材料与试剂

1.24孔板（Falcon，目录号：353047）
2.6 孔板（NEST，目录号：703001）
3.含有 EDTA-K2 的抽血管（Improve Medical，目录号：101680720）
4.12 × 75 mm 塑料管（Falcon，目录号：352052）
5.抗人γδTCR Ab（Beckman，克隆：IMMU510、IM1349）
6.人IL-7（研发系统，目录号：207-IL-005/CF）
7.RPMI-1640 培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R8758-500ML）
8.2-巯基乙醇（Gibco，目录号： 21985023 ）
9.无菌 PBS（ Sangon Biotech，目录号：E607008-0500）
10.胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
11.青霉素-链霉素液体（100×）（ Solarbio ，目录号：P1400）
12.台盼蓝（STEMCELL Technologies，目录号：07050）
13.Lympholyte®细胞分离介质（ Ficoll ）（ Cedarlane Laboratories，目录号：CL5020）
14.抗人IL-17A（ BioLegend ，目录号：512306，在本协议后面称为抗人IL-17）
15.抗人CD3（ BioLegend ，目录号：300328）
16.抗人γδTCR （ Miltenyi Biotec ，目录号：130-113-508）
17.抗人CCR6（ BioLegend ，目录号：353412）
18.活力染料（Invitrogen，目录号：65-0865-14）
19.GolgiPlug （Brefeldin A溶液1,000×）（ BioLegend ，目录号：420601）
20.佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Millipore Sigma，目录号：P8139）
21.离子霉素（Millipore Sigma，目录号：I0634）
22.人类信任染色 FcX TM （ BioLegend ，目录号：422302）
23.固定缓冲液（ BioLegend ，目录号：420801）
24.细胞内染色perm 10×洗涤缓冲液（ BioLegend ，目录号：421002，本协议后面称为洗涤缓冲液）

设备

1.CO 2培养箱（ Thermo Fisher Scientific，型号：3543 或 3111）
2.离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra® X -15R，目录号： 392934）
3.层流罩（赛特 Equipments Ltd，型号：EVL-5S，目录号： ZX0907-04 ）
4.流式细胞术（BD Bioscience，型号： FACSCanto TM II，目录号：338962）
5.移液器（多道，Eppendorf）

软件和数据集

1.FlowJo v10.8.1（BD Biosciences）

程序

A.准备食谱

1.制作完整的 RPMI-1640 介质：RPMI-1640 介质 + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素液体 + 2-巯基乙醇 (0.1 mL/L)。
2.制备用于包被的抗人γδTCR溶液：0.1 mg 人γδTCR Ab（克隆：IMMU510、IM1349）+ 500 μL PBS = 0.2 μg / μL人γδTCR Ab。
3.制作活性染料的工作原料：1 μL活性染料 + 49 μL PBS （活性染料：PBS = 1:49）。
4.制作1× 洗涤缓冲液：1 mL 10× 洗涤缓冲液 + 9 mL H 2 O（10× 洗涤缓冲液：H 2 O = 1:9）。

B.从外周血中分离PBMC（见注1）

程序 C 中用于人γδ T 细胞极化的 PBMC。
1.根据机构伦理和安全协议，从健康捐献者身上抽取外周血，并使用含有 EDTA-K2 的试管收集大约 15-20 mL的血液。
2.用等体积的 RPMI-1640 培养基稀释血液样本。
3.将稀释的血液悬浮液 (5 mL) 小心地分层在 15 mL 锥形管中的5 mL Ficoll上。
4.在室温下以 931 × g离心 15 分钟，无需制动。
5.小心地将单核细胞层转移到新的 15 mL 锥形管中 [单核细胞层是顶部血浆层和Ficoll层之间的白色层（图 1A）；颜色从上到下依次为淡黄、白色、透明、红色]。必须收集白色层。
6.用完整的 RPMI-1640 介质填充锥形管至 10 mL。
7.用手轻轻混合（上下混合）并在 4°C 下以 524 × g离心10 分钟。
8.通过移液小心地取出并完全丢弃上清液。细胞位于 15 mL 锥形管的底部。
9.用 5 mL 的完整 RPMI-1640 培养基清洗细胞。具体来说，将细胞重悬于 5 mL 完整的 RPMI-1640 培养基中，并在 4 °C下以 524 × g离心10 分钟。然后，通过移液完全去除上清液。
10.将细胞沉淀重悬于 5 mL 完全 RPMI-1640 培养基中，并在显微镜下使用血细胞计数器或使用台盼蓝染色直接计数细胞数（参见注释 2）。

