材料与试剂

生物材料

1.尖孢镰刀菌的DNA ， F. tricinctum 、 F. proliferatum 、 F. fujikuroi 、 F . graminearum 、 F. solani 、 F.Equiseti 、 Colletotrichum siamense 、 C. gloeosporioides 、 C. aenigma 、 C. fructicola 、 Botrytis cinerea 、 Phoma sp. 和Stagonosporopsis sp .。
2.草莓植株
3.土豆_

试剂

1.KOH（ SangonBiotech ，目录号：A610441）
2.聚乙二醇（PEG200）（ SangonBiotech ，目录号：A601780-0500）
3.EDTA二钠盐二水合物（ SangonBiotech ，目录号：A610185-050）
4.CTAB，十六烷基三甲基溴化铵（ SangonBiotech ，目录号：A600108-0500）
5.氯化钠（NaCl）（ SangonBiotech ，目录号：A610476-0001）
6.Tris（ SangonBiotech ，目录号：A610195-0500）
7.无水乙醇（ SangonBiotech ，目录号：A500737-0500）
8.异丙醇（上海胡氏，目录号：180109218）
9.三氯甲烷（上海胡氏，目录号：10006818）
10.葡萄糖（ SangonBiotech ，目录号：A610219-0500）
11.琼脂（ SangonBiotech ，目录号：A505255-025）
12.底漆和探针：
a.F91： 5′ - TCAACTGGCATCGTCAACATCACCGAAGTAA-3 ′
b.R91： 5 ′生物素-CCAGGCATGACGAAGTTGATAGGTTGAAAGC-3 ′
c.探针: 5 ′ 6-FAM-AGGCTCCCTCCTCGGTAACGAAGTCCGCTCCA/ idSp /GTTTGACAGCACATT-3 ′ C3 间隔子

解决方案

1.CTAB提取液（参见配方）
2.70% 无水乙醇（参见配方）
3.60% PEG200，pH 13.2–13.5（参见配方）
4.2 M KOH（参见食谱）
5.马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) （参见食谱）

食谱

1.CTAB提取液
*注：先将溶质混合，然后加入ddH 2 O至定容至 1 , 000 m L 。
试剂最终浓度数量或体积
CTAB
特里斯
乙二胺四乙酸
氯化钠
水分子_2%
100毫米
20毫米
1.4M
不适用20克
12.114克
7.448毫升
81.816克
至 1,000 毫升
全部的不适用1,000 毫升

2.70%无水乙醇
试剂最终浓度数量或体积
无水乙醇
水分子_70%（体积/体积）
不适用70毫升
30毫升
全部的不适用100毫升

3.2M氢氧化钾
*注意：储存于 4°C。
试剂最终浓度数量或体积
氢氧化钾
水分子_2M _
不适用1.12克
10毫升
全部的不适用10毫升

4.60% PEG200，pH 13.2–13.5
*注意：该溶液需要立即配制并使用。
试剂最终浓度数量或体积
氢氧化钾（配方 3）
聚乙二醇200
水分子_不适用
60%（体积/体积）
不适用0.33毫升
8毫升
11 .67 毫升
全部的不适用20毫升

5.马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)
使用电磁炉、平底锅和过滤器在 1,000 mL H 2 O中煮土豆。然后，将葡萄糖和琼脂添加到滤液中。
试剂最终浓度数量或体积
土豆
葡萄糖
琼脂
水分子_200克/升
20%
15%
不适用200克
20克
15克
1,000 毫升
全部的不适用1,000 毫升

实验室用品

1.1.5 m L微量离心管（ Axygen ，目录号：MCT-150-C）
2.HybriD DNA 恒温器快速扩增试剂盒（APWL，目录号：WLN8203KIT）
3.HybriDetect侧流试纸（APWL，目录号：WLFS8201）
4.镊子（上海雷谷，目录号：W-002903 ）
5.无菌刀片（VWR International，目录号：55411-050）
6.烧杯（上海镭谷，目录号：B-000103）
7.搅拌棒（上海雷谷，目录号：B-040315）
8.量筒（上海镭谷，目录号：B-031603）
9.玻璃瓶（上海镭谷，目录号：B-W00323）
10.90毫米培养皿（南通白药，目录号：YJ-90-12g）
11.接种针（上海雷谷，目录号：W-006001）
12.镊子（上海雷谷，目录号：W-002806）
13.石英砂（ SangonBiotech ，目录号：A500823-0001）

