材料与试剂

生物材料

1.H9人类胚胎干细胞（WiCell研究所，WA09，NIH注册号：0062）
2.感受态大肠杆菌细胞（New England Biolabs，目录号：C2987H/C2987I）
3.pSB-TRE-CRISPRoff-EF1A-TetOn（ Addgene ，目录号：203355）
4.pSB - BbsI -sgRNA（ Addgene ，目录号：203359）
5.pCMV (CAT)T7-SB100（ Addgene ，目录号：34879）

试剂

1.BbsI -HF核酸内切酶（New England Biolabs，目录号：R0539/R0539L）
2.rCutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：B6004S）
3.快速小牛肠碱性磷酸酶（CIP）（New England Biolabs，目录号：M0525S/M0525L）
4.PCR 和/或凝胶提取纯化试剂盒（Invitrogen，目录号：K220001）
5.T4 DNA连接酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0202S）
6.T4 DNA 连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S/M0202L）
7.多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201S/M0201L）
8.推荐的菌落 PCR 试剂包括带有ThermoPol ®缓冲液的Taq DNA 聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0267S/M0267L）和脱氧核苷酸 (dNTP) 溶液混合物（New England Biolabs，目录号：N0447S/N0447L）
9.Difco TM LB肉汤，Miller（Luria-Bertani）（Becton Dickinson，目录号：244610）
10.LB琼脂，Miller（Fisher Scientific，目录号：BP1425-500/BP1425-2）
11.质粒 DNA 小量制备试剂盒（Qiagen，目录号：27104）
12.氨苄西林钠盐（ Thermo Fisher Scientific，目录号：611770250/611770050）
13.TRIzol TM试剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 15596026)
14.核糖核酸酶ZAP （赛默飞世尔科技，目录号： AM9780)
15.氯仿（Millipore Sigma，目录号：C2432）
16.2-丙醇（Millipore Sigma，目录号：I9516）
17.乙醇（Millipore Sigma，目录号：459836）
18.酸二乙酯（DEPC）处理过的水（KD Medical，目录号：RGE3050）
19.乙二胺四乙酸 (EDTA)，0.5 M，pH 8.0，分子生物学级，DEPC 处理（Millipore Sigma，目录号：324506）
20.DNase I（New England Biolabs，目录号：M0303）
21.Thermo Fisher 高容量 cDNA 逆转录试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 4368814 ）
22.SYBR Green PCR Master Mix （ Thermo Fisher Scientific，目录号： 4309155 ）
23.无核酸酶水（ Thermo Fisher Scientific，目录号： AM9906 ）
24.磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂（Fisher BioReagents ，目录号：BP2944100）
25.多聚甲醛（PFA）16％水溶液（Electron Microscope Sciences，目录号：15710-S）
26.Triton X-100（Millipore Sigma，目录号：T87876）
27.牛血清白蛋白（BSA）（Millipore Sigma，目录号：A4503-100G）
28.Fluoromount -G （ Thermo Fisher Scientific，目录号： 00-4958-02 ）
29.十二烷基硫酸钠（SDS）（Millipore Sigma，目录号：L3771）
30.Trizma®碱（Tris Base）（Millipore Sigma，目录号：T6066 ）
31.甘氨酸（Millipore Sigma，目录号：G7126）
32.氯化钠（NaCl）（Millipore Sigma，目录号：S7653）
33.盐酸（HCl）（Millipore Sigma，目录号：258148）
34.奶粉（RPI，目录号：M17200）
35.TWEEN ® 20（Millipore Sigma，目录号：P7949）
36.磷酸酶抑制剂PhosSTOP （Roche， Thermo Fisher Scientific，目录号： 4906845001 ）
37.蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（Roche， Thermo Fisher Scientific，目录号： 10837091001）
38.cOmplete TM ，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（PIC）（Roche， Thermo Fisher Scientific，目录号：4693132001）
39.Pierce 二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 23227 ）
40.4 × Blot TM十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液（ Thermo Fisher Scientific，目录号： B0007 ）
41.2-巯基乙醇（Bio-Rad，目录号：1610710）
42.Hoechst 33342 溶液（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 62249 ）
43.4%–20% Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白质凝胶（Bio-Rad 目录号： 4561091）
44.mTeSR1（STEMCELL Technologies，目录号：85850）
45.Matrigel Matrix hESC合格小鼠（康宁，目录号：354277）
46.DMEM/F-12（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸）HEPES（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 11330032)
47.温和的细胞解离试剂（ STEMCELL Technologies，目录号：100-0485）
48.ROCK1和ROCK2抑制剂Y-27632 （STEMCELL Technologies，目录号：72307）
49.Opti-MEM I 减少血清培养基（ Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
50.TransIT-LT1 转染试剂（Mirus，目录号：2304）
51.Accutase （Innovative Cell Technologies，目录号：AT104）
52.来自白黑链霉菌的二盐酸嘌呤霉素（密理博西格玛，目录号：P8833-10MG）
53.潮霉素 B（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 10687010)
54.Caspase 抑制剂喹啉-Val-Asp-二氟苯氧基甲基酮（Q-VD- Oph ）（SM Biochemicals LLC，目录号：SMP001-5MG）
55.盐酸强力霉素（ Tocris Bioscience，目录号：4090）
56.人胰岛素溶液（ Thermo Fisher Scientific，目录号： I9278)
57.DMEM/F-12（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11320033）
58.青霉素-链霉素（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
59.MEM非必需氨基酸溶液100×（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11140050）
60.GlutaMAX补充剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）
61.视黄酸（密理博西格玛，目录号：R2625）
62.TGF-β/Smad抑制剂LDN-193189（ Reprocell ，目录号：04-0074）
63.TGF-β/Smad抑制剂Stemolecule SB431542（ Reprocell ，目录号：04-0010-10）
64.N-2 补充剂 100 × （ Thermo Fisher Scientific，目录号：17502048）
65.平滑激动剂（SAG）（STEMCELL Technologies，目录号：73412）
66.超纯无 DNase/RNase 蒸馏水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：10977015）

