材料与试剂

细胞系

1.BJ-5ta 人包皮成纤维细胞 (HFF) 细胞 (ATCC CRL-4001)
2.刚地弓形虫Prugniaud-tdTomato （Chtanova 等，2008）或任何其他囊原菌株
3.KD3 成肌细胞（Shiomi 等，2011）或具有类似特性的其他永生化人类肌原细胞系
注意：我们知道文献中描述了四种人类永生化肌源细胞系（及其衍生物）（Zhu et al., 2007; Shiomi et al., 2011; Thorley et al., 2016; Massenet et al., 2020）。这里使用的 KD3 细胞最初是从 N. Hashimoto 获得的。有关 KD3 细胞的询问请联系 Tohru Hosoyama 博士，他是日本爱知县大部市盛冈町 7-430 号国家老年病学和老年学中心老年科学研究中心肌肉骨骼疾病科 (toruhoso@ncgg) .go.jp）。完成 MTA 后，细胞可能会在欧洲从作者处获得，或在美国从阿尔伯特爱因斯坦医学院的 L. Weiss 博士获得， 1300 Morris Park Avenue, Forchheimer Building, Bronx, NY 10461, USA (louis.weiss@einsteinmed.edu)。 LHCN-M2 细胞（Zhu 等人，2007）可从 Evercyte 购买。来自 Massenet 等人的细胞。可以从各自的作者处获得。

试剂

1.Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)（Gibco Life Technologies，目录号：12800-082）
2.葡萄糖（Carl-Roth，目录号：X997.2）
3.L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
4.丙酮酸钠（Capricorn Scientific，目录号：NPY-B）
5.青霉素/链霉素（Capricorn Scientific，目录号：PS-B）
6.牛血清，热灭活，铁强化（Capricorn Scientific，目录号：CS-IF-1A）
7.胎牛血清，热灭活（Capricorn Scientific，目录号：FBS-12A）
8.胎牛血清，热灭活低内毒素（Capricorn Scientific，目录号：FBS-LE-12A）
9.Ultroser ® G（Cytogen，目录号：15950-017）
10.供体马血清（Capricorn Scientific，目录号：DHS-1A）
11.人重组胰岛素（PAN-Biotech，目录号：P-2701001）
12.赖脯胰岛素（赛诺菲，目录号：12910612）
13.人全转铁蛋白（Sigma，目录号：TO665）
14.Na 2 SeO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：214485）
15.RPMI 1640 pH 7.4（含有 4 mM L-谷氨酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：R1383）
16.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
17.DMSO（AppliChem，目录号：A3672）
18.来自鼠尾的胶原蛋白 I（康宁，目录号：354236）
19.氯化钠（默克目录号：1.06404）
20.KCl（默克，目录号：1.04936）
21.KH 2 PO 4 （默克，目录号：1.04877）
22.Na 2 HPO 4 · 2H 2 O（Merck，目录号：1.06580）
23.乙酸（Carl Roth，目录号：3738.4）
24.0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA（Capricorn Scientific，目录号：TRY-1B10 ）

媒体和解决方案

1.70%乙醇灭菌
2.HFF 生长培养基（参见配方）
3.速殖子培养基（参见食谱）
4.成肌细胞生长培养基（参见食谱）
5.成肌细胞分化培养基（参见食谱）
6.囊肿培养基（参见食谱）
7.冷冻介质（参见食谱）
8.鼠尾胶原蛋白 I 型（参见食谱）
9.1× PBS 中的胰蛋白酶-EDTA 溶液（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）
10.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）
注意：所有介质必须是无菌的。

材料

1.带过滤盖的 T-25 或 T-75 细胞培养瓶（TPP，目录号：90026 或 90076）
2.微量滴定板 6 孔或 96 孔（TPP，目录号：92006 或 92048）
3.15 mL 和 50 mL 锥形离心管（TPP，目录号：91015 和 91050）
4.1.5 mL 冷冻管（Nalgene，目录号：5000-1020）
5.移液器吸头 [10、200、1,000 µL（各种品牌）]
6.无菌注射器过滤器（0.22 μm）（TPP，目录号：99722）
7.C-Chip 一次性血细胞计数器（NanoEnTek Inc.，DHC-N01）或 Neubauer 血细胞计数器
8.注射器（20 mL）（Luer Lock，Injekt，目录号：4606736V）
9.钝插管（27 G）（ Sterican ，目录号：9180117）
注：给出了供应商/制造商的示例；其他人的类似材料可能也会有效。

