材料与试剂

试剂

1.联苯-4,4'-二甲酸（BPDC-COOH）（Sigma-Aldrich，目录号：225266）
2.NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
3.2-异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-4）
4.CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
5.胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426）
6.1-氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-（甲磺酰氧基甲基）吡咯啉（MTSL）（Toronto Research Chemicals，目录号：O872400）
7.乙腈（Fisher Scientific，目录号：A21-200）
8.3-（N-吗啉代）丙磺酸，4-吗啉丙磺酸（MOPS）（Sigma-Aldrich，目录号：M1254）
9.氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
10.4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-（2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）

解决方案

1.旋转缓冲液 (pH 6.8)（参见配方）
2.HEPES 缓冲液 (pH 7.4)（参见配方）

食谱

1.旋转缓冲液 (pH 6.8)
试剂最终浓度数量
MOPS50毫米10.46克
氯化钠25毫米1.46克
水分子_不适用1升
全部的不适用1升

2.HEPES 缓冲液（pH 7.4）
试剂最终浓度数量
HEPES50毫米11.92克
氯化钠50毫米2.92克
水分子_不适用1升
全部的不适用1升

实验室用品

1.烧杯（100 mL）（Fisher Scientific，目录号：02-540N）
2.磁性旋转棒（VWR，目录号：58948-080）
3.布氏漏斗（Sigma-Aldrich，目录号：Z247340）
4.侧臂烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z740685）
5.微量离心管（Fisher Scientific ，目录号：02-682-004）
6.Amicon旋转浓缩器（Millipore Sigma，目录号：ACS 501024）
7.硼硅酸盐毛细管（DWK Life Sciences，目录号：13-707-47）
8.滤纸（Millipore Sigma，目录号：WHA1093125）

设备

1.烤箱，样品干燥（Global Industrial，目录号：T9FB918772）
2.搅拌热板，混合（ Thermo Scientific，目录号：SP88854100）
3.涡旋，混合（VWR，目录号：10153-838）
4.章动混合器，孵化（VWR，目录号：82009-202）
5.离心机，分离（ Thermo Scientific，目录号：75887203）
6.EPR，动态监测（布鲁克，型号：ESC-106）
7.质谱仪，肽质量（水，型号：SYNAPT MS）
8.超高效液相色谱 (UPLC)、肽分离（ACQUITY UPLC I-class 系统）

软件和数据集

软件和算法

1.用于 CW EPR 光谱模拟的多组分 ( https://sites.google.com/site/altenbach/labview-programs/epr-programs/multicomponent?authuser=0 )
2.确认肽序列ProteinLynx Global SERVER 3.0.3

程序

获得蛋白酶底物裂解全貌的关键是通过 EPR 实时获取不同底物片段长度/数量的变化，并通过 MS 获取整个序列的肽序列。这需要固定蛋白酶，然后分别进行 EPR 和 MS 测量。

A.MOM 上的蛋白酶固定化

这一主要步骤是在 MOM 形成过程中通过共沉淀将目标蛋白酶固定到 MOM 上。我们选择 Ca-BPDC 作为蛋白酶固定的 MOM，因为它在与酶共结晶时具有高可靠性和重现性，并且通过这种方式形成了适当尺寸的共晶 [28, 29]。该材料是通过在水条件（酶友好的环境）中孵育 CaCl 2和联苯-4,4'-二羧酸二钠（BPDC-Na 2 ）而构建的。在此，联苯-4,4'-二甲酸(BPDC-COOH)由于其在水中的溶解度低而必须转化为BPDC-Na 2 。