解决方案

1.DNase I 反应（参见食谱）
2.逆转录预混液（参见食谱）
3.1% Triton （参见食谱）
4.4% PFA （参见配方）
5.10% BSA （参见配方）
6.裂解缓冲液（参见配方）
7.10 × Tris- Gly -SDS 缓冲液（参见配方）
8.20 × TBS （参见食谱）
9.TBST （参见食谱）
10.5% 牛奶 TBST （参见食谱）
11.基础培养基（参见食谱）
12.神经诱导介质（NIM）（参见食谱）
13.N2 培养基（参见食谱）

食谱

1.DNA酶I反应
注意：配制后置于冰上并立即使用。
试剂最终浓度数量或体积
DNase I 反应缓冲液 (10 × )1 ×1微升
DN a se I（无 RNase）不适用0.2微升
RNA样本不适用2微克
无核酸酶 H 2 O不适用高达 10 µL
全部的不适用10微升

2.逆转录预混液
注意：配制后置于冰上并立即使用。
试剂最终浓度数量或体积
10 × RT缓冲液1 ×2微升
25 × dNTP 混合1 ×0.8微升
10 × RT 随机引物1 ×2微升
MultiScribe TM逆转录酶不适用高达 10 µL
无核酸酶 H 2 O不适用4.2微升
全部的不适用10微升

3.1% 海卫一
注意：储存于 4°C。
试剂最终浓度数量或体积
海卫一 X-1001%50微升
1 × PBS不适用49.5毫升

4.4% PFA
试剂最终浓度数量或体积
16% PFA4%12.5毫升
1 × PBS不适用37.5毫升

5.10%牛血清白蛋白
注意：储存于 4°C。
试剂最终浓度数量或体积
牛血清白蛋白10%5克
1 × PBS不适用50毫升

6.裂解缓冲液
注意：配制后置于冰上并立即使用。
试剂最终浓度数量或体积
1% Triton（配方 3）0.79%79微升
10 × 磷停止1 ×10微升
10 ×图片1 ×10微升
100 mM PMSF1毫米1微升
全部的不适用100微升

7.10 × Tris- Gly -SDS 缓冲液
试剂最终浓度数量或体积
特里斯碱基不适用121.1克
甘氨酸不适用576克
安全数据表1%200毫升
水蒸气_ _不适用高达 4 升
全部的不适用4升

8.20 × TBS
注意：用 HCl 将 pH 调节至 7.6。
试剂最终浓度数量或体积
特里斯碱基不适用193.6克
氯化钠不适用640克
水蒸气_ _不适用高达 4 升
全部的不适用4升

9.TBST
试剂最终浓度数量或体积
20 × TBS1×50毫升
水蒸气_ _不适用949 毫升
吐温®20 _0.1%1毫升
全部的不适用1升

10.5% 牛奶 TBST
试剂最终浓度数量或体积
干粉奶粉5%5克
TBST不适用100毫升
全部的不适用100毫升

11.基础培养基
注意：过滤灭菌并在 4°C 下保存。
试剂最终浓度数量或体积
DMEM/F12不适用485 毫升
MEM非必需氨基酸溶液 1 ×5毫升
GlutaMAX补充剂1 ×5毫升
青霉素-链霉素1 ×5毫升
2-巯基乙醇55微米_1.93微升
全部的不适用500毫升

12.神经诱导培养基 (NIM)
注意：储存于 4°C。 *每天添加新鲜的小分子。
试剂最终浓度数量或体积
基础培养基（配方 7）不适用50毫升
胰岛素25微克/毫升108微升
SB431542*10微米_25微升
LDN193189*250纳米6.25微升
视黄酸*100纳米50微升
全部的不适用50毫升

13.N2介质
注意：储存于 4°C。 *每天添加新鲜的小分子。
试剂最终浓度数量或体积
基础培养基（配方 7）不适用49.5毫升
N-2补充品100 ×1 ×500微升
半月形*250纳米5微升
RA*100纳米50微升
全部的不适用50毫升

