材料与试剂

1.50 mL 锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339652）
2.15 mL 锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
3.100毫米培养皿（组织培养处理）（Corning，目录号：430167）
4.12孔板（组织培养处理）（Thermo Fisher Scientific，目录号：173095）
5.10 mL 血清移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：170356N）
6.1,000 μL 微吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：90030210-P）
7.200 μL 微吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：90030130-P）
8.10 μL 微吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：90030000-P）
9.1.5 mL微量离心管（Tarsons，目录号：500010）
10.人角膜缘上皮（HCLE）细胞（来自哈佛医学院 Schepen 眼科大众眼耳研究所的 Ilene Gipson 博士的善意礼物）
11.角质形成细胞无血清培养基（KSFM），补充有牛垂体提取物和表皮生长因子（EGF）（Gibco，Thermo Fisher Scientific，目录号：10724-011-500ML）
12.青霉素/链霉素溶液（100×）（Diagnovum，目录号：D910-100ML）
13.TrypLE TM Express 不含酚红（Gibco，Thermo Fisher Scientific，目录号：12604-013-100ML）
14.最低必需培养基（MEM）（Gibco，Thermo Fisher Scientific，目录号：32571-036-500ML）
15.胎牛血清（FBS）（Gibco，Thermo Fisher Scientific，目录号：10270-106-500ML）
16.Dulbecco 的 PBS，不含 Ca 2+ 、Mg 2+和酚红（1×）（Diagnovum，目录号：D402-500ML）
17.台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，目录号：T10282）
18.过硫酸铵（APS）（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，目录号：HC2005）
19.SureCast TM TEMED（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，目录号：HC2006）
20.SureCast TM 40%（w/v）丙烯酰胺（29:1 丙烯酰胺：双丙烯酰胺）（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，目录号：HC2040）
21.2.5× Tris-SDS缓冲液（pH 8.8）（HIMEDIA，目录号：MB039-500ML）
22.5× Tris-SDS 缓冲液（pH 6.8）（HIMEDIA，目录号：MB040-500ML）
23.明胶，Hi-LR TM （HIMEDIA，目录号：GRM019-500G）
24.0.2 μm 聚醚砜 (PES) 注射器过滤器（mdi Membrane Technologies，目录号：SYKG0601MNXX204）
25.Mini-RNA 分离试剂盒（Qiagen，目录号：74004）
26.Verso c-DNA 合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB1453）
27.SYBR Green（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，目录号：A25742）
28.NuPage LDS 样品缓冲液（4×）（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，目录号：2463558）
29.氯化钙（CaCl 2 ）（HIMEDIA，目录号：GRM3906-500G）
30.Triton X-100（HIMEDIA，目录号：MB031-100M）
31.考马斯亮蓝 R-250（HIMEDIA，目录号：MB153-25G）
32.甲醇（Rankem，目录号：M0140）
33.乙酸（Rankem，目录号：A0060）
34.氯化钠（HIMEDIA，目录号：MB023-500G）
35.1 mL 注射器（DISPOVAN，型号：U-40 胰岛素注射器）
36.Schirmer撕裂测试条/撕裂触摸（Madhu Instruments Pvt. Ltd.）
37.手套（Kimberly-Clark，目录号：KM50601）
38.Kimwipes（Kimtech Science，目录号：34120）
39.完整的 KSFM+GF (500 mL)（参见食谱）
40.基础培养基：不完整的 KSFM-GF（参见食谱）
41.1% Triton X-100 溶液（参见配方）
42.显色缓冲液（参见配方）
43.考马斯染色液（参见配方）
44.脱色溶液（参见配方）

食谱

1.完整 KSFM+GF (500 mL)
牛垂体提取物，25 μg /mL（提供半瓶）
表皮生长因子 (0.2 纳克/毫升)
CaCl 2 (0.4 mM)
青霉素/链霉素 100 ×抗生素（5 mL 以达到 1 ×终浓度）

2.基础培养基：不完整的KSFM-GF
青霉素/链霉素 100 ×抗生素（5 mL 以达到 1 ×终浓度）

3.1% Triton X-100 溶液
1% Triton X-100 (v/v)
高压灭菌的 Milli-q 水

4.显影缓冲液
10 mM Tris 缓冲液
200 毫摩尔氯化钠
6 毫米氯化钙2
pH值7.4

5.考马斯染色液
考马斯亮蓝 R-250 (0.05%)
甲醇（50% v/v）
乙酸（10% v/v）
用 Milli-Q 水补足剩余体积
6.脱色液
乙酸（10% v/v）
甲醇（50% v/v）
Milli-Q 水 (40% v/v)