1.2的制备
a.将 9.69 g (~40 mmol) BPDC-COOH 和 3.20 g (~80 mmol) NaOH 以 1:2 的摩尔比混合在 100 mL 双去离子 (dd-) 水中。立即混合后，由于 BPDC-COOH 在水中的溶解度较低，反应体系应呈白色混浊。
b.将混合物在室温下剧烈搅拌2小时。随着时间的推移，由于BPDC-Na 2的溶解度增强，将获得透明溶液。
c.向混合物中缓慢添加1L冷2-异丙醇以沉淀BPDC-Na 2并通过标准滤纸过滤收集获得的BPDC-Na 2 。
d.用冷异丙醇清洗收集的滤液，直至最终 pH 值为 7.0（对于流通液）。通常需要 0.5 L 冷异丙醇。
e.将获得的BPDC-Na 2在75℃烘箱中干燥过夜。
2.Ca-BPDC 上蛋白酶的固定化
a.2和 BPDC-Na 2储备溶液。通常，库存量为 5–10 mL，可保存几个月。
b.将 50 μL 0.25 M BPDC-Na 2分散到 1 mL dd-水中，然后添加 20 μL 20 mg/mL 蛋白酶和 50 μL 0.5 M CaCl 2 。添加的蛋白酶的量是可调节的，具体取决于其溶解度和活性。在这里，我们以胰蛋白酶（一种广泛使用的丝氨酸蛋白酶）为例。
c.立即通过剧烈涡旋混合反应系统 30 秒，并在环境温度下孵育过夜，并进行温和的章动（建议~25 RPM 章动速率）。
d.蛋白酶@Ca-BPDC用dd水洗涤3次。每次洗涤均以 19,000× g离心 5 分钟，然后重悬于 1 mL 水中。通过测试形成的 Ca-BPDC 的晶体特性数周来判断，获得的共晶可以在 4℃ 下保存数周（表征参见步骤 A3）。
注意：必须通过确定最终洗涤后上清液中不存在蛋白酶（通过检查蛋白质在 280 nm 处的紫外吸收）或其他涉及的化学物质（通过检查 MS）来确认反应混合物中未反应物质的完全去除。如果需要，可以进行更多的洗涤。根据蛋白酶的情况，如果自降解严重，章动可以在冰箱中进行。
3.表征
通过标准 MOM 表征方法（例如共焦荧光显微镜、粉末 X 射线衍射仪、热重分析和扫描电子显微镜）确认 Ca-BPDC 的结构和蛋白酶的内含物。
注意：通常，我们不会在 Ca 基 MOM 上运行氮等温线 [也称为 BET（ Brunauer 、Emmett 和 Teller）实验]。因为这些技术已经很成熟，所以这里没有提供运行每个设备的详细过程[25]。

B.底物的自旋标记

这一主要步骤是创建 EPR 敏感底物来监测蛋白水解过程。蛋白质动力学需要自旋标记，因此大多数蛋白质需要通过 EPR 进行蛋白质大小研究。本协议选择 T4 噬菌体溶菌酶 (T4L) 作为示例以方便讨论，因为其结构经过充分研究，赖氨酸 (K) 和精氨酸 (R) 数量较多，被称为胰蛋白酶的典型切割位点[31]。我们正在使用最广泛使用的自旋标记方法，即通过Hubbell 和同事开发的基于甲硫代磺酸盐的硝基氧标记试剂对蛋白质进行 SDSL [32, 33]。这种方法的基础是在感兴趣的位点产生单个半胱氨酸突变，然后与标记试剂反应。原则上，任何底物蛋白都可以通过这种方式进行研究。
注意：对于富含半胱氨酸的底物，需要替代的标记策略（见下文）[34]。

