其放在一边。
2.成人睾丸的解剖
有关如何解剖成人睾丸的说明，请参阅 A1 部分和图 2A–H 以及视频 2。用于解剖的显微镜设置如图 6A 和 B 所示。
3.将成人睾丸安装在透气膜盘上
a.使用预切和预湿的移液器吸头，吸出 2-3 对解剖的睾丸，并分配在间隔井的中心，如图 6E 所示。
b.轻轻地将盖玻片放在垫片井上的睾丸上，不要产生气泡（图 6F）。
c.使用镊子，轻轻地在盖玻片周围均匀施加压力（图 6G）。
d.使用 Kimwipe 小心地去除盖玻片和培养皿膜之间的多余介质（图 6H）。请注意，盖玻片周围的多余介质会产生问题，特别是在使用水浸物镜时，因为水往往会通过毛细管作用进入盖玻片和皿膜之间的空间。

图 6. 成年睾丸中雄性减数分裂胞质分裂的离体实时成像。 (A) 用于解剖目的的蔡司SteREO Discovery V12 显微镜。 (B) 显示解剖所需的工具，其中包括一对镊子、一对带针的持针器和 9 孔 Pyrex 玻璃板。 (C) 50 mm Lumox盘的倒置视图，显示透气膜表面朝上。 (D) SecureSeal成像垫片贴纸固定在透气膜上（孔直径 8-9 毫米，深度 0.12 毫米）。 (E) 将两对睾丸安装在一滴 M3 介质 (20–30 mL) 中。 (F) 轻轻放置盖玻片，不要产生气泡。 (G) 轻轻地在盖玻片上的孔周围施加压力，使多余的介质从孔中流出，盖玻片牢固地附着在垫片表面上。 (H) 用 Kimwipe 轻轻去除盖玻片周围多余的介质。 (I) Andor 转盘与 Leica DMi8 显微镜底座共焦。 (J) 显微镜载物台显示载玻片/培养皿支架和 63 ×水浸物镜上的一滴去离子水 (50–100 mL) （箭头）。 (K) 将 50 mm Lumox盘放在载玻片/盘支架上，盖玻片面向物镜并用滑块锁定。 (L) 将聚光镜臂推回到其位置，并使用明场，定位并聚焦于正在进行减数分裂的精母细胞囊肿。

4在旋转圆盘共聚焦显微镜上对成人睾丸进行成像
a.将一滴水放在共焦显微镜的 63× 水浸物镜上（图 6I-J）。
b.将 50 mm Lumox盘安装在幻灯片/培养皿支架中，盖玻片面向目标并锁定盘（图 6I-L）。
c.使用明场，重点关注睾丸的位置 3（图 1A），并识别可能发生胞质分裂的囊肿，如 A4i 节中所述 [例如，在明场中，前期精母细胞核呈圆形（图 5B 和 C）]。识别后，按照 A4 节所述设置图像采集。请注意，在整个成年睾丸中，囊肿往往会显着移动（视频 5）；然而，在 Zyla 窗口中将感兴趣区域 (AOI) 增加到 2048 × 2048（图 4A，箭头 5，箭头）或将物镜更改为较低的放大倍数将减少减数分裂囊肿脱离成像框架的机会（视频 6）。
d.Lumox培养皿可重复使用多次。将盖玻片和睾丸从Lumox培养皿中取出，将培养皿浸入去离子水中并冲洗，然后用 70% 乙醇擦拭表面。

视频 6. 成年果蝇睾丸减数分裂 I 和减数分裂 II 胞质分裂的离体实时成像。 Grp1/Step ( tGPH ) 的 GFP 标记 PH 结构域和mCherry标记的fascetto ( feo ) 普遍表达。使用 63 ×水浸物镜和预定义的感兴趣区域大小 2048 × 2048 进行实时成像，每隔 3 分钟重复 140 次。此处显示的视频表示 10 帧/秒。