设备

1.吊桶离心机（NEUATION，型号：ifuge UC02；目录号：UC-2002-EU/UK/AUS）
2.台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall Legend Micro 21R；目录号： 75002447 ）
3.II级生物安全柜（ESCO，型号：Class II BSC）
4.细胞培养CO 2培养箱（ESCO，型号：CCL-170B-8-UV）
5.EVOS TM XL Core 成像系统（Thermo Fisher Scientific，型号：AMEX1200）
6.自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，型号：Countless TM 3 AMQAX2000）
7.血细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，型号：Countless TM Reusable Slide，目录号：A25750）
8.NanoDrop TM Lite 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-LITE）
9.Gel Doc（Azure Biosystems，型号：c600）
10.实时 PCR（Azure Biosystems，型号：Ceilo 6）
11.热循环仪（Bio-Rad，型号：T1000）
12.摇臂摇床（Scientek Hub，型号：SR-1）
13.SureCast TM玻璃板（（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，目录号：HC1001）
14.迷你凝胶槽（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific、AMEX 1200；目录号：A25977）
15.-80°C 实验室冷冻柜（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma 900）
16.Milli-Q（Elga，型号：PQ00018907）
17.Vortex（NEUATION，型号：iSWIX）
18.移液器（1,000、200、10、2.5 μL）（Eppendorf，型号：Research Plus）

软件和数据集

1.Prism 9（GraphPad Prism 版本 9.4.1）
2.用于图形图像的 BioRender ( https://www.biorender.com/ )
3.Azure Cielo 管理器软件（版本 1.0.4.0）

程序

A.HCLE 细胞的培养和接种

1.从 -80°C 取出一小瓶冷冻保存的 HCLE 细胞。
2.将小瓶置于 37°C 下 3-4 分钟以解冻细胞。
3.将 1 mL 的冷冻细胞添加到 BSL2 安全柜中 15 mL 离心管中的 5 mL MEM+10% FBS 介质中。
4.室温下160× g离心 5 分钟。
5.丢弃上清液。
6.将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 KSFM+GF 介质中。
7.将重悬的细胞添加到 100 mm 组织培养板中，并添加 7 mL 的新鲜 KSFM+GF 介质。
8.将细胞在37°C、5%CO 2的培养箱中孵育以生长。
9.一旦细胞达到 70% 汇合，在接种进行实验之前将细胞传代两次。
10.为了传代细胞，从 100 mm 组织培养板中取出用过的培养基。
11.用 4 mL 的 1× Dulbecco PBS 清洗板。
12.将 1 mL TrypLE 溶液添加到板中，并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育3–5 分钟。将胰蛋白酶化的细胞收集在 15 mL 离心管中。
13.通过向含有胰蛋白酶化细胞的 15 mL 离心管中添加 5 mL MEM+10% FBS 来中和 TrypLE 的影响。
14.室温下160× g离心 5 分钟。丢弃上清液。
15.将沉淀重新悬浮在 1 mL 的 KSFM+GF 介质中，并将 500 μL 添加到两个 100 mm 组织培养板中。在 10 mL 血清移液器的帮助下，将 7.5 mL 完整的 KSFM 介质添加到每个板中，将体积补充到 8 mL。

B.收集 PED 患者的眼泪

注意：在采集样本之前，必须征得患者知情同意。
1.泪液分泌测试通常用于评估各种疾病条件下干燥的程度和严重程度，用于收集眼泪。请注意，为了获得最佳的蛋白质分离效果，最小泪液迁移需要达到 5 毫米。
2.戴上手套，将 Schirmer 试纸条的末端折叠到包装袋内无刻度的一端。
3.从另一端取下泪液分泌条，将折叠端放入双眼下眼睑内，并要求患者闭上眼睛。
4.5 分钟后，从双眼移除 Schirmer 试纸条。
5.撕裂迁移距离由刻度标记记录。
6.收集条带并将含有吸附的眼泪的整个条带放入标有完整患者信息的 1.5 mL 微量离心管 (MCT) 中。
注意：泪液收集过程中需要注意的重要参数包括受影响的眼睛、患者用药以及泪液迁移的距离。
7.泪液收集后，立即将管置于冰上（图 2）。
8.接下来，重复步骤 B2–B7 收集第二轮眼泪。对于对照样本，从未患有任何眼部疾病的患者身上收集眼泪。
9.最后，将小瓶储存在-20°C冰箱中；这些可以在六个月内使用。