实验室用品

1.1.5 mL微量离心管（ Fisherbrand ，目录号：05-408-1317）
2.PCR 管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AB2000）
3.Costar 6 孔透明 TC 处理孔板（Corning，目录号：3516）
4.细胞升降机（康宁，目录号：3008）
5.表面处理的无菌组织培养板（ Fisherbrand ，目录号：FB012928）
6.Stericup -GP 500 mL Express Plus（Millipore Sigma，目录号：S2GPU05RE）
7.35毫米玻璃底培养皿，带14毫米微孔#1.5盖玻片（ Cellvis ，目录号：D35-14-1.5-N）

设备

1.应用生物系统公司 QuantStudio TM 3 实时 PCR 系统，96 孔，0.2 mL，笔记本电脑（ Thermo Fisher Scientific，目录号：A28567）
2.循环仪（ Thermo Fisher Scientific，目录号：4484073）
3.孵化摇床（ Thermo Fisher Scientific，目录号：SHKE6000）
4.Synergy HT 微量滴定板读数器（ BioTek ，目录号：7091000）
5.Amersham Imager 600（通用电气，目录号：AI600）
6.搅拌电炉（ Thermo Fisher Scientific，目录号：SP88854100）
7.Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（Bio-Rad，目录号： 1658004
8.PowerPac TM HC 电源（Bio-Rad，目录号： 1645052）
9.转盘共焦显微镜（Nikon Eclipse Ti-E，配备 Plan Apo Lambda 20 × 0.75 NA WD 1.00 mm 物镜和 Andor DU-897 EMCCD 相机）

软件和数据集

1.Prism v9（GraphPad，2020 年 10 月 24 日）
2.图像工作室精简版
3.SnapGene v6.2.1

程序

A.克隆策略

NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Mastermix克隆睡美人转座子质粒（图 1 ），并且可从Addgene获得，如上文生物材料部分所述。

图 1. 睡美人转座子质粒。 (A) CRISPRoff转座子质粒 ( Addgene #203355 ) 编码嘌呤霉素 N-乙酰基转移酶基因 ( PuroR ) 的组成型表达和反向四环素控制的反式激活子(Tet-on 3G)，可实现四环素响应元件的强力霉素依赖性激活（TRE）驱动的转基因。 TRE 调节CRISPRoff酶的转录，该酶由DNA 甲基转移酶 3a (Dnmt3a) 和 3-like (Dnmt3L ) 以及与蓝色荧光蛋白 (BFP) 融合的 dCas9-KRAB 组成。 SV40 PolyA：猿猴病毒 40 多聚腺苷酸化信号序列。 EF1α：伸长因子 1 α。 P2A：猪 teschovirus-1 2A 自裂解肽。 bGH PolyA：牛生长激素聚腺苷酸化信号序列。 (B)单引导 RNA (sgRNA) 转座子质粒 ( Addgene #203359 ) 编码潮霉素磷酸转移酶 ( HygroR ) 转基因的组成型表达。 U6 III 型聚合酶启动子组成型驱动 sgRNA 的表达，其由恒定支架区域和用户定义的间隔序列组成。插图：退火的有义和反义寡核苷酸应包含适当的BbsI突出端，以便成功连接。两种转座子质粒都包含跨越两端的反向末端重复序列 (ITR)，可实现由睡美人 100× 转座酶介导的成功基因组整合。

B.单链RNA设计

有许多资源可帮助选择靶标特异性 sgRNA 序列。例如，霍尔贝克等人。和桑森等人。已经建立了 sgRNA 设计规则，用于通过CRISPRi抑制人类基因组中的转录本 [9, 10] 。霍尔贝克等人。生成了针对人类基因组的预测活性 sgRNA 数据库，该数据库用于在开创性CRISPRoff工作中设计 sgRNA，这表明CRISPRi文库可以作为选择CRISPRoff sgRNA 的合理起点。 Sanson 等人开发的CRISPRi文库。可通过位于https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public的CRISPick门户网站获取。用户选择适当的基因组编辑机制（即CRISPRi ）和 Cas 蛋白（即 SpyoCas9）来识别具有预测的高特异性活性的 sgRNA。 Addgene还维护了一个可从存储库获取的 gRNA 序列表，用户可以挖掘该表来确定感兴趣的基因是否已在CRISPRi或CRISPRoff实验中有效定位 ( https://www.addgene.org/crispr/grnas/ ) 。然而，值得注意的是， CRISPRi的有效 sgRNA通常定位于转录起始位点 (TSS) 下游的狭窄窗口，而CRISPRoff介导的基因抑制则显示出宽范围的靶向窗口，跨越距离超过 2 kb TSS。因此，可以根据经验测试和验证未通过上述工具预测的候选 sgRNA 序列。至关重要的是，用户需要识别包含Spyo Cas9 (5'-NGG-3') 原型间隔子相邻基序 (PAM) 的潜在 Cas9 靶位点。这些位点可以使用 UCSC 基因组浏览器 ( https://genome.ucsc.edu/ )等工具进行识别。该协议中使用的 sgRNA 序列可在表 S1中找到。