数据分析

1.图像处理
a.Andor Fusion 将数据保存在指定文件夹中的Imaris图像文件 (.ims )中。双击图像打开Imaris软件（需要许可证）。
b.当时间序列图像在具有 3D 视图的Imaris上打开时，通过设置每个通道的最小/最大值（例如，最小 100，最大 150）来调整亮度/对比度（编辑→ 显示调整）。要裁剪时间序列以删除任何未采集的时间点或修剪整个时间序列：编辑→裁剪时间→在弹出窗口中输入开始和结束时间点→ 好的→ 节省）。同样，要修剪 Z 切片，请转到“编辑” → 删除切片→在弹出窗口中输入要删除的切片→ 好的 → 节省。要合并两个时间系列，请打开第一个图像系列，然后转到“编辑” → 添加时间点→在弹出的浏览器窗口中选择second.ims文件并输入。要裁剪时间序列的 3D 体积，请转到编辑→裁剪 3D →在弹出窗口中选择要裁剪的区域→确定 → 节省。
c.要将时间序列图像保存为视频，请按录制按钮（3D 视图中时间滑块左侧的红色按钮）。将出现一个弹出窗口；选择 10 帧/秒和 H264 视频 (*.mp4) 格式。
d.要在 ImageJ/FIJI 中进一步处理时间序列，请按录制按钮→在弹出窗口中选择 10 帧/秒和原始视频 (*.avi )文件格式并保存。

2.测量不同时间点的卵裂沟直径
a.在 ImageJ/FIJI 上打开 Raw Video.avi 文件（图 7A）。
b.要设置比例尺，请使用直线/分段或手绘线或箭头工具在图像比例尺顶部绘制一条直线（图 7A），然后转到分析→ 设置比例 →在弹出窗口中输入已知距离和长度单位（例如，“um”代表微米） → 好的。
c.识别要确定其卵裂沟直径的减数分裂精母细胞。使用直线工具，在细长精母细胞的赤道区域画一条线，其中中心主轴将组装（图7B，C）并进入分析  测量（在弹出窗口中，将显示沟槽的长度，图 7D）。对每个时间点重复长度测量，直到乳沟达到最小值。测量来自三个独立囊肿的至少三个减数分裂精母细胞的沟长度。
d.使用 XY、柱和 Prism 9 中的统计分析绘制卵裂沟长度/直径作为时间的函数。我们以Dynasore和 DMSO 处理的精母细胞囊肿为例，并确定卵裂沟直径作为时间的函数，如图7E、F所示。

图 7. 不同时间点卵裂沟直径的测量。 (A) Fiji/ImageJ 软件，显示直线工具。 (B、C) 在经历胞质分裂的精母细胞赤道区域绘制直线（黄线）的示例图像（用箭头显示）。 (D) 显示视频前五个时间帧的长度测量结果示例。 (E) 用单独的载体 (DMSO) 或内吞作用抑制剂Dynasore (80 μM )处理的精母细胞中卵裂沟直径随时间变化的比较。数据代表来自三个独立囊肿的六个精母细胞的长度测量值。 (F) 单个时间点（40 分钟）的沟直径比较。图中的每个点代表囊肿中正在进行胞质分裂的单个精母细胞。来自三个独立囊肿的精母细胞用于分析。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.体外和离体实时成像协议可应用于幼虫和蛹睾丸。
3.成像过程中浸没物镜上的水往往会变干。当成像超过 4 小时时，暂停采集，向物镜中添加一滴水，然后恢复采集。然而，在此过程中应特别注意防止囊肿移动。
4.雄性生殖系囊肿的移动设置了该协议的局限性之一，因为它们不附着在盖玻璃底盘上，并且往往会脱离成像框架。频繁监控图像采集可能有助于防止这种可能性。
5.解剖的生殖系包囊对光毒性敏感，使用较高的激光功率（> 20％，较长的曝光时间> 50 ms ）可能会引起对照精母细胞的细胞因子缺陷。因此，对荧光信号较弱的样品进行成像将是一个挑战。此外，超过 6 小时的囊肿成像将是一个问题，因为介质中的水往往会蒸发并凝结在盖子表面。结果，培养基成分的净浓度将发生变化，进而可能影响胞质分裂。
6.培养基条件极大地影响胞质分裂过程中种系包囊的行为。如果培养基太旧（解冻等份后超过 2 周），请勿使用。在继续治疗条件之前测量对照囊肿的细胞因子效率。
7.与解剖的种系囊肿相比，完整的成年睾丸对光毒性的敏感性相对较低。因此，对于荧光信号较弱的样品，将选择对成人睾丸进行整体成像；对于具有强荧光信号的样本，可以进行更长时间的成像（我们能够对睾丸进行长达 7 小时的成像，而不会造成任何损坏，请参见视频 6）。另外，如果样本量较小，也是可以选择的；例如，有<5只雄性果蝇可用于研究胞质分裂。然而，由于睾丸肌肉收缩而引起的囊肿的显着移动将是一个限制。这个问题可以通过增加图像帧尺寸（2024×2024）来覆盖更大的成像区域来解决。
8.不能对含有黄色素细胞的野生型睾丸进行离体实时成像。然而，可以从这些睾丸中解剖单个生殖系囊肿并进行体外成像。