食谱

1.HFF生长培养基
DMEM pH 7.2（含 3.75 g/L NaHCO 3 、25 mM 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠），辅以 1×青霉素/链霉素和 10% 牛血清。储存于 4°C。

2.速殖子培养基
HFF 生长培养基，但仅含 1% 胎牛血清。储存于 4°C。

3.成肌细胞生长培养基
DMEM pH 7.2（含 3.75 g/L NaHCO 3 、25 mM 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠），辅以 1×青霉素/链霉素、20% 胎牛血清和 2% Ultroser ® G。储存于 4°C。

4.成肌细胞分化培养基
DMEM pH 7.2（含 3.75 g/L NaHCO 3 、25 mM 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠），辅以 1×青霉素/链霉素、2% 供体马血清、10 µg/mL 人重组胰岛素（或者，赖脯胰岛素）、5 µg/mL 人全转铁蛋白和 10 nM Na 2 SeO 3 。储存于 4°C。
注意：根据文献，较低浓度的胰岛素也可能有效。

5.囊肿培养基
RPMI 1640 pH 7.4（含 4 mM L-谷氨酰胺），补充 5 mM 葡萄糖、1×青霉素/链霉素、50 mM HEPES、2% 供体马血清、10 µg/mL 人重组胰岛素（或者赖脯胰岛素）、5 µg/mL 人全转铁蛋白和 10 nM Na 2 SeO 3 。储存于 4°C。

6.冷冻介质
90% 热灭活胎牛血清低内毒素和 10% DMSO。储存于 4°C。

7.鼠尾胶原蛋白
来自大鼠尾部的胶原蛋白 I 以 0.1 mg/mL 的储备浓度溶解在 100 mM 乙酸中。使用 1:6.67 的水。储存于 4°C。
8.1×胰蛋白酶-EDTA溶液
PBS 中的 0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）

9.不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
MilliQ 水补充有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH 2 PO 4和 6.5 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O，pH 7.4。

设备

1.加湿CO 2细胞培养箱，36.7 °C，10% CO 2 （Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 150i CO 2培养箱）
2.培养箱，36.7 °C，环境 CO 2 （Binder 培养箱，型号：KB 240）
3.用于 BSL-2 工作的安全柜（Luft- und Reinraumtechnik GmbH，型号：BDK S1200 层流工作台）
4.37 °C 水浴（Memmert GmbH & Co. KG，型号：WNB 14）
5.可调节微量移液器 2–20 µL、20–200 µL、100–1,000 µL（Eppendorf GmbH，型号：Research Plus 微量移液器）
6.血清移液器的移液辅助装置（Brand GmbH，型号：Accu-Jet Pro 移液器）
7.真空吸引器系统，Integra Biosciences Vacusafe Comfort 吸引系统（Integra，型号：10590273）
8.具有相差、微分干涉对比或类似光学器件的倒置光学显微镜（尼康，型号：Eclipse Ts2 倒置显微镜）
9.带水平转子和制冷功能的离心机（Hettich GmbH & Co. KG，型号：Rotina 380R 离心机 1706）
10.CoolCell LX 细胞冷冻瓶容器（Fisher Scientific，Corning，目录号：15572771）或类似的冷冻容器
11.冰箱 4 °C（AEG，型号：RTB415E2AW）
12.-20 °C 冷冻柜（利勃海尔，型号：Mediline LGex 3410）
13.-70℃冷冻柜（SANYO，型号：VIP系列MDF-U53V超低温冷冻柜）
14.液氮储存能力
注：给出了供应商/制造商的示例；其他人的类似材料可能也会有效。

程序

程序和注释的一般描述
生成成熟弓形虫包囊涉及三个步骤（图 1）：（i）建立 KD3 成肌细胞培养物，（ii）将这些细胞分化为 KD3 肌管，以及（iii）用速殖子和寄生虫与缓殖子的分化。我们还建议进行实验来确认包囊的成熟。

图 1. 协议步骤概述。 (A)体外培养的时机弓形虫包囊。 KD3 成肌细胞被接种到所需的细胞培养容器中。当它们达到最大汇合度 50% 时，就会诱导分化。五天后，细胞出现更长的管状多核细胞，这是肌管阶段的标志。肌管被囊原性弓形虫寄生虫感染。在 CO 2耗尽的四个星期内，速殖子分化为缓殖子并成熟为体外包囊。 (B) 同一文化在相关发展阶段的代表性图片。普鲁尼奥寄生虫表达红色荧光蛋白 tdTomato。比例尺表示 100 µm。