C.sgRNA转座子质粒设计

1.sgRNA骨架的制备
a.通过组合 ~1 µg sgRNA转座子质粒 ( Addgene #203359 )、1 µL BbsI核酸内切酶、2 µL rCutSmart缓冲液、1 µL Quick CIP 和水，进行 BbsI 消化和骨架去磷酸化，使最终总体积为20 µL 装在无菌管中。置于 37°C 下 1-3 小时。
b.进行 PCR 纯化或凝胶提取以纯化消化的骨架。根据我们的经验，PCR 纯化就足够了，因为切除的片段长 22 bp。
2.sgRNA 插入片段的制备
a.设计并获得含有 sgRNA 序列的寡核苷酸，用于在sgRNA 转座子质粒 ( Addgene #203359 ) 的BbsI位点上进行整合。有义和反义寡核苷酸应包含BbsI切割位点特有的适当突出端，以实现成功连接（图 1 ）。使用超纯水将寡核苷酸重组至 100 µ M。
b.将100 μM正义和反义寡核苷酸库存各 4 µL以及4 µL T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL PNK 和 27 µL超纯水放入无菌管中，并充分混合。
c.使用以下方案对寡核苷酸进行磷酸化和退火，该方案可以编程到热循环仪中：
37°C 30 分钟
95℃10分钟
85℃1分钟
75℃1分钟
65℃1分钟
55℃1分钟
45℃1分钟
35℃1分钟
25℃1分钟
d.寡核苷酸磷酸化并退火后，用超纯水按 1:50 稀释并充分混合。
3.连接和验证
a.添加 75 ng 纯化骨架以及 1 µL插入片段（稀释的退火/磷酸化寡核苷酸）、2 µL T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA 连接酶和水，使最终体积为 20 µL ，充分混合。 16°C 孵育 1 小时。
b.将反应混合物转化为化学感受态大肠杆菌（例如 DH5α 菌株），铺展到补充有氨苄青霉素或羧苄青霉素 (100 mg/mL) 的琼脂平板上，并在 37 °C 下孵育过夜[11] 。
c.使用细菌菌落进行菌落 PCR。我们使用结合 U6 启动子 (5'- ttcttgggtagtttgcagtttt -3') 的引物作为正向引物，使用反义寡核苷酸作为反向引物。使用细菌菌落作为模板 DNA，确保在 PCR 混合物中旋转一次菌落，然后在小体积（即 100 µL ）的 LB 肉汤中旋转相同的尖端，以培养阳性鉴定的菌落。
d.，并在 37 °C 的摇床培养箱中添加氨苄青霉素 (100 μg /mL)。培养 16 小时后，应使用 Miniprep 质粒纯化试剂盒从大肠杆菌中提取质粒 DNA 。
e.BbsI切割位点进行 Sanger 测序，以确保 sgRNA 转座子载体的成功组装。同样，我们通常使用之前提到的 U6 引物进行桑格测序。或者，用户也可以选择提交样本以获取完整的质粒测序服务。

D.hESC ）的维持

H9 hESC保存在 Matrigel 包被板上的 mTeSR1 中。每天更换培养基并在需要时更换通道。
1.准备基质胶（1 毫克/24 毫升的 DMEM/F12、HEPES）。
2.将板（6 孔板的每个孔 1.5 mL）在 37 °C培养箱中过夜包被。
3.（可选）用 1 mL 温和的细胞解离缓冲液清洗细胞。吸出。
4.在室温 (RT) 下与 1 mL 温和的细胞解离缓冲液一起孵育 3-5 分钟（在显微镜上检查是否有效解离）。吸出缓冲液。
5.加入新鲜的 mTeSR1，用细胞提升器轻轻刮擦，用血清移液管重悬细胞，使细胞形成小团块。
6.将细胞按 1:6（如果孔 > 80% 汇合）分割到 6 孔板上进行维护。
7.°C和 5% CO 2下孵育细胞。

E.CRISPR关闭转染

图 2概述了 E-I 部分的实验程序。

图 2. 细胞系的产生。第 0 天：用CRISPRoff转座子和睡美人 100× 转座酶质粒转染人胚胎干细胞 ( hESC ) 。蓝色孔表示没有 DNA 阴性对照，粉色孔表示有 DNA 的实验孔。第 4 天：当细胞达到 70%–80% 汇合时进行传代。第 5 天：开始使用嘌呤霉素选择抗生素。带 - 的蓝色孔表示没有不含嘌呤霉素的 DNA 阴性对照。带+的蓝色孔表示没有嘌呤霉素的DNA阴性对照。带 - 的粉红色孔表示含有 DNA 且不含嘌呤霉素的实验孔。带+的粉色孔表示含有DNA和嘌呤霉素的实验孔。第 20 天：用 sgRNA 池转染hESC并转置质粒。第 24 天：当细胞达到 70%–80% 汇合时进行传代。第 25 天：开始使用潮霉素选择抗生素。带 - 的蓝色孔表示没有不含潮霉素的 DNA 阴性对照。带+的蓝色孔表示没有潮霉素的DNA阴性对照。带 - 的粉红色孔表示含有 DNA 且不含潮霉素的实验孔。带+的粉色孔表示含有DNA和潮霉素的实验孔。第 40 天：验证干细胞特性。 SB = 睡美人