1.底物半胱氨酸突变体的表达
a.根据底物的结构，需要创建多个单一半胱氨酸突变体以覆盖底物的大部分区域并随着时间的推移监测它们的裂解。一般规则是为每个二级结构（例如 α 螺旋、β 链和环）放置至少一个半胱氨酸，以覆盖蛋白酶对每个片段的降解。如果在蛋白水解研究中需要特别注意目标蛋白的特定区域，则可以在这些区域放置更多的cys突变体。半胱氨酸突变体的位置应该是溶剂可及的。例如，在 T4L 中，一次生成一个 44C、65C、72C、89C、109C、118C、131C 和 151C（每个“C”表示相应位置的天然残基突变为半胱氨酸），其中足以覆盖蛋白质的大部分区域。定点诱变的程序在文献中有详细记载，因此这里不再重复[32]。每个突变的验证可以通过商业上可用的标准测序服务进行。如今，测序成本很容易负担。
b.生成的底物突变体应在适当的细胞系中过度表达和纯化。在我们的例子中，T4L 突变体在大肠杆菌中表达，并使用已发布的程序进行纯化 [27, 35]，为了该协议的简洁性，此处不再重复。
c.如果可能的话，应通过圆二色性 (CD) 光谱、蛋白质凝胶电泳和蛋白质活性来验证所获得的底物突变体的纯度。在我们的案例中，每个 T4L 突变体都被证实具有预期的二级结构、分子量和催化活性 [27, 32]。
2.底物突变体的自旋标记
a.最广泛使用的半胱氨酸突变体自旋标记化合物是1-Oxyl-2,2,5,5-四甲基-Δ3-(甲磺酰氧基甲基)吡咯啉(MTSL)，可从 Toronto Research Chemicals, Inc. 购买。粉末 MTSL 应溶解乙腈中，浓度为 200 mM。
b.将 10 倍摩尔过量的 MTSL 添加到纯化的 T4L 突变体中，并在 4°C 下孵育过夜。这将产生一个自旋标记的侧链，通常指定为 R1。通常，蛋白质浓度取决于其稳定性。对于大多数蛋白质，我们建议保持相对较低的蛋白质浓度，大约。 < 几十微摩尔，以避免标记过程中聚集。
c.Amicon旋转浓缩器（10,000 MWCO 截止值，50 mL）去除多余的 MTSL 。
d.用旋转缓冲液清洗旋转标记的 T4L 突变体 3 次，以进一步去除多余的 MTSL。所有未反应的标记化合物的去除应通过 EPR 确认。典型的 EPR 设置包括 ~1 mW功率、3300–3400 G 扫描范围、每次扫描 30 秒的扫描时间、1 G 调制深度和 250 视频增益。不完全去除通常由标记蛋白质的常规 EPR 光谱顶部的额外尖锐成分表示。请注意，由于蛋白水解反应也会产生短肽，从而产生尖锐的光谱成分，因此完全去除所有未反应的标记试剂至关重要（图 1）。

图1。完整的自旋标记蛋白 (A) 和带有自旋标记的切割片段 (B) 的代表性电子顺磁共振 (EPR) 谱。切割的蛋白质片段越小，连续波 (CW) EPR 光谱越清晰。

注意：对于富含半胱氨酸的蛋白质，需要采用基于非天然氨基酸的自旋标记和相应的标记试剂，如文献中详述[34, 36]。标记试剂的选择需要额外谨慎，因此应优先选择相对更刚性的自旋标记，例如评论中讨论的 R1p 和 RX [26]。这样，连续波 (CW) EPR 光谱的变窄主要是由底物蛋白的裂解引起的，从而最大限度地提高了 CW EPR 光谱对蛋白质大小的敏感性。完全去除所有未反应的标记试剂也很重要。