(一)成肌细胞培养
Shiomi 等人描述的程序。（2011）。 KD3 成肌细胞看起来与内皮细胞相似（图 2A），并且对热稍敏感（培养期间避免长时间高于 37°C 的温度）。在成肌细胞的维持过程中，必须保持主要培养物亚汇合（<70%），因为细胞与细胞的接触似乎充当分化为肌管的触发因素。在单层达到此密度之前，对细胞进行传代培养（分裂）。将培养基更换为不含镁和钙的温磷酸盐缓冲盐水。添加预热的胰蛋白酶-EDTA 溶液以覆盖单层，并将培养物在 36.7°C 下孵育直至细胞分离。通过添加成肌细胞生长培养基来终止胰蛋白酶化反应，并通过移液产生均质细胞悬浮液。此时，可以通过计数来确定细胞密度。将悬浮液分配到合适的细胞培养容器中，该容器可以任选地涂有胶原蛋白以增强肌管附着。不要将汇合度设定为低于 5%，因为这会抑制成肌细胞的生长。在 36.7 °C、5%–10% CO 2下孵育培养物。
由于即使在低汇合传代培养时也无法阻止细胞与细胞的接触，KD3 成肌细胞可能会无意中开始分化为肌管，并且培养物可能会表现出两种细胞类型的混合物（图 2C）。随着融合度的提高，我们经常观察到这一点；生长速度急剧下降，培养物变得不适合进一步使用。因此，培养物的可用传代数量在很大程度上取决于处理，我们建议监测与相应传代数量相关的细胞行为。一般来说，新鲜解冻的小瓶的传代次数不应超过 16 次。偶尔选择转基因的存在可能是可取的。这些细胞对 G418 (400 µg/mL) 和嘌呤霉素 (0.5 µg/mL) 具有抗性（Shiomi 等人，2011）。
KD3 成肌细胞的长期储存是在液氮冷冻介质中进行的。使用受控冷冻速率装置或异丙醇室以确保缓慢而稳定的温度下降。解冻时，在 37°C 水浴中快速解冻，用生长培养基替换冷冻培养基，并将细胞分配到细胞培养容器中。在 36.7 °C、5%–10% CO 2下孵育，直至培养物准备好进行继代培养。我们通常每 cm 2细胞培养容器使用 0.3 mL 的培养基。

图 2.不同阶段的 KD3 培养。 (A) 健康的 KD3 成肌细胞培养物位于右侧汇合处，用于肌管诱导。比例尺表示 500 µm。 (B) 分裂前允许的最大密度的 KD3 成肌细胞培养物。 (C) KD3 培养物处理不当或传代次数过多会产生成肌细胞和新生肌管的混合物。比例尺表示 100 µm。 (D) 诱导后五天的 KD3 肌管。比例尺表示 100 µm。

(ii) 成肌细胞分化
KD3 成肌细胞是在血清饥饿诱导下经历肌生成的祖细胞（Shiomi 等，2011）。生长培养基在汇合度为 20%–50% 时替换为成肌细胞分化培养基（图 2A）。细胞在五天内融合并形成多核管。通常，成肌细胞在融合前复制一两次（图 2B）。分化效率取决于成肌细胞培养物的一般效力和传代次数。

(iii) 速殖子感染和缓殖子成熟
一般来说，弓形虫的每种囊胞菌株都可用于感染，并且直接测试了 I 型、II 型和 III 型菌株产生 DBA 阳性和 SAG1 阴性囊肿的能力（Christiansen 等） ., 2022) .对于完全成熟的、类似体内的包囊培养物，我们建议使用 II 型或 III 型菌株。我们经常培养 Pru-Δhxgprt tdTomato （Chtanova 等，2008）菌株。此外，我们建议使用表达荧光蛋白的菌株来轻松监测囊肿的发育，因为使用明场或相差显微镜可能很难找到囊肿。使用最近从含有包囊的组织匀浆（Dubey，1998）或之前的体外包囊培养物中重新分化的速殖子菌株也是非常有益的，因为长期的速殖子培养物会导致分化效率低（ Colos-Arango 等人，2023）。
每cm 2表面积被7.2×10 3 个速殖子感染。培养物在 36.7 °C 和环境 CO 2浓度下孵育。环境CO 2水平限制寄生虫嘧啶生物合成的速率并促进阶段转换(Bohne和Roos，1997) 。感染后，需要每天监测培养物，并且每两到三天更换一次培养基。寄生虫阶段转换取决于肌管的质量和菌株的囊原性，并将在感染后立即开始。然而，如果寄生虫明显流出以防止速殖子培养物过度生长，则囊原性潜力降低的长期速殖子培养物可能需要额外的洗涤步骤。四个星期后，囊肿在功能上基本成熟（Christiansen et al., 2022）。
在整个实验过程中，肌管移动并改变其形状，这可能导致细胞脱离。此外，在整个培养期间，包囊不断增大，排出的缓殖子中会出现新的包囊，并且包囊也可能消散。