设备

1.微量移液器 0.1 – 2.5 µL、2 – 20 µL、20 – 200 µL（Eppendorf，型号：3123000217、3123000233、3123000250）
2.培养箱，25 ℃ （上海博讯，型号：MJX-250B-Z）
3.4 ℃冰箱（海尔，型号：SC-339JN）
4.研磨机（上海晶鑫，型号：JXFSTPRP-24L）
5.超微量蛋白质分析仪（ BioDrop ，型号： BioDrop µlite+）
6.离心机（ ThermoFisher ，型号：75002440）
7.温控器（杭州奥盛，型号：028-14484-20110001）
8.天平（上海浩盛，型号：JA303A）
9.电磁炉（美的，型号：RT21E0105）
10.潘（苏泊尔，型号：ST22P1）
11.涡旋摇床（生工生物，型号：WH-861）

软件和数据集

1.DNAMAN v6.0.3.99
2.Snapgene v.5.2.4

程序

A.引物和探针的设计

1.CYP51C基因的序列在镰刀菌属中是独特的且高度可变。因此，我们使用DNAMAN v6.0.3.99根据土壤和植物中常见镰刀菌属物种的CYP51C序列设计引物，例如F. tricinctum 、 F. proliferatum 、 F. fujikuroi 、 F. graminearum 、 F. solani 、和木贼镰刀菌。通过CYP51C基因序列找到尖孢镰刀菌的特异性序列，设计特异性引物（图1）。
2.推荐的引物长度介于 31和32bp 。较短的引物会影响扩增速度和检测灵敏度，而较长的引物会形成影响扩增的二级结构。引物对如下：
F91： 5′ - TCAACTGGCATCGTCAACATCACCGAAGTAA-3 ′
R91： 5′ - CCAGGCATGACGAAGTTGATAGGTTGAAAGC-3 ′
将生物素标记应用于筛选的下游引物R91的5 '端。加尾引物如下：
5 '生物素-CCAGGCATGACGAAGTTGATAGGTTGAAAGC-3 ' 。
3.探针设计为在 5 '端进行抗原标记（6-FAM）修饰，在 3 '端进行修饰基团（C3 Spacer），并在 5 '端中间标记dSpacer （四氢呋喃，THF）。 3 '末端作为NFO的识别位点。 C3 S起搏器是阻止 DNA 链延伸的阻断基团，FAM 是荧光团。核酸外切酶 NFO（缓冲液）识别dSpacer （四氢呋喃，THF）并将其切割以形成在 3 '端延伸的游离羟基端。最终得到5'FAM -RPA-3'Biotin的扩增产物。将生物素抗体和FAM抗体的金颗粒固定在LFD（T线）上，5'FAM - RPA-3 '生物素将被捕获并出现条带。
标记的探针如下：
5 ' 6-FAM-AGGCTCCCTCCTCGGTAACGAAGTCCGCTCCA/ idSp /GTTTGACAGCACATT-3 ' C3 间隔基。

图 1. Snapgene与镰孢菌的屏幕截图。基因组序列比较。在序列差异较大的位置设计特异性引物。红色框表示引物和探针的位置。

B.DNA提取

1.培养F. tricinctum 、 F. proliferatum 、 F. fujikuroi 、 F. graminearum 、 F. solani 、 F. equiseti 、 C. siamense 、 C. gloeosporioides 、 C. aenigma 、 C. fructicola 、 Botrytis cinerea 、 Phoma sp. 和Stagonosporopsis sp.。分离株，保存于4 ℃冰箱中，使用接种针接种于PDA平板中。 28℃培养至菌落直径达到6cm 。
2.将菌丝体刮入1.5 mL管中，加入0.1 g石英砂和300 μL CTAB提取液，在研磨机中以85 Hz研磨120 s。
3.添加 400 μL CTAB提取液，并使用涡旋振荡 15 s。
4.加入 700 μL三氯甲烷，涡旋振荡 15 s，13,800× g离心 10分钟
5.去除500 μL上清液并将其转移至新的 1.5 mL 管中。添加 500 mL 异丙醇并以 13,800× g离心10 分钟。
6.弃上清，加入500 μL 70%乙醇，13,800× g离心5 min。
7.弃去上清，倒置2 h，干燥，加入50 μL ddH 2 O，4 ℃保存。