第一天
1.将含有 1 µL 10 mM Y27632 的 250 µL mTeSR1 放入 Matrigel 涂层的 12 孔板的孔中。
2.制备含有 0.75 µg 睡美人转座酶质粒 [ pCMV (CAT)T7-SB100]和 1.25 µg CRISPRoff质粒的混合物，辅以 6 µL TransIT-LT1。包括不含 DNA 的混合物。这是无 DNA 阴性对照。
3.室温孵育 15 分钟后，将转染混合物添加到 12 孔板的孔中。
4.添加 1 mL Accutase （适用于 6 孔板中的细胞）以分离hESC 。 37°C 孵育 5 分钟。
5.通过添加 2 mL DMEM/F12 介质来稀释Accutase溶液。
6.使用细胞提升器从孔中取出细胞，并用 p1000 移液器轻轻移液 2-5 次，以将hESC细胞集落完全解离为单个细胞。
7.将细胞转移至锥形管中。
8.将细胞在 RT 下以 200 × g离心 4 分钟。
9.将细胞沉淀重新悬浮在含有 10 µM Y27632 的 1 mL mTeSR1 中，并用血细胞计数器对细胞进行计数。
10.将细胞悬液稀释至 1.5 × 10 6 个细胞/ mL。
11.将 500 µL 该细胞悬浮液放入含有转染混合物的孔中。
12.将细胞在 37 °C、5% CO 2下孵育过夜。

第二天
1.吸出培养基并更换为不含 Y27632 的新鲜 mTeSR1。

第 4 天
1.这一天细胞应达到 70%–80% 汇合度。
2.将细胞传代到新的 12 孔板中，如前面 D 部分所述。

F.抗生素选择

1.确保之前已根据感兴趣的细胞类型的抗生素杀伤曲线验证了所需的适当嘌呤霉素浓度。对于此处概述的实验，使用浓度为 0.8 mg/mL 的嘌呤霉素进行选择。
2.传代后第二天，用适当浓度的嘌呤霉素补充 mTeSR1。
3.继续每日喂食补充有嘌呤霉素的 mTeSR1，持续 14 天。预计转染过程中未接受 DNA 的阴性对照细胞会在最初几天内死亡。同样，实验孔中未转染的细胞应在 14 天后全部死亡。存活的细胞有望将CRISPRoff系统整合到其基因组中，以产生稳定的细胞系。
4.从此时起，培养基中必须补充一半剂量的嘌呤霉素。
5.继续维持细胞，为第二次转染做好准备。
6.在此阶段，建议冷冻保存，因为这种稳定的细胞系可用于将来用不同的 sgRNA 池进行转染。

G.sgRNA转染

第一天
1.将含有 1 µL 10 mM Y27632 的 250 µL mTeSR1 放入 Matrigel 涂层的 12 孔板的孔中。
2.制备含有 1 µg 睡美人转座酶质粒[ pCMV (CAT)T7-SB100]和 1 µg sgRNA 池的混合物，并补充有 6 µL TransIT-LT1。
a.除了针对感兴趣基因的 sgRNA 池之外，请确保还包括非靶向 (NT) sgRNA 池。
b.包括不含 DNA 的混合物（DNA 阴性对照）。
3.室温孵育 15 分钟后，将转染混合物添加到 12 孔板的孔中。
4.添加 1 mL Accutase （适用于 6 孔板中的细胞）以分离hESC 。 37°C 孵育 5 分钟。
5.通过添加 2 mL DMEM/F12 介质来稀释Accutase溶液。
6.使用细胞提升器从孔中取出细胞，并用 p1000 移液器轻轻移液混合物 2-5 次，以将hESC细胞集落完全解离为单个细胞。
7.将细胞转移到锥形管中。
8.将细胞在 RT 下以 200 × g离心 4 分钟。
9.将细胞沉淀重新悬浮在含有 10 µM Y27632 的 1 mL mTeSR1 中，并用血细胞计数器对细胞进行计数。
10.将细胞悬液稀释至 1.5 × 10 6 个细胞/ mL。
11.将 500 µL 该细胞悬浮液放入含有转染混合物的孔中。
12.将细胞在 37 °C、5% CO 2下孵育过夜。

第二天
1.吸出培养基并更换为不含 Y27632 的新鲜 mTeSR1。

第 4 天
1.这一天细胞应达到 70%–80% 汇合度。
2.将细胞传代到新的 12 孔板中，如前面 D 部分所述。

H.选择

1.确保根据感兴趣的特定细胞类型的抗生素杀伤曲线确定所需的适当潮霉素 B 浓度。在我们的实验中使用 60 mg/mL 的潮霉素 B 浓度进行选择。
2.传代后第二天，用适当浓度的潮霉素补充 mTeSR1。
3.继续每日补充潮霉素，持续 14 天。预计转染过程中未接受 DNA 的阴性对照细胞会在最初几天内死亡。同样，实验孔中未转染的细胞应在 14 天后全部死亡。 sgRNA 转座子有望整合存活细胞的染色体，从而产生稳定的细胞系。
4.从此时起，培养基中必须添加一半剂量的嘌呤霉素和潮霉素 B。