图 2. 对照和患者眼睛泪液收集方法示意图

C.从患者泪液中提取蛋白质

1.在冰上解冻泪瓶。
2.使用 200 μL 移液器将 200 μL 1 × PBS 添加到每个小瓶中。从泪液样本中提取蛋白质时，不得添加蛋白酶抑制剂混合物，这一点非常重要，因为它会干扰蛋白质活性。
3.借助 1,000 μL移液器吸头，研磨 MCT 中的 Schirmer 条带。
4.使用涡旋器涡旋 30 秒，然后在冰上孵育 2 分钟。
5.重复步骤 C4 3-4 次。
6.将 MCT 以 16,000 ×离心 g在 4 °C下保持 5 分钟。
7.μ L移液器收集新鲜 1.5 mL MCT 中存在的上清液中提取的蛋白质。
8.使用 NanoDrop 测量 280 nm 处的吸光度来定量蛋白质（图 3）。
9.对于 NanoDrop 的蛋白质浓度测量，首先使用 2.5 μL移液器用 1 μL 1 × PBS设置空白。用 Kimwipes 清洁底座。
10.接下来，按照步骤 C9添加 1 μL待定量样品，并测量 280 nm 处的吸光度。注意阅读。
11.使用 2 mL 注射器连接 0.22 μm PES 注射器过滤器来过滤提取的蛋白质。
12.使用 1,000 μL 移液器将 500 μL KSFM-GF 介质添加到 2 mL 注射器中，平衡过滤器。过滤介质，然后丢弃过滤后的介质。
13.接下来，在使用 0.22 μm PES 注射器过滤器处理细胞之前过滤泪液蛋白。
14.将 200 μL 泪液蛋白添加到 II 级生物安全柜内的同一注射器过滤器中，并将过滤后的泪液蛋白收集到无菌 15 mL 锥形离心管中。
笔记：请注意，必须用介质平衡注射器过滤器，以防止过滤过程中泪液蛋白的损失。

图 3. 从 Schirmer 试纸条中提取蛋白质的示意图

D.实验用 HCLE 细胞的接种

1.使用先前准备的 70% 汇合度的 HCLE 细胞的 100 mm 组织培养皿来播种实验。
2.使用 BSL2 安全柜中的 10 mL 血清移液器从培养皿中丢弃用过的 KSFM 介质。
3.使用 1,000 μL 移液器用 3–4 mL 的 1 × Dulbecco's PBS 清洗板一次。
4.添加 1. 5 mL 的 TrypLE 使用 1,000 μL 移液器从板中取出 1 × PBS 后，将溶液添加到板中，并将板在 CO 2培养箱中于 37 °C孵育5 分钟。
5.2培养箱中取出板，轻敲板两侧以移出胰蛋白酶化的细胞。
6.在 II 类生物安全柜中，将胰蛋白酶化的细胞收集在含有 5 mL MEM+10% FBS 溶液的 15 mL 离心管中，以中和 TrypLE 的影响。将细胞以 160 ×离心 g在转桶离心机中室温离心 5 分钟。
7.丢弃上清液。使用 1,000 μL 移液器将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 KSFM+GF 介质中。
8.使用 10 μL 移液器将 10 μL 细胞与 10 μL 台盼蓝溶液混合。将 10 μL 该混合物添加到血细胞计数器的一个室中。
9.打开自动细胞计数器对细胞进行计数。
10.将血球计数器插入自动细胞计数器中。调整亮度以聚焦细胞。然后，测量细胞密度，如自动细胞计数器计算的活细胞百分比所示。在 1 mL KSFM+GF 介质中的 12 孔组织培养板中播种 50,000 个细胞/孔，在 CO 2培养箱中于 37 °C 培养 24 小时。

E.用从眼泪中分离的蛋白质处理 HCLE 细胞

1.一旦密度达到 60%–70% 汇合，即播种后约 20 小时，用泪液蛋白处理细胞。
2.使用 1,000 μL 移液器从 12 孔接种板的每个孔中取出完整介质。
3.× PBS清洗细胞一次，以去除剩余的生长因子。
4.使用 1,000 μL 移液器将 1 mL 不完整的 KSFM-GF 介质添加到每个孔中。
5.以逐滴方式将等浓度的对照和测试泪液蛋白添加到各自的孔中。用于体外处理细胞的蛋白质浓度范围为每孔 60–100 μg/mL。
6.将泪液蛋白处理的细胞在 CO 2培养箱中于 37 °C孵育48 小时。
7.注意用患病患者的泪液蛋白处理 HCLE 细胞时发生的形态变化。（图4）