工作台协议
所有寄生虫和肌肉细胞处理均应在无菌层流 BSL-2 工作台中完成。

A.解冻 KD3 成肌细胞

1.在水浴中将成肌细胞生长培养基加热至 37°C。
2.用 70% 乙醇对层流 BSL-2 工作台的所有涉及表面进行消毒。
3.将含有冷冻 KD3 成肌细胞的冷冻管置于冰上。
4.在层流 BSL-2 工作台中，用温热的成肌细胞生长培养基填充 15 mL 离心管。
5.将冷冻管放入 37°C 温水浴中，直至冷冻细胞悬浮液的外层开始融化。
6.用 70% 乙醇对冷冻管进行灭菌。
7.在层流 BSL-2 工作台中，将细胞悬液从冷冻管转移至离心管。
8.将悬浮液在室温下以 500× g离心 5 分钟。
9.在层流BSL-2工作台中，打开离心管并弃去上清液。
10.轻轻地将颗粒重新悬浮在 15 mL 的成肌细胞生长培养基中。将悬浮液转移至带滤盖的 T-75 细胞培养烧瓶中（根据细胞密度选择烧瓶尺寸）。
11.在 36.7 °C、 5%–10% CO 2的加湿培养箱中孵育。
12.第二天，在显微镜下目视检查汇合和细胞粘附。

B.传代培养 KD3 成肌细胞

1.关键：在单层达到 70% 汇合之前，对成肌细胞进行传代培养。
2.将 PBS（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）和 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 的 PBS 溶液温热至室温。
3.将成肌细胞生长培养基在水浴中加热至 37°C。
4.用 70% 乙醇对层流 BSL-2 工作台的所有涉及表面进行消毒。
5.吸出培养基。
6.用至少 10 mL 预热的 PBS（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）清洗单层。
7.0.02 mL/cm 2胰蛋白酶/EDTA 添加到单层。
8.在 36.7 °C 下孵育并目视检查细胞是否脱落（约 2 分钟）。
9.添加足够的成肌细胞生长培养基以中和胰蛋白酶活性并通过移液混合悬浮液。将悬浮液转移至离心管中，并在室温下以500× g离心5 分钟。
10.丢弃含有胰蛋白酶的上清液，并添加成肌细胞生长培养基（每cm 2培养面积0.3 mL）。
11.可选：使用血细胞计数器测定细胞密度，并将胰蛋白酶处理的细胞离心并重悬于新鲜生长培养基中后，将每 cm 2培养面积 6 × 10 3 个细胞分配到所需的细胞培养容器中。
12.在 36.7 °C、 5%–10% CO 2的加湿培养箱中孵育。通常，两到三天后即可达到 70% 的融合。

C.冷冻 KD3 成肌细胞

1.关键：使用低传代数的培养物进行冷冻保存。
2.关键：在单层达到 70% 汇合之前冷冻成肌细胞。
3.将 PBS（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）和胰蛋白酶/EDTA 在 PBS 中平衡至室温。
4.在水浴中将冷冻介质加热至 37°C。
5.用 70% 乙醇对所有涉及的表面进行消毒。
6.丢弃介质。
7.用至少 10 mL 的 PBS（不含 Ca 2+和 Mg 2+ ）清洗单层。
8.0.02 mL/cm 2胰蛋白酶/EDTA 添加到单层。
9.在 37°C 下孵育并目视检查细胞是否脱落（约 2 分钟）。
10.添加冷冻介质以停止胰蛋白酶消化，并通过移液轻轻混合悬浮液。
11.在室温下以500× g离心细胞悬浮液5 分钟。丢弃含胰蛋白酶的上清液并添加成肌细胞生长培养基。
12.等分 75 cm 2细胞（大约 1.5–1.8 × 10 6 个细胞）。
13.将冷冻管放入冷冻容器中，并在-70°C 下冷冻过夜。
14.将冷冻管储存在液氮中。