C.体外极化

本节提供人类γδ T 细胞的极化步骤。
1.γδTCR Ab的 PBS 包被 24 孔板。请注意，需要在细胞分离和极化前一天对板进行包被。每孔加入 245 μL PBS，然后加入 5 μL 0.2 μg / μL 每孔加入抗人γδTCR Ab，最终浓度为 1 μg抗人γδTCR Ab/250 μL PBS。在 37 °C、5% CO 2培养箱中孵育过夜（18–24 小时）。
2.第二天从 24 孔板中吸出并丢弃包被抗体溶液（见注 3）。
3.从健康供体的外周血中分离 PBMC（程序 B），并用完全 RPMI-1640 培养基将程序 B 中制备的 PBMC 稀释至适当的浓度。
4.将 PBMC（每孔 1-400 万个，在含有 20 ng/mL 人 IL-7 的 1 mL 完全 RPMI-1640 培养基中）接种到已预先涂有抗人 γδTCR Ab的 24 孔板中。
5.每天在显微镜下检查细胞的状态以排除污染。健康的细胞会显得明亮（见注4）。如果细胞被细菌污染，培养基就会出现混浊。培养基 pH 值突然下降（培养基颜色变黄）也是污染的迹象。
6.根据板中细胞密度，在第三至第四天使用含有20 ng/mL人IL的完全RPMI-1640培养基将细胞转移并传代至新的6孔板（未包被抗人γδTCR Ab） -7。在板达到三分之二汇合之前转移并传代细胞（参见注释 5 ）。请注意， γδ T 细胞是悬浮细胞，可以通过吸移 1 mL 细胞培养基到 6 孔板的新孔中并添加 2 mL 含有 20 ng/的完全 RPMI-1640 培养基来进行细胞传代。将 mL 人 IL-7 注入该新孔中。
7.每天在显微镜下检查细胞的状态，以排除任何污染并确保细胞看起来健康（明亮）。
8.必要时使用含有 20 ng/mL 人 IL-7 的完整 RPMI-1640 培养基传代细胞。
9.将细胞培养 2-3 周（大约 4-5 代）。
10.通过移液吸取 1 mL 细胞培养基来收集细胞并对细胞进行 IL-17 细胞内细胞因子染色（程序 D）

D.数据采集与分析

该程序分析了极化后人γδ T 细胞产生的 IL-17。
1.GolgiPlug （终浓度：介质中的 1×）存在下，用 PMA（终浓度：50 ng/mL）和离子霉素（终浓度：1 μg /mL）刺激在程序 C 中极化的约 100,000 个细胞。总共250 µL 使用 24 孔板每孔完整的 RPMI-1640 培养基。
2.2培养箱中孵育 4-6 小时。
3.通过从 24 孔板的孔中移液将细胞悬液（T 细胞是非贴壁细胞）收集到 12 × 75 mm 塑料管中，并用 1 mL PBS 清洗孔（也通过移液收集）。
4.°C 、 524 × g离心 5 分钟，弃去上清液。
5.添加人源TruStain FcX TM （Fc受体封闭液，5 μL /测试）并在4 ℃孵育10分钟。
6.添加商业抗体进行表面染色，包括活力染料工作液（5 μL /测试）、抗人 CD3（5 μL /测试）、抗人γδTCR （3 μL /测试）和抗人 CCR6（5 μL /测试） /测试）根据说明。 4°C孵育30 分钟。
7.用 1 mL PBS 清洗细胞，并在 4 °C 下以524 × g （1,500 rpm）离心 5 分钟。
8.完全丢弃上清液。
9.添加 400 μL固定缓冲液并涡旋。
10.将细胞在室温下避光固定 20 分钟。
11.用 1 mL 的 1× 洗涤缓冲液洗涤细胞，并在 4 °C 下以524 × g离心5 分钟。
12.弃去上清液，再次用 1 mL 1× 洗涤缓冲液洗涤细胞。
13.524 × g离心 4°C 5 分钟，弃去上清液。
14.添加抗人IL-17抗体（5μL /测试）并在4℃下孵育过夜（参见注释6）。
15.用 1 mL 1× 洗涤缓冲液洗涤细胞，并在524 × g下离心 4°C 5 分钟。
16.弃去上清液并重新悬浮细胞。
17.FACSCanto TM II 流式细胞仪上采集细胞（参见注释 7 ）。
18.FlowJo软件分析数据（参见注释 8 和 9，图 1B、C 和 2）。