图 4. 使用 EVOS 对人角膜缘上皮 (HCLE) 细胞进行泪液处理后观察到的形态变化核心成像系统。 A. 对照 HCLE 细胞呈立方形，维持上皮分层。 B. 用患病的持续性上皮缺陷 (PED) 患者的蛋白质提取物处理的 HCLE 细胞被发现更圆，细胞数量减少，细胞空泡数量增加，从而破坏了正常的分层过程。请注意实验结束时细胞外观、细胞囊泡和细胞总数的变化。

F.使用明胶酶谱法分析 MMP 活性

1.48 小时后，将对照细胞和泪液蛋白处理细胞的培养上清液收集到 1.5 mL Eppendorf 管中，通过明胶酶谱检查 MMP 的活性。
2.按照步骤 C9–C10，使用 NanoDrop 估计上清液的蛋白质浓度。
笔记：请注意，为了估计培养物上清液的蛋白质浓度，使用不含生长因子的培养基来设置空白（在本例中为 KSFM w/o GF）
3.接下来，将等蛋白浓度的健康对照泪液和患者泪液处理的培养物上清液与 4 ×凝胶上样染料混合。使用 200 μL 移液器混合。
笔记：请确保在样品制备过程中避免加热样品或添加任何还原剂（如β-巯基乙醇）。
4.使用 40% 丙烯酰胺、TEMED、2.5× Tris-SDS 缓冲液（pH 8.8）、5× Tris-SDS 缓冲液（pH 6.8）和 APS与水中制备的 1 mg/mL 明胶合并，制备 8% 丙烯酰胺凝胶。
5.用NuPage 样品缓冲液 (1×)制成的蛋白质样品和预染色的蛋白质梯加载到凝胶上。
6.使用迷你凝胶槽装置在 30 mA 下运行凝胶 1.5 小时。
7.当染料完全流失后，停止运行凝胶。
8.将凝胶转移到染色盒中，并在 30 mL 的 1% Triton X -100 中在摇床中孵育 30 分钟。
注意：请注意，明胶酶谱应在 1% Triton X-100 中孵育，以除去可能影响 MMP 活性的 SDS 和复性蛋白酶。
9.丢弃 1% TritonX-100 溶液。用 Milli-Q 水冲洗凝胶 3 次，除去残留的 Triton X-100。
10.将 30 mL 显影缓冲液添加到凝胶中。 37°C 孵育过夜。
11.第二天，除去显影缓冲液。在摇床中用 15 mL 考马斯蓝染色剂将凝胶染色 10 分钟。
12.将凝胶在脱色溶液中脱色 5-7 分钟。
笔记：必须小心不要使凝胶广泛脱色。
13.除去脱色溶液并将凝胶储存在高压灭菌水中。使用凝胶文档系统可视化凝胶，检查指示 MMP 活性的清晰条带（图 5 显示描述 MMP9 水平的明胶酶谱）。
14.您可以使用 ImageJ 量化对照样本和测试样本的差异。有关明胶酶谱中 MMP9 水平的光密度分析的详细信息，请参阅[7] 。

图 5. 明胶酶谱图描绘了对照和持续性上皮缺陷 (PED) 患者经泪液蛋白处理的人角膜缘上皮 (HCLE) 细胞培养物上清液中 MMP9 活性的水平

G.泪液蛋白处理的 HCLE 细胞的基因表达分析

1.按照制造商的说明，在 RNA 裂解缓冲液中裂解细胞，并使用 Qiagen Mini-RNA 分离试剂盒从细胞中分离 RNA。
2.按照步骤 C9–C10，使用 NanoDrop 测量 260 nm 处的吸光度来量化 RNA 浓度。使用 RNA 分离试剂盒中提供的洗脱缓冲液设置空白以定量 RNA。
3.在 20 μL 中制备 800 ng cDNA 所需的 RNA 浓度在 90–105 ng/μL 范围内。为了确保一致性，应按照制造商提供的说明，使用 Verso cDNA 合成试剂盒将对照样品和测试样品转化为等浓度的 RNA 至 c-DNA。使用 SYBR Green 在 Azure Biosystems qPCR 系统上对重复样本执行实时 PCR 分析。运行看家基因 β-肌动蛋白和 RPL10，研究对促炎细胞因子（如 TNF-α、IL-1β、IL-6、TGFβ1 和 TGF-β2）、细胞间通讯、角膜上皮稳态基因的影响（例如 E-钙粘蛋白、β-连环蛋白和桥粒芯糖蛋白）、转录因子如 KLF4（细胞周期抑制剂、EMT 调节剂、维持角膜上皮稳态）以及其他基因如 GPX4 和 NCO4。
4.对于实时 PCR，将 c-DNA 稀释至最终比例 1:10。使用 SYBR green 使用 5 μL 稀释的 c-DNA 制备 15 μL 的最终反应。
5.在 96 孔 Azure qPCR 板中重复运行样品。
6.循环设置如下：
a.第 1 步：95°C，3 分钟
b.步骤 2：95°C，15 秒
c.步骤 3：60°C，20 秒
d.第4步：转到第2步，40次
e.第五步：启动60℃；结束95℃
7.使用 Azure Cielo Manager 软件和 Microsoft Excel 进行 qPCR 数据分析。
8.采用管家基因 RPL10 和 β-肌动蛋白的几何平均值进行数据标准化。
9.利用基因的相对表达量 (ΔΔCt) 来呈现结果，将疾病组与对照组进行比较。
10.使用 Prism 9 生成图表。在图形表示中纳入 qPCR 数据平均值的标准化倍数变化和标准误差。
11.分析图表以解释疾病组和对照组之间的相对表达水平。
12.通过比较每个基因的标准化倍数变化和平均值的标准误差来呈现结果。（实时荧光定量PCR得到的基因表达数据见图6。）