D.KD3 成肌细胞分化为肌管

1.可选：在室温下用 15 μg/mL 大鼠尾胶原蛋白 I 型包被所需的细胞培养容器 1 小时。用 PBS 清洗 3 次或在层流 BSL-2 工作台中放置直至完全干燥。涂层塑料器皿可在 4 °C 下保存几周。
2.按照 B 部分步骤 1-10 的说明进行操作。
3.每 cm 2培养面积6 × 10 3 个细胞放入含有成肌细胞生长培养基的所需培养容器中。
4.在 36.7 °C、 5%–10% CO 2的加湿培养箱中孵育。
5.关键：目视检查融合度。在 20%–50% 单层汇合度时开始分化（通常在一两天后）。
6.在水浴中将成肌细胞分化培养基加热至 37°C。
7.用 70% 乙醇对所有涉及的表面进行消毒。
8.吸出生长培养基。确保用温 PBS 清洗细胞至少一次，完全去除成肌细胞生长培养基。
9.添加成肌细胞分化培养基。
10.在 36.7 °C、 5%–10% CO 2的加湿培养箱中孵育。
11.五天后，细胞融合并形成多核肌管。
12.可选：通过适当的染色方案（例如，肌球蛋白重链和细胞核的免疫荧光染色）确认细胞融合并计算生肌指数（Noë et al., 2022）。

E.KD3 肌管感染和囊肿成熟

1.使用标准程序将速殖子维持在 HFF 宿主细胞中（Khan 和 Grigg，2017）。
2.确定新鲜排出或注射器释放的速殖子悬浮液中的寄生虫计数。
3.每cm 2肌管感染7.2 × 10 3速殖子。在囊肿培养基中制备适当稀释的寄生虫悬浮液。
4.用囊肿培养基清洗肌管单层一次，然后应用寄生虫悬浮液。
5.关键：在 36.7 °C 环境 CO 2浓度的培养箱中孵育。
6.每隔两到三天轻轻更换囊肿培养基。在细胞培养容器中留下 25% 的体积，然后慢慢仅替换 75%，以避免单层细胞的扰动。
7.关键：使用倒置显微镜目视监测培养物。检查可能的速殖子过度生长、肌管分层或囊肿丢失（参见故障排除部分）。
8.四个星期后，培养物中含有成熟的包囊。
9.可选：为了诱导速殖子再分化，用速殖子培养基替换囊肿培养基，并在 36.7 °C、5%–10% CO 2的加湿培养箱中孵育。

协议验证

已知有几种标志物可以指示缓殖子的发育，包括蛋白质 BAG1、LDH2 和 p21 的存在，以及 SAG1 表面蛋白的缺失。包囊壁的形成可以使用针对CST1和CC2的抗体或双花豆凝集素(DBA)染色来监测(Yang和Parmley，1995；Gross等人，1996；Dubey等人，1998；Knoll和Boothroyd，1998；Gross等人，1996)。张等人，2001）。所有这些标记物在囊肿成熟的第一周内开始出现，并且已被证明即使使用基于成纤维细胞的方法也会出现。相比之下，功能性囊肿成熟需要更多时间。对胃蛋白酶、温度应激和药物的抵抗力以及口腔感染性在 14 天后逐渐出现，并持续发展到至少 28 天(Christiansen et al., 2022) 。通过将包囊暴露于高剂量乙胺嘧啶 (20 µM) 和磺胺嘧啶 (20 µM) 一周并监测再分化，可以轻松监测耐药性。