图 1.从外周血单核细胞 (PBMC) 中体外扩增人 γδT17。 A. 该协议的总体工作流程。 B. 扩增后人类γδ T 细胞的百分比。对CD3 +细胞进行门控。 C. 来自两个不同供体的人γδ T 细胞极化后产生 IL-17 。细胞以γδ TCR +细胞为门控。

极化前后外周血单核细胞 (PBMC) 的γδ T 细胞产生 IL-17 的分析。 A. 来自 PBMC 的原代γδ T 细胞中 IL-17 产生的代表性点图和汇总数据。 B.极化γδ T 细胞中 IL-17 产生的代表性点图和汇总数据（Chen 等人， 2022）。每个点代表一个单独的捐赠者，并使用学生t检验统计分析; *** p < 0.001。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•陈等人。（ 2022 ）。由转录因子 c- Maf控制的差异代谢需求决定了小鼠和人类的先天 γδT17 效应器功能。科学进展（图6 ， A组）。

笔记

1.PBMC 分离前一天， 24 孔板应涂有含有抗人γδTCR Ab 的 PBS；详细信息可以在程序C的第一步中找到。
2.直接在显微镜下使用血细胞计数器或使用台盼蓝染色来计数细胞数。任何一种方法都是合适的，因为细胞大多是存活的。直接计数细胞时，健康细胞显得明亮；当使用台盼蓝染色对细胞进行计数时，活细胞保持未染色且明亮，而死细胞则被蓝色染料染色。若将10μL细胞悬液与90μL台盼蓝染色液混合，计算总细胞数时稀释倍数为10。
3.丢弃涂层溶液后无需清洗步骤。
4.健康细胞在显微镜下显得明亮，如图3所示。

图 3. 显微镜下细胞的形态。显示了不同密度的细胞：低密度 (A) 和高密度 (B)。

5.根据细胞密度传代细胞；板汇合度的三分之二被视为目标密度，如图 3B 所示。
6.孵育抗人 IL-17。我们通常将抗人 IL-17 Ab 孵育过夜。
7.γδ T 细胞中 IL-17 产生的分析（门控策略）如下：1）门控活细胞（活力染料阴性），2）门控 CD3 阳性细胞，3）门控 CD3 阳性和γδTCR阳性细胞（图 1B), 4) 将 IL-17 阳性细胞门控在γδ T细胞上（图 1C）。
8.γδ T细胞的百分比增加至 CD3 +细胞的 64.8% （图 1B）。然而，产生 IL-17 的γδ T细胞的百分比因不同的供体而异。如图1C所示，极化后， IL-17 +的百分比供体 A 和供体 B 中的γδ T细胞分别为 7.59% 和 1.03% 。
9.后CD3 + T 细胞中γδ T细胞的百分比年龄大约增加了 10 倍。来自 PBMC 的原代γδ T细胞产生稀缺的 IL-17（图 2A）。极化后，IL-17 + γδ T细胞主要是 CCR6 + γδ T细胞和IL-17 +百分比 γδ T细胞在总γδ T细胞群中平均约为 10% （图 2B）（Chen 等人， 2022）。

致谢

这项工作得到了 NIH R01AI128818 和 R01CA213990 的支持。徐晨获上海市浦江计划（ 23PJD047 ）和在职博士后资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