C.引物和探针的特异性检测

1.设置反应系统如下：
缓冲液 A 29.4 μL
10 μM上游 F91 2 μL
10 μM下游 R91 2 μL
10μM _ 探针0.6μL _
ddH 2 O 11.5 μL
模板 DNA 2 μL
缓冲液 B 2.5 μL
缓冲区 B 需要最后添加。缓冲液 A 和缓冲液 B 随HybriD DNA 恒温器快速扩增试剂盒提供。
2.°C孵育10 分钟。
3.2 O将反应产物稀释 20 倍，并将 50 μL稀释的反应产物添加到HybriDetect LFD 的样品孔中。 5 分钟内即可获得测试结果的解释。如果5分钟内没有读取测试结果，则测试不成功。
4.如果控制线可见而检测线不可见，则意味着结果为阴性。如果检测线和对照线均可见，则表示结果为阳性。如果检测线和对照线都看不见，则说明实验操作错误或试剂盒损坏（图2）。

图 2. 引物对 F91/R91 和重组酶聚合酶扩增探针的特异性评估 - 侧流试纸 (RPA-LFD) 检测尖孢镰刀菌

D.RPA - LFD反应条件优化

1.根据试剂盒说明，将反应温度设置为33、36、39、42和45℃，反应时间设置为10分钟。
2.确定最佳反应温度后，将反应时间设置为4、6、8、10和12分钟。
3.按照上述方法可视化扩增结果。
4.根据检测线的颜色深度确定最佳反应条件（图3）。

图e 3 .优化尖孢镰刀菌重组酶聚合酶扩增-侧流试纸 (RPA-LFD) 检测。 (A) RPA 反应温度的优化（33、36、39、42、45、48 和 51 °C）。 (B) RPA 反应时间的优化（4、6、8、10、12 和 14 分钟）。

E.检测系统灵敏度验证

1.将 DNA 浓度设置为 10 ng/ μL 、1 ng/mL、100 pg / μL 、10 pg / μL 、1 pg / μL和 100 fg / μL 。使用超微计数蛋白质分析仪测定 DNA 浓度。
2.向反应体系中添加不同浓度的DNA模板。
3.39°C 孵育 8 分钟。
4.根据步骤 C3可视化扩增结果。
5.检测限由检测线的存在与否决定。

F.现场样品检测

1.取 100 mg 草莓冠组织（约 125 mm 3的冠组织）并置于 1.5 mL 管中。
2.添加 100 μL 60% PEG200 。
3.室温孵育 15 分钟以裂解植物组织并释放 DNA。
4.将裂解物上清液作为模板添加到 RPA 反应系统中。反应体系设置如下：
缓冲液 A 29.4 μL
上游 F91 2 μL
下游 R91 2 μL
探针0.6μL
ddH 2 O 11.5 μL
模板 DNA 2 μL
缓冲液 B 2.5 μL
缓冲区 B 需要最后添加。试剂盒随附缓冲液 A 和缓冲液 B。
5.39°C 孵育 8 分钟。
根据步骤 C3 可视化扩增结果。
6.如果对照线可见而检测线不可见，则表明草莓没有被尖孢镰刀菌感染。如果检测线和对照线均可见，则表明草莓已被尖孢镰刀菌感染（图4）。

图4.草莓冠腐病的症状和重组酶聚合酶扩增-侧流试纸（RPA-LFD）检测结果。 (a–a2) 具有冠腐病症状且检测结果呈阳性的植物。 (b–b2) 没有冠腐病症状且测试结果呈阳性的植物。 (c–c2) 没有冠腐病症状且检测结果呈阴性的植物。箭头所示的组织用于检测。

数据分析

1.引物和探针特异性的测定：
HybriDetect LFD检测线的有无来判断引物和探针的特异性。仅尖镰孢检测线可见和检测结果为阳性；其他基因组DNA未见检测线，检测结果为阴性（表1 ）。结果表明引物F91/R91和探针对尖孢镰刀菌具有良好的特异性。