一般注意事项和故障排除

协议的应用

考虑到要研究的不同特征及其分析所需的规模，该方法在许多应用中都有帮助。虽然通过 DBA 染色观察到囊肿壁在分化的第一周内开始发育（Christiansen 等人，2022），但抗叶酸剂耐受性仅在四周后才完全形成。此外，在成熟的四个星期内，对胃蛋白酶消化的抵抗力不断增强。肌管是弓形虫的天然宿主细胞类型，因此可能提供比 HFF 等更相关的系统来研究寄生虫与宿主细胞的相互作用。
下游应用需要合适的包囊分离方案。我们对体外缓殖子进行了 LC-MS 驱动的代谢表征。为此，我们使用 DBA 和链霉亲和素包被的磁珠从注射器传代的感染 KD3 肌管中分离出组织囊肿(Christiansen et al., 2022) 。该分离过程可以在 4 °C 下进行，不需要洗涤剂、聚合物或其他与 MS 不兼容的化学品。
对于成像等其他应用，也可以使用percoll梯度分离完整的囊肿(Watts et al., 2017) 。使用胃蛋白酶（Dubey，1998）或胰蛋白酶消化（Jacobs 等，1960；Fu 等，2021）获得了单个缓殖子。酶处理可以直接应用于单层，并且可以提供在纯化之前去除未成熟的缓殖子的方法。
鉴于对新药和药物靶点的需求，过去几年药物发现领域的研究工作不断加强（Dittmar et al., 2016; Adeyemi et al., 2018; Spalenka et al., 2018; Han et al., 2018）。，2020）。然而，这些研究都没有将成熟的包囊纳入筛选过程。我们的方法可以适应适合药物筛选的 96 孔板格式。对缓殖子具有杀灭作用的化合物会阻止再分化的速殖子的再生长，这很容易通过荧光或噬斑测定来检测到。体外缓殖子以时间依赖性方式对抗叶酸剂和其他抗寄生虫药产生耐受性（Christiansen 等，2022）。
弓形虫缓殖子背景下使用小鼠。假设每项研究平均有 100 只小鼠，并且常规感染的小鼠数量未知，从而具有持续供应的组织囊肿，则总共有数千只小鼠。如果应用足够的像这样的体外系统，那么其中很大一部分可能会被替换。我们希望该协议鼓励社区在适当的情况下考虑其实用性而不是小鼠实验，从而为 3R 原则做出贡献。

该程序的局限性和进一步发展

改善肌管培养
体外条件下寿命较长。然而，我们偶尔会观察到肌管的丢失和形态变化，这可能会对包囊产量产生负面影响。感染和分离的肌管可能会通过更换培养基而被冲洗掉。这个问题可以通过使用各种方法改善宿主细胞与培养容器的附着来解决（Madden 等人，2015；Bettadapur 等人，2016；Denes 等人，2019；Martins 等人，2022）。最后，细胞衰老也可能对 KD3 细胞的最大传代次数造成限制，并且可以通过逆转素治疗来改善（Rajabian 等人，2023）。细胞培养箱温度波动引起的轻微热应激也可能诱导分化，需要避免（Yamaguchi 等人，2010）。需要测试这些策略中的任何一种是否能够改善体外囊肿的生成。

改善囊肿培养
需要健康、持久的肌管培养物，但不足以实现体外囊肿成熟。特别是，作为速殖子经过长时间传代的寄生虫菌株很容易在感染的第一周内过度生长（Colos-Arango 等人，2023）。调整感染的复数可以改善这个问题。理想情况下，用于体外的寄生虫应使用最近从受感染小鼠大脑中分离出来的缓殖子一代或以前的长期缓殖子培养物。
在 4 周的培养过程中，培养基更换 9-12 次，相关的剪切力可能会导致一些包囊的损失。一般来说，可以通过小心处理和尽量减少培养基更换来防止这种情况。我们尚未尝试恒化培养或自动移液系统（Pazdzior 和 Kubicek，2021）。它们可以在整个培养期间提供更稳定和可预测的环境，并可以减少大规模方法的劳动力。
囊肿成熟度可以通过与应用相关的多种测定来评估。迄今为止，还缺乏能够监测晚期（> 2 周）缓殖子标记表达的非常晚期的报告菌株。然而，组织包囊内的缓殖子被认为形成异质群体，因此可能表现出不同的蛋白质（Watts 等，2015）。所报道的来自受感染小鼠大脑中长达 5 个月大的缓殖子的蛋白质组数据集可以为构建此类报告菌株提供一个起点（Garfoot 等人，2019）。

减少动物成分并提高成本效益
为了满足3R原则并降低成本，最好减少动物实验的使用和细胞培养中动物源性产品的使用。特别是，本方案中使用的培养基配方中的血清成分可以被替换或减少。无血清培养基将小鼠 C2C12 细胞分别维持在成肌细胞和肌管阶段(Jang et al., 2022) 。特别是，对于人骨骼肌细胞分离物，也可以在无血清、补充 BSA 的培养基中诱导肌管形成（Rajabian 等人，2021）。这些血清减少策略对囊肿成熟的影响及其与体内的相似性然而，囊肿仍有待确定。