图 6. 用泪液蛋白处理的 HCLE 细胞的基因表达分析 (N = 3)。 A. 在对照组和 PED 泪液治疗组中研究了促炎细胞因子的转录水平变化。 B. 分析对照组和 PED 泪液治疗组角膜稳态标志物和转录因子的基因表达变化。图中的误差线代表平均值的标准误差。进行了未配对的 t 检验，星号 (*) 表示统计显着性 (p < 0.05) [7] 。

协议验证
•杜塔等人。（2023）。延长炎和传染性变化在这角膜上皮细胞与持续性上皮细胞缺陷 (PED) 相关。病原体（图 4，面板 A 和 B）。

致谢

AT 感谢 SERB-DST 启动研究资助和 Eicher 集团基金会 (EGF) 对本研究的支持。

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

参考

1.Azkargorta, M.、Soria, J.、Acera, A.、Iloro, I. 和 Elortza, F. (2017)。眼科中的人泪液蛋白质组学和肽组学：将蛋白质组生物标志物转化为临床实践。 J.蛋白质组学150：359–367。 doi：10.1016/j.jprot.2016.05.006
2.Raposo, AC、Portela, RD、Aldrovani, M.、Barral, TD、Cury, D. 和 Oriá, AP (2020)。人类、家养哺乳动物、爬行动物和鸟类眼泪成分的比较分析。正面。兽医。科学。 7：e00283。 doi: 10.3389/fvets.2020.00283
3.Torok, Z.、Peto, T.、Csosz, E.、Tukacs, E.、Molnar, A.、Maros-Szabo, Z.、Berta, A.、Tozser, J.、Hajdu, A.、Nagy, V .，等人。（2013）。用于糖尿病视网膜病变筛查的泪液蛋白质组学多标记物。 BMC 眼科13(1)：e1186/1471–2415–13–40。号码：10.1186/1471-2415-13-40
4.Aluru, SV、Agarwal, S.、Srinivasan, B.、Iyer, GK、Rajaappa, SM、Tatu, U.、Padmanabhan, P.、Subramanian, N. 和 Narayanasamy, A. (2012)。泪液中富含泪腺脯氨酸 4 (LPRR4) 蛋白是干眼综合症的潜在生物标志物。《公共科学图书馆一号》 7(12)：e51979。 doi：10.1371/journal.pone.0051979
5.Ambroziak, AM、Szaflik, J.、Szaflik, JP、Ambroziak, M.、Witkiewicz, J.、Skopiñski, P. (2016)。眼表面的免疫调节：综述。分。欧元。 J.免疫学。 41（2）：195-208。 DOI：10.5114/ceji.2016.60995
6.Hagan, S.、Martin, E. 和 Enríquez-de-Salamanca, A. (2016)。眼部和全身疾病中的泪液生物标志物：预测、预防和个性化医疗的潜在用途。 EPMA 期刊7(1)：e1186/s13167–016–0065–3。号码：10.1186/s13167-016-0065-3
7.杜塔，T.，桑万，J.，蒙达尔，M.，沃拉，M.，尼迪，V.，古尔，A.，卡普尔，N.，古普塔，N.，博米克，T.，钱德鲁，A.，等人。（2023）。角膜上皮的长期炎症和感染性变化与持续性上皮缺损 (PED) 相关。病原体12(2): 261.doi: 10.3390/病原体12020261
8. Hefley, BS、Deighan, C.、Vasini, B.、Khan, A.、Hjortdal, J.、Riaz, KM、Liu, Y. 和 Karamichos, D. (2022)。揭示圆锥角膜中泪液细胞外囊泡的存在。过期。眼科研究。 224：109242。doi ：10.1016/j.exer.2022.109242