C.蛋白水解过程的 EPR 研究

1.解决方案状态 EPR 研究作为对照
时间分辨 EPR 的一个优点是监测旋转翻滚速率的变化，从而监测在溶液状态和 MOM 存在的蛋白酶存在下标记的底物蛋白片段的分子量。通常，蛋白水解过程可能需要几分钟到几小时，具体取决于底物和蛋白酶的浓度。因此，有必要选择适当的浓度，以便无需长时间的实验时间即可揭示整个过程。此外，为了确认操作，通常需要控制溶液中针对底物的游离蛋白酶活性。最后，需要唯一底物的 EPR 光谱，以便与降解的底物的 EPR 光谱进行比较并确认裂解。在我们的案例中，我们通过配备空腔谐振器 (W1700750) 的 Bruker ECS-106 电子顺磁共振 (EPR) 波谱仪实时监测自旋标记 T4L 降解时的胰蛋白酶活性。在下面讨论的后续步骤之前获取浓度为 1 mg/mL 的每个自旋标记 T4 突变体的光谱。
a.将适量的蛋白酶溶解于 HEPES 缓冲液中，制成 1.75 mg/mL（终浓度的 10 倍）的蛋白酶储备液。请注意，由于该储备液有自消化倾向，因此应新鲜配制。此外，HEPES 缓冲液需要与 MOM 研究保持一致，因为 MOM 在 HEPES 缓冲液中稳定。
b.使用 HEPES 缓冲液将自旋标记 T4L 底物制备至 10 mg/mL。根据底物溶解度，可以调整该库存浓度。
c.将 2 μL储备蛋白酶和 2 μL 10 mg/mL T4 底物放入 16 μL HEPES 缓冲液中，分别制作蛋白酶和 T4L 终浓度为 0.175 mg/mL 和 1 mg/mL 的蛋白水解系统。
d.将混合物装入硼硅酸盐毛细管中，并立即进行时间分辨 EPR 研究 2 小时，间隔 5 分钟。我们发现 2 小时足以观察使用上述浓度的蛋白水解过程的完成情况。
e.观察功率为 200 µW，调制频率为 100 kHz，调制幅度为 0.5 G，用于采集所有 CW EPR 光谱。请注意，需要窄调制幅度来检测源自裂解的短肽链的光谱成分的窄线宽，请记住，肽越短，其旋转翻滚越快，并且线宽越窄。
注意：蛋白酶和底物的浓度可能会根据研究系统和仪器灵敏度而变化。无法获取 0 分钟时的 EPR 数据，但通常假设立即混合后会发生零降解。 5 分钟的间隔通常足以观察整个过程，但根据蛋白酶和底物、仪器灵敏度和反应速率，可以应用更小的间隔。
2.蛋白酶@MOM上的 EPR降解肽底物
a.离心 800 µL蛋白酶@CaBPDC悬浮液以收集所有复合材料。然后，将复合物重新悬浮到 20 μL 缓冲液中，其中含有 1 mg/mL 的自旋标记 T4 底物。
b.将混合物装入硼硅酸盐毛细管中，并立即进行时间分辨 EPR 研究 2 小时，间隔 5 分钟。共晶和底物溶液的混合物的加载通常是通过两端开放的管的毛细管效应来完成的。装载完成后，应将装有样品的一端密封，以防止测量过程中泄漏。
c.观察功率为 200 µW，调制频率为 100 kHz，调制幅度为 0.5 G，用于采集所有 CW EPR 光谱。