故障排除

KD3 成肌细胞未完全分化为肌管
KD3 成肌细胞解冻新瓶后最多可使用 16 代。然而，我们观察到，随着传代次数的增加，它们分化成肌管的潜力降低，并且肌管形成可能需要更长的时间。此外，血清饥饿可有效诱导肌管形成，并且必须完全除去高血清成肌细胞生长培养基。成肌细胞表现出分化成除肌管之外的其他细胞类型的潜力，例如脂肪细胞或骨细胞，具体取决于培养基成分（Shiomi等人，2011）。如果肌管的分化仅部分成功，并且例如囊肿培养物的后续处理涉及脂肪酸，则未定型的成肌细胞将分化为脂肪细胞。

KD3肌管单层有间隙
可能会发生肌管单层分层；不过，还没有达到阻碍的程度。分离的肌管簇可能会留下空斑和不完全分化的肌管。我们发现，当成肌细胞在肌生成诱导之前生长得太密集时，这种现象更为普遍。接种较少的成肌细胞或较早诱导肌生成。

寄生虫无法正确分化（速殖子过度生长）
感染后，寄生液泡正常形成，但速殖子的生长并未终止。寄生虫继续其裂解周期，从而使整个培养物过度生长。我们遇到过这种行为，特别是在实验室适应的菌株中。在某种程度上，在感染后第一周更彻底地清洗单层并降低速殖子接种量有助于避免过多的速殖子。如果最近从小鼠脑组织中分离出的寄生虫无法获得，则逐渐在体外进行对缓殖子的适应增强了它们形成包囊的能力。这些缓殖子可以直接用于感染，也可以重新分化为具有更高包囊形成能力的速殖子。建议生成合适的速殖子培养物的冷冻库存，以确保可靠且稳定的分化行为。如果上述措施无法避免寄生虫过度生长，药物抑制速殖子生长可能有助于使缓殖子成熟更长时间。在这种情况下，我们建议使用 10 nM 布帕伐醌（一种bc 1复合物抑制剂）。

囊肿数量不同
许多与宿主和寄生虫相关的可变因素影响该体外系统。相对较长的培养期放大了这些影响并导致包囊总数的显着差异。尝试尽可能一致地工作。确保成肌细胞传代数不太高，分化为肌管前成肌细胞汇合度不超过70%，单层无间隙，感染前虫体新鲜排出或通过注射释放，且虫体未被破坏。作为速殖子培养较长时间。在比较不同寄生虫菌株的缓殖子形成效率时，后者尤其重要。使用该方案和囊原性寄生虫菌株，可以从 T150 培养皿中获得大约 10 6 个囊肿（Christiansen 等人，2022）。成熟后，我们偶尔会观察到每个细胞有多个囊肿，但很少有感染细胞。

肌管与玻璃盖玻片分离
KD3 肌管可以在玻璃盖玻片上生长和感染，用于显微镜应用。我们观察到这些培养物中肌管脱离率增加。这可以通过在盖玻片上涂上大鼠胶原蛋白（见上文）、低水平的 Cell-Tak 或明胶来补偿。

致谢

我们感谢 Naohiro Hashimoto 最初分享 KD3 骨骼肌细胞，感谢 Tohru Hosoyama、Tadakimi Tomita 和 Louis Weiss 帮助我们向社区提供 KD3 细胞。我们感谢 Boris Striepen 提供菌株 Pru tdTomato。 MB 和 DM 部分由联邦教育和研究部 (BMBF) 资助，项目编号为 01KI1715，作为“人畜共患传染病研究网络”的一部分。 BC 获得了国际研究生院 IRTG 2290 的资助，该学院由德国研究委员会 (DFG) 共同资助。 DW 和 EDB 通过研究生院 GRK 2046 获得 DFG 的资助。EDB、FS 和 MB 还获得瑞士国家科学基金会 (SNSF) 的 NRP79 计划的支持，项目编号 407940。FS 是研究生院的高级成员GRK 2046 和 IRTG 2290。MB、DM、DW 和 FS 获得罗伯特·科赫研究所的内部支持。我们还感谢 Celine Christiansen（Christiansen et al., 2022）为建立 KD3 系统所做的贡献。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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