道德考虑

所有实验程序均已获得中国上海第九人民医院伦理委员会的批准。

参考

Caccamo, N.、La Mendola, C.、Orlando, V.、 Meraviglia , S.、Todaro, M.、Stassi, G.、Sireci, G.、Fournié, JJ 和 Dieli, F.。（2011）。产生白细胞介素 17 的人 Vγ9Vδ2 T 细胞的分化、表型和功能。血 118（1）： 129–138。
蔡勇、沉X、丁成、齐成、李凯、李X、贾拉VR、张红刚、王天、郑J。，等人。（2011）。真皮产生 IL-17 的γδ T 细胞在皮肤炎症中的关键作用。免疫 35（4）： 596–610。
陈X.、蔡Y.、胡X.、丁C.、何L.、张X.、陈F.和严J.。（2022）。由转录因子 c- Maf控制的差异代谢需求决定了小鼠和人类的先天 γδT17 效应器功能。科学。副词。 8（21）： eabm9120。
Davey, MS、Willcox, CR、Hunter, S.、 Kasatskaya , SA、 Remmerswaal 、EBM、Salim, M.、Mohammed, F.、 Bemelman 、FJ、 Chudakov 、DM、Oo、YH 等人。（2018）。人类 Vδ2+ T 细胞区室包含不同的先天性 Vγ9+ 和适应性 Vγ9- 子集。纳特。交流。 9（1）： e1038/s41467–018–04076–0。
哈斯，JD，冈萨雷斯，FHM，施米茨，S，陈努帕蒂，V， Föhse ，L，克雷默，E，福斯特，R 和普林茨，I。（2009）。 CCR6 和 NK1.1 区分 IL-17A 和产生 IFN-γ 的γδ效应 T 细胞。欧元。 J.免疫学。 39（12）： 3488–3497。
海利格，JS 和利根川，S。（1986）。小鼠伽马基因的多样性以及胎儿和成人 T 淋巴细胞的表达。自然 322（6082）： 836–840。
Hovav , AH、Wilharm, A.、Barel, O. 和 Prinz, I. (2020)。口腔粘膜中gammadeltaT细胞的发育和功能。 J.登特。资源。 99（5）：498-505。
Hur, G.、Choi, H.、Lee, Y.、Sohn, HJ、Kim, SY 和 Kim, TG （2023）。使用人工抗原呈递细胞和抗 CD3 抗体体外扩增脐带血中的 Vδ1+ T 细胞。疫苗 11（2）： 406.
凌S.、尤Z.、李Y.、张J.、赵S.、何Y.和陈X. (2022)。 γδ T17 细胞在心血管疾病中的作用。 J.洛科克。生物。 112（6）：1649-1661。
Melandri , D.、 Zlatareva , I.、 Chaleil , RAG、Dart, RJ、Chancellor, A.、Nussbaumer, O.、Polyakova, O.、Roberts, NA、Wesch, D.、 Kabelitz , D. 等人。（2018）。 γδTCR通过利用空间上不同的区域进行激动剂选择和抗原反应，将先天免疫与适应性免疫结合起来。纳特。免疫学。 19（12）： 1352–1365。
米歇尔 (ML)、庞 (DJ)、哈克 (SFY)、波托尼克 (AJ)、彭宁顿 (DJ) 和海戴(AC) （2012）。白细胞介素 7 (IL-7) 选择性促进小鼠和人类产生 IL-17 的γδ细胞。过程。国家。阿卡德。科学。鹿 109（43）： 17549–17554。
Ness-Schwickerath，KJ，Jin，C 和 Morita，CT （2010）。产生 IL-17A 和 IL-22 的人 Vγ2Vδ2 T 细胞分化和扩增的细胞因子要求。 J.免疫学。 184（12）： 7268–7280。
Ribot, JC、 deBarros , A.、Pang, DJ、Neves, JF、 Peperzak , V.、Roberts, SJ、Girardi, M.、Borst, J.、 Hayday , AC、Pennington, DJ 等。（2009）。 CD27 是产生干扰素 γ 和白细胞介素 17 的γδ T 细胞亚群之间平衡的胸腺决定因素。纳特。免疫学。 10（4）： 427–436。
吴平、吴大、倪成、叶杰、陈文、胡光、王中、王成、张中、夏文、等人。（2014）。 δγ T17 细胞促进人结直肠癌中骨髓源性抑制细胞的积累和扩张。免疫力40(5)：785–800。