D.MS/MS 数据采集

MOM 上的蛋白酶固定化可以轻松地与可溶性产物分离，从而可以在不受蛋白酶干扰的情况下对产物整体进行 MS 分析。与 EPR 测量的主要区别在于，在 MS 研究中需要最大限度地降低缓冲液中的离子浓度，这需要通过洗涤-重悬进行缓冲液切换。与缓冲液中相比，反应速率也会降低。然而，尽管反应动力学可以改变，但能够进行时间分辨质谱研究仍将提供有价值的信息，例如底物裂解过程动态图上各种断裂蛋白质片段的序列，支持和证实了研究结果EPR。因此，MS 在此协议中是必要的。
1.由于反应速率较慢且实际操作困难，MS样品制备原则上不需要提供与EPR研究相同的时间分辨率。例如，在我们的例子中，将 40 倍的胰蛋白酶@Ca-BPDC与 T4L（不需要旋转标记）在 120 μL中混合，其中复合物浓度为 1 mg/mL，T4L 为 20 μL。在 30 分钟、1 小时、1.5 小时、2 小时、2.5 小时和 3 小时时从反应中除去，然后快速离心（19,000× g ， 1 分钟）并收集上清液。
2.每个上清液均应使用 dd-水稀释至 100 ng/ μL ，以匹配质谱分析最灵敏的浓度范围。
3.数据采集和分析可以在常规的现代质谱仪中完成。在我们的案例中，采用了由MassLynx 4.2 软件控制的 Waters SYNAPT MS 系统。使用配备 2.1 × 100 mm BEH300 1.7 μm肽分离技术 C18 色谱柱的ACQUITY I-class UPLC 系统来分离片段化多肽。
4.在初始条件 (3% B) 下非梯度流 1 分钟后，以 20 分钟梯度 (3%–37% B) 运行每个样品。流动相 A 为 0.1% 甲酸 (FA) 水溶液，B 为 0.1% FA 乙腈溶液。流速为0.2mL/min，柱温为65℃。辅助泵输送Lockmass溶液 [100 fmol / µL (GLu1)-纤维蛋白肽 B (GFP)，溶于 50:50 ACN/水中，含有 0.1% FA] 作为质量精度参考。
5.仪器在正离子 V 模式下运行。使用交替的低碰撞能量 (5 V) 和高碰撞能量（从 17 升至 40 V）采集来采集肽前体 (MS) 和碎片 (MSE) 数据。扫描时间为 0.5 秒（总占空比为 1 秒）。毛细管电压为 3.0 kV，源温度 110 °C，锥孔电压 30 V，锥孔气流 10 L/h。每 1 分钟对锁喷雾通道进行一次采样。
6.ProteinLynx Global SERVER 3.0.3 的IdentityE软件处理获取的数据。根据由单一蛋白质（在我们的例子中为 T4L）序列组成的手动数据库搜索处理后的数据。初级消化试剂将被选为非特异性试剂，而半胱氨酸 (C)脲甲基化和蛋氨酸 (M) 氧化将被允许作为本次搜索中的可选修饰。完整蛋白质的平均质量可以通过MassLynx软件确定。

数据分析

这一主要步骤是通过对从 EPR 和 MS 获得的数据进行光谱分析来描述蛋白水解过程。为了从 EPR 数据中获得切割的短肽的群体变化，需要进行光谱模拟。由于模拟程序已经发布，下面仅强调注意事项和具体细节[27]。另一个好处是，通过绘制 T4L 切割片段的群体图，可以获得反应动力学并比较 MOM 对蛋白酶性能的影响（见下文）。

1.Hubbell 教授网站上提供的多组分程序模拟所有收集的 EPR 光谱。请注意，软件安装需要使用 National Instrument 提供的Labview运行时引擎。在模拟之前，需要对所有光谱进行仔细的基线校正和归一化。基线校正、光谱归一化和模拟的详细信息可以在我们通过 SDSL-EPR 解析酶方向和动力学的协议中找到 [32]。
与我们之前的模拟工作的一个关键区别是，通过 EPR 进行蛋白酶研究所涉及的两个组件不具有与自旋标签的非常缓慢和/或高度限制运动相对应的传统固定峰。相反，我们模拟中的一个成分源自未切割的基材；线宽和位置属于经典移动组件的范围，如我们最近的协议中所述。另一种成分源自由于裂解而产生的较短肽，导致位于靠近经典移动峰的更尖锐的峰。只要在切割过程中较尖锐的成分填充 5%–10%，我们使用的软件就能够区分这两个成分。
注意：当序列中不再有 K 和 R 残基可用于蛋白水解时，蛋白酶将继续切割其他肽键。这将使截短的肽随着时间的推移变得越来越短。由于连续波 EPR 光谱对亚纳秒运动敏感，因此当肽段太短时，EPR 就会失去敏感性。因此，我们的数据分析仅集中在前 30-40 分钟。代表性数据如图 2 所示。