I.验证多能性和基因组完整性（图 3A 和 3B）

图 3.干细胞多能性和基因组完整性的验证。 (A)通过测试多能性、核型分析和冷冻保存选定的干细胞集落来验证干细胞特性。 (B)使用KaryoStat + Assay ( Thermo Fisher Scientific)确认 NT 和 MCL-1 细胞的基因组稳定性。此处介绍的研究评估的细胞中未检测到畸变。
1.进行集落hESC选择并继续维持细胞。
2.一旦克隆系稳定，就可以使用细胞来测试多能性。
3.核型细胞以验证克隆的基因组完整性。 Thermo Fisher 的KaryoStat + 检测服务用于此处介绍的细胞系。
4.冷冻保存细胞以供将来的实验使用。

J.验证胚胎致死基因的敲低

如前所述，干细胞中 MCL-1 的沉默是致命的。用 Q-VD- OPh (QVD)（一种泛半胱天冬酶抑制剂）处理细胞，以防止当 MCL-1 用强力霉素 (DOX) 处理沉默时细胞死亡。将 MCL-1 和 NT 细胞系传代到 6 孔基质胶包被的板上。设置板有四个实验组：-DOX、+DOX、+DOX +QVD 和 +DOX +DMSO（QVD 车辆对照）。一旦细胞达到 40%–50% 汇合，请继续执行以下步骤。

第 0 天
1.用 1 µg/mL DOX 和/或 25 µM QVD 补充 mTeSR1 和抗生素混合物，并添加到相应的孔中。

第 1-2 天
1.每天更换介质，并继续添加 DOX 和/或 QVD，总共 72 小时。

第三天
1.一旦治疗达到 72 小时，收集细胞进行实验终点测定（例如，定量 RT-PCR 来测量 MCL-1 的基因表达）。
2.× PBS清洗细胞一次。
3.添加 500 µL TRIzol试剂。注意：如果使用TRIzol ，请确保在化学通风橱中收集细胞。
4.用细胞升降器刮擦细胞并收集在 1.5 mL 离心管中。样品可以储存在 -80 °C，或者您可以继续进行 RNA 分离。

K.RNA分离

该方案改编自 Invitrogen TRIzol试剂方案。使用TRIzol 的所有步骤均应在化学通风橱中完成。
1.确保在无 RNase 的区域进行 RNA 分离。使用RNaseZAP喷涂手套、移液器、移液器吸头盒、试管、试管架和工作台。
2.如果样品之前已冷冻，请让其在 RT 下孵育至少 5 分钟。
3.向样品中添加 100 µL 氯仿。
4.剧烈摇动管约 15 秒。
5.将样品在 RT 下孵育 2-3 分钟。
6.将样品以 12,000 ×离心 g在 4°C 下保持 15 分钟。
7.除去样品的水相并放入新管中。
根据机构政策处置TRIzol和其他危险化学品。
8.将 250 µL 2-丙醇添加到水相中以沉淀 RNA。
9.轻轻翻转约 10 次。
10.室温孵育 25 分钟。
11.12,000 ×离心 g在 4°C 下保持 10 分钟。从这一步开始将样品保存在冰上。
12.从管中取出上清液，仅留下 RNA 沉淀。
13.500 μL 75% 乙醇清洗沉淀。
14.短暂涡旋样品，然后以 10,000 ×离心管 g在 4°C 下保持 10 分钟。
15.尽可能多地吸走洗涤液，让 RNA 沉淀半干。
16.将沉淀重悬于 30 μL DEPC 处理水中。储存于-80 °C。
L.RNA 的 DNase 处理

该方案改编自 New England Biolabs DNase I 反应方案。
1.在冰上设置 DNase I 反应（配方 1）。配方上注明的体积是每个样品的体积。
2.在热循环仪中 37 °C孵育10 分钟。
3.向反应混合物中添加 0.5 µ L 0.1 M EDTA 溶液来灭活 D Nase I。
4.°C加热 10 分钟。
5.RNA 样本现已准备好用于反转录。

M.cDNA 合成和定量 RT-PCR

该实验方案改编自Thermo Fisher 高容量 cDNA 逆转录试剂盒和 SYBR Green 试剂。
1.设置逆转录预混液（配方 2）。配方上注明的体积是每个样品的体积。
2.将 10 µL 主混合物添加到PCR管中的10 µL RNA 样品 (2 µg ) 中，并通过涡旋充分混合。短暂旋转管子。
3.使用以下条件在热循环仪中运行样品：
25 °C 10 分钟
37 °C 120 分钟
85 °C 5 分钟
4 ℃保持
4.最终 cDNA 反应体积为 20 µ L。反应后添加 180 µ L无核酸酶 H 2 O稀释至 200 µ L。这里的研究涉及用于 qPCR 的 5 µ L cDNA。
5.QuantStudio 3 实时 PCR 机、SYBR Green 主混合物和制造商说明来设置测定。用于测量MCL1基因表达的引物见表S2 。图 4包含hESC实验验证的结果。