故障排除

问题 1：解剖后的睾丸在媒体中看起来异常。
可能的原因：介质 pH 值或渗透压可能不是最佳的，或者介质可能太旧。
解决方案：确保在培养基制备过程中添加碳酸氢钾。在用于解剖之前，解冻新鲜的等份培养基并将其加热至室温。

问题2：种系囊肿计数低。
可能原因：用老苍蝇进行解剖；使用较少数量的睾丸；或者睾丸的肌鞘没有完全撕开。
解决方案：使用新封闭的苍蝇（<24小时）进行睾丸解剖，增加睾丸数量（15-20对），并确保睾丸的肌鞘完全撕裂以释放所有囊肿。

问题 3：睾丸或种系囊肿附着在移液器吸头壁上。
可能的原因：移液器吸头未用含有 10% FBS 的 M3 介质预润湿。
解决方案：在抽吸睾丸或种系囊肿之前，用 M3 介质预湿移液器吸头。

问题 4：囊肿在盖玻片底皿中散开。
可能的原因：盖玻片底部培养皿观察区域中的介质不是最佳的，或者从解剖区域转移到共焦成像阶段时培养皿过度搅拌。
解决办法：确保观察区域的介质水平平坦（不应凸或凹）。在我们的实验中，面积为Ø 15 mm的盖玻璃底皿需要大约 150–200 μL的介质。一旦囊肿被安装在盖玻片底皿中，要格外小心以防止过度移动。例如，轻轻地将培养皿放入小托盘中，然后缓慢行走，同时将其运送到显微镜进行成像。当所有包囊都保留在中心时，所需的时间会少得多，并且会增加发现正在进行胞质分裂的包囊的机会。

问题 5：成像时囊肿移动。
可能的原因：显微镜载物台振动过度或培养皿中的介质液位过高。
解决方案：确保共焦显微镜单元位于防震台上；成像时避免触摸显微镜；确保培养皿观察区域的介质水平平坦（请参阅问题 4）。

问题6：难以发现正在进行胞质分裂的囊肿。
可能原因：从 2 天以上的果蝇睾丸中分离出包囊；或使用少量睾丸进行解剖；或囊肿计数低；或者囊肿散布在盖玻片底皿中。
解决方案：使用新封闭的苍蝇（<24小时）来解剖睾丸；增加睾丸数量（15-20 对）；吸取和分配囊肿时，确保移液器尖端已预湿；确保囊肿保留在培养皿的中心。

问题 7：在对照精母细胞中观察到细胞动力学缺陷。
可能原因：介质出现问题；媒体太旧了；使用聚-L-赖氨酸涂覆的盖玻璃底皿；使用更高的激光功率进行成像。
解决方案：确保按照说明准备 M3 介质；丢弃旧培养基并从冷冻等分试样中制备新鲜的培养基；确保盖玻片底皿未经过高浓度聚 L-赖氨酸处理；降低成像激光功率（最好保持在 10% 以下）。

体外对整个成人睾丸进行成像时，睾丸的肌鞘移动很多。
可能的原因：睾丸未正确安装在透气盘上；盖玻片周围介质太多，并且浸没物镜上的垫片或水进入盖玻片和膜之间的空间。
解决方案：确保盖玻片牢固地固定在垫片上，并清除盖玻片和膜周围多余的介质。通常情况下，新封闭的果蝇的睾丸肌肉往往比 2-3 天大的果蝇更收缩。如果问题仍然存在，最好对 2-3 天大的果蝇的睾丸进行成像测试。然而，在年老的果蝇中，经历胞质分裂的包囊比新封闭的果蝇要低。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•昆杜里等人。（2022）。通过内吞途径将神经酰胺磷酸乙醇胺脂质递送至卵裂沟对于雄性减数分裂胞质分裂至关重要。 PLOS BIOLOGY（图 4，面板 C、D）。

致谢

我们感谢 Valentin Magidson（NCI-Frederick 光学显微镜和分析实验室工作人员）在 Andor 转盘共聚焦显微镜成像方面提供的技术援助。这项研究由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院、卫生与公众服务部的校内部门资助。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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补充资料

这下列的支持信息能是下载的这里：
1.数字 S1：圆形的精子细胞从荒野类型和神经酰胺磷酸乙醇胺合酶（ CPES ）突变体睾丸