表 1 RPA-LFD 检测的其他菌株结果
物种检测结果
尖镰孢+
F、三轮车-
F.增殖-
F·藤黑井-
F、草类-
茄镰刀菌-
F.马-
C.暹罗猫-
炭疽杆菌-
C、谜语-
果果红藻-
灰色灰霉病-
茎点霉属。-
鹿孢子属sp.-
“+”代表阳性结果，“ - ”代表阴性结果。

2.最佳反应条件的确定：
根据制造商的说明，确定最佳反应温度，反应时间为10 min。结果表明，最佳反应温度为39 ℃，最佳反应时间为8 min。
3.检测限的确定：
检测限由检测线的存在与否决定。 HybriDetect LFD在模板浓度为1 pg / μL时，检测线中仍有条带，我们得出RPA-LFD检测的检出限为1 pg / μL 。
4.RPA-LFD检测现场应用：
检测线的出现表明结果呈阳性，表明该植物感染了尖孢镰刀菌。

协议验证

胡等人。（2023）[7]。尖孢镰刀菌重组酶聚合酶扩增-侧流试纸（RPA-LFD）检测技术的建立。病害。（图4）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.RPA检测引物长度为31~32 bp；引物太短会影响扩增速度和检测灵敏度。
2.在阳性检测之前，先进行阴性检测，以排除由于引物探针造成的假阳性形成。
3.实验操作过程中应注意避免交叉污染。
4.HybriDetect LFD 控制线出现条纹时，此操作才有效。
5.混合检测 LFD 判读结果在 5 分钟内完成。

故障排除

问题1：引物和探针组合无法特异性检测目标真菌。
可能的原因：引物和探针的特异性差。
解决方案：需要重新筛选特异性引物，获得特异性引物后还需要筛选探针。

问题2：阴性对照检测线出现条带。
可能的原因：引物与探针本身结合。
解决方案：重新筛选引物和探针。

问题3：检测线颜色较弱。
可能原因：反应条件不理想，或者DNA浓度较低。
解决方案：优化反应条件并增加 DNA 浓度。

致谢

该研究得到杭州市农业与社会发展研究项目（202203A07）、贵州省研究院项目[110202101048（LS-08）]和浙江省重点研发计划项目（No.2020C02005）的资助。
这里描述的协议改编自我们之前的工作 [7]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1.哈桑，O. 和张，T. (2021)。韩国草莓冠腐病相关真菌物种的形态和分子特征。摩尔。生物。报告49(1)：51-62。 DOI：10.1007/s11033-021-06841-9
2.弗里曼，S. 和卡坦，T. (1997)。鉴定导致以色列草莓炭疽病和根坏死的炭疽菌属物种。植物病理学87(5): 516–521。 doi：10.1094/phyto.1997.87.5.516
3.加利福尼亚州莱维克 (2001)。植物病原体检测的分子方法——未来是什么？能。 J.普兰特。病理学。 23（4）：333-336。号码：10.1080/07060660109506953
4.曹X.，姚D.，周Y.，韦斯特，JS，徐X.，罗Y.，丁K.，范J.和段X.(2016)。空气中布鲁氏菌接种物的检测和定量格拉米尼湾sp。使用定量 PCR 检测小麦。欧元。 J.植物病害。 146（1）：225-229。号码：10.1007/s10658-016-0908-8
5.Phoulivong , S.、Cai, L.、Chen, H.、McKenzie, EHC、Abdelsalam, K.、 Chukeatirote , E. 和 Hyde, KD (2010)。胶孢炭疽菌不是热带水果上的常见病原体。真菌多样性44(1)：33–43。号码：10.1007/s13225-010-0046-0
6.Ghosh, DK、Kokane, SB 和 Gowda, S. (2020)。开发基于逆转录重组酶聚合酶的等温扩增结合侧流免疫层析测定 (CTV-RT-RPA-LFICA)，用于快速检测柑橘 tristeza 病毒。科学。报告10(1)：e1038/s41598–020–77692–w。 DOI：10.1038/s41598-020-77692-w
7.Hu, S.、Yan, C.、Yu, H.、Zhang, Y. 和Zhang, CQ (2023)。尖镰孢重组酶聚合酶扩增-侧流试纸检测技术的建立。植物病害107(9)：2665–2672。 DOI：10.1094/pdis-12-22-2841-re