图 4.人胚胎干细胞 ( hESC ) 中MCL-1的沉默。在多西环素和 Q-VD- OPh处理下， MCL -1 hESC中MCL-1的基因表达显着下调。归一化至对照（NT +DOX +QVD）。统计检验：普通单向方差分析与 Dunnett 多重比较检验。 DOX =强力霉素。 QVD = Q-VD- Oph 。

N.差异化

Douvaras和 Fossati (2015) [8] 的分步协议。

第-3天：重新接种hESC
1.当细胞达到 70%–90% 汇合时，除去培养基并添加 1 mL Accutase 。
2.将板在 37°C 培养箱中孵育 5 分钟。
3.通过添加 2 mL DMEM/F12 介质来稀释Accutase溶液。
4.使用细胞提升器从孔中取出细胞，并用 p1000 移液器轻轻移液 2-5 次，以将hESC细胞集落完全解离为单个细胞。
5.将细胞转移至锥形管中。
6.×离心细胞在室温下g 4 分钟。
7.将细胞沉淀重新悬浮在含有 10 µM Y27632 的 1 mL mTeSR1 中，并用血细胞计数器对细胞进行计数。
8.在基质胶包被的 6 孔板上每孔板 8 × 10 4 个细胞。

第-2天：维持hESC
1.吸出并添加新鲜的 mTeSR1 介质以去除 Y27632。

第-1天：维护hESC
1.继续维持 mTeSR1 中的细胞。

第 0 天：神经诱导
1.到现在为止，菌落应该已经均匀生长并达到 80% 的汇合度。当细胞达到这一点时，继续分化。
2.吸出培养基并添加 NIM 以诱导分化。
3.每天更换 NIM，直到细胞到达第 8 天。

第 8 天：少突胶质细胞谱系诱导
1.吸出培养基并添加 N2 培养基以引导细胞向少突胶质细胞谱系定型。

第 9 天：重新接种神经前体细胞
1.取出介质并添加 1 mL Accutase 。
2.将板在 37°C 培养箱中孵育 5 分钟。
3.通过添加 2 mL DMEM/F12 介质来稀释Accutase溶液。
4.使用细胞提升器从孔中取出细胞，并用 p1000 移液器轻轻移液混合物 2-5 次，以充分解离细胞。
5.将细胞转移至锥形管中。
6.×离心细胞在室温下g 4 分钟。
7.将细胞沉淀重新悬浮在含有 10 µM Y27632 的 1 mL N2 介质中，并用血细胞计数器对细胞进行计数。
8.孔 1.5 × 10 6 个细胞置于基质胶包被的 6 孔板上。使用 Matrigel 涂层的 35 mm 玻璃底板进行免疫荧光。用 10 µM Y27632 补充培养基。

第 10 天：施用多西环素诱导沉默 MCL-1
1.吸出培养基并添加补充有 1 µg/mL 多西环素的 N2 培养基。
2.一次补充有 1 μg /mL 多西环素的 N2 培养基。

第 14 天：收集细胞进行蛋白质印迹、定量 RT-PCR 和免疫荧光分析

O.用于蛋白质印迹的细胞裂解和蛋白质提取

1.在冰上准备裂解缓冲液。制备足以使用 6 孔板每孔 100 mL 的量。
2.从孔中吸出介质。
3.用 1 × PBS 清洗一次。
4.向每个孔中添加 100 µL 裂解缓冲液。
5.用细胞升降器用力刮孔并将样品转移至 1.5 µL 离心管中。
6.将管置于冰上 30 分钟。每 10 分钟涡旋一次。
7.×旋转样品 g 30 分钟。
8.收集上清液并转移至新的 1.5 µL 离心管中。
9.将样品储存在-20°C。

P.通过蛋白质印迹测量蛋白质表达

1.Tris- Gly -SDS 缓冲液准备 SDS 。
a.将 200 g SDS 溶解在 900 mL ddH 2 O中。
b.加热至68°C并用磁力搅拌器搅拌以帮助溶解。
c.如有必要，添加几滴浓 HCl 将 pH 值调节至 7.2。
d.2 O将体积调整至 1 L。
2.Thermo Scientific BCA 蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。
3.用 1% Triton 和 LDS 稀释 30 µg 蛋白质与2-巯基乙醇。
4.将样品在 95 °C 下孵育 5 分钟。
5.Gly -SDS 缓冲液中的 10 孔 4%–20% Mini-Protean TGX 预制蛋白凝胶上运行样品。
6.将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上，4°C 过夜。
7.将膜用 TBST 稀释的 5% 牛奶在台式摇床上室温封闭一小时。
8.在台式摇床上与一抗一起孵育过夜。这里使用的抗体可以在表S3中找到。
9.在台式摇床上用 TBST 清洗膜 5 分钟。再重复两次。
10.在台式摇床上与 HRP 缀合的针对小鼠或兔 IgG 的二抗在室温下孵育1 小时。
11.在台式摇床上用 TBST 清洗膜 5 分钟。再重复两次。
12.使用ECL Plus 试剂显影印迹并在化学发光成像仪上成像。
13.使用 Image Studio Lite 对条带进行量化。图5A和5B包含定型少突胶质细胞神经前体细胞的实验验证结果。

图 5. 少突胶质细胞神经前体细胞中 MCL-1 的沉默。 (A)在 NT 和 MCL-1 CRISPRoff细胞系中用多西环素处理 96 小时后，定型少突胶质细胞神经前体细胞中 MCL-1 蛋白表达和切割的 PARP 蛋白表达的代表性图像。 (B)在 MCL-1 细胞系中用多西环素处理 96 小时后，定型少突胶质细胞神经前体细胞中的 MCL-1 显着下调。标准化为各自的对照（NT-DOX 和 MCL-1-DOX）。统计检验：学生t检验。 (C)在 MCL-1 细胞系中，经过 96 小时多西环素处理后，少突胶质细胞神经前体细胞中裂解的 PARP 显着上调。标准化为各自的对照（NT-DOX 和 MCL-1-DOX）。统计检验：多次t检验。 DOX =强力霉素。 QVD = Q-VD- OPh 。

Q.免疫荧光

1.× PBS中用 4% PFA在 RT 下固定细胞 20 分钟。
2.在 RT 下用 1% Triton 透化细胞 10 分钟。
3.× PBS 中制备的 10% BSA 在 RT 下封闭1 小时。
4.与用 10% BSA 稀释的一抗在 4 °C 下孵育过夜。这里使用的抗体可以在表S3中找到。
5.× PBS清洗。再重复两次。
6.在室温下与稀释在 10% BSA 中的二抗一起孵育 1 小时。
7.× PBS清洗。再重复两次。
8.与 Hoechst 一起孵育 10 分钟。
9.× PBS清洗。
10.使用Fluoromount -G 玻片安装介质安装。
11.在共聚焦显微镜上对细胞进行成像。沉默定型少突胶质细胞神经前体细胞中的 MCL-1会导致 OLIG2 和 NKX2.2 表达的变化（图 6 ）。

图 6. MCL-1 抑制后调节少突胶质细胞谱系定型的转录因子失调。 (A) OLIG2的基因表达在 MCL-1 细胞系中，经过 96 小时多西环素处理后，定型 OL 神经前体细胞 (NPC) 显着增加。标准化为各自的对照（NT-DOX 和 MCL-1-DOX）。统计检验：多次t检验。 (二) NKX2.2基因表达在 MCL-1 细胞系中，经过 96 小时多西环素处理后，定型 OL NPC 中的 OL NPC 显着增加。标准化为各自的对照（NT-DOX 和 MCL-1-DOX）。统计检验：多次t检验。（C）沉默 MCL-1 会上调 OL NPC 中 OLIG2 的蛋白表达并下调 NKX2.2。 DOX =强力霉素。比例尺 = 50 µm。
数据分析

详细的分析说明可以在图例中找到。

协议验证

我们通过在体外少突胶质细胞分化的早期状态沉默 MCL-1（一种抗凋亡蛋白）来验证该方案的使用。 MCL-1 是hPSC体外存活所必需的，因此在分化过程开始后需要沉默。所有提出的实验均已使用三个或更多技术重复和至少三个生物重复进行复制。对照包括 NT sgRNA。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.应严格测试干细胞的维持，以确保它们在方案开始时具有多能性。
2.选择药物的剂量反应对于提高沉默效率至关重要。
3.应严格验证少突胶质细胞标记物和引物。

致谢

该协议改编自之前的研究 [4, 8]。这项工作得到了 1R35 GM128915-01NIGMS (VG)、1RF1MH123971-01 (VG) 和 NSF CBET 2033800 (JMB) 的支持；由范德比尔特大脑研究所 (VG)、HHMI Gilliam (MG) 赞助的精准医学和心理健康计划。转盘共焦显微镜成像和图像分析部分是通过范德比尔特细胞成像共享资源（由 NIH 拨款 CA68485、DK20593、DK58404、DK59637 和 EY08126 支持）进行的。本手稿中的一些图形（图 2、3a 和 4a）是使用BioRender ( BioRender.com ) 创建的。

利益争夺

作者声明不存在竞争的经济利益。

道德考虑

人胚胎干细胞系 H9 (WA09) 获自 WiCell Research Institute (Wisconsin)。所有使用hESC的实验均在范德比尔特机构人类多能细胞研究监督 (VIHPCRO) 委员会（方案 IRB # 160146 至 VG）的监督下使用 WA09 (H9) 细胞系进行。

参考

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补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.表 S1。 MCL-1 和 NT sgRNA
2.表S2。 MCL-1 引物序列
3. 表 S3。抗体