图 2.使用胰蛋白酶 (a) 和胰蛋白酶@Ca-BPDC (b)在最佳胰蛋白酶浓度下 2 小时内降解 T4L 151R1 的二维电子顺磁共振 (2D-EPR) 数据

2.绘制移动群体与时间的关系图，以揭示旋转标记蛋白质片段的旋转速率和群体的变化，从而揭示蛋白水解过程。在所有自旋标记站点，流动人口随着时间的推移而增加，然后趋于平缓。在 40 分钟开始时，较大的流动群体斜率表明生成了较短的片段化多肽（图 3）。

图 3. 绘制 T4L 底物每个标记片段与游离胰蛋白酶（左）和 Ca-BPDC 封装的胰蛋白酶（右）反应 40 分钟后的流动群体图

蛋白水解动力学也可以通过拟合 Michalis-Menten 方程从图中获得。例如，在我们的案例中（图 4），我们发现与游离胰蛋白酶相比，减小的k m表明胰蛋白酶@CaBPDC对 151R1的结合亲和力增强。胰蛋白酶@CaBPDC的V max低于缓冲液中游离胰蛋白酶的V max 。然而，这并不意味着胰蛋白酶@CaBPDC的催化效率较低。为了比较酶的催化效率，通常使用k cat / km ，其中k cat是周转数，其与V max 相关，关系为V max = k cat [ E Total ] 。基于增强的k cat / km ，我们认为通过将胰蛋白酶包埋在 Ca-MOM 中可以将催化效率提高大约 5-10 倍。

图 4. 将速度 (V) 拟合为底物浓度的函数，以确定不同底物 (151R1) 浓度下游离胰蛋白酶和 MOM 封装的胰蛋白酶的V max和 K m

3.对于MS，以胰蛋白酶为例，众所周知，它水解C末端的精氨酸和赖氨酸的肽键。另外，底物的氨基酸序列也是已知的。 ProteinLynx Global SERVER 3.0.3的IdentityE软件可以得到所有片段化肽序列及其强度。典型的 MS 数据集如图 5 所示。从反应混合物中分离出来的蛋白水解产物含有不同时间点的底物和胰蛋白酶@Ca-BPDC 。胰蛋白酶@Ca-BPDC复合材料和溶液中断裂的肽片段之间易于分离，可以对底物蛋白和水解肽的整体进行表征。红色块中突出显示的峰强度的下降证实了蛋白质分子质量的降低（图 5）。

图 5. 代表胰蛋白酶@Ca-BPDC研究中蛋白水解产物的质谱 (MS) 数据

4.绘制来自 MS 的不同多肽的强度与时间线的关系。某个多肽片段的快速生长表明该片段附近的切割位点更容易被胰蛋白酶捕获并分解。因此，强度和斜率粗略地监测蛋白水解过程。代表性数据集如图 6 所示。大多数片段在切割后显示出随着时间的推移而增加的数量。

图 6. 胰蛋白酶@CaBPDC催化 T4L 底物时反应开始时（1.5 小时）的代表性质谱 (MS) 数据

5.最后，绘制人口与人口的关系图。需要比较 EPR 和 MS 的时间来确认结果。在我们的例子中，根据 EPR 和 MS，我们发现 66-76 片段更容易被胰蛋白酶切割。证明这一发现的一个快速方法是诱变，其中 65K 发生突变，我们确实观察到 66-76 的消失。 76 位点仍然被切割，导致 61-76 截断，其生成速度要低得多，证实了我们的推测，即 65K 伸出蛋白质有利于 T4L 与胰蛋白酶@Ca-BPDC接触。观察到其他三个显性截断的趋势相似，因为突变不影响这些区域。

协议验证

整个过程在我们最近的工作和补充信息中得到了验证[25]。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

对于更快时间尺度（<30 分钟）的蛋白水解过程，应修改协议以提供更高的时间分辨率。需要注意的是，固定化只能减少两种蛋白酶相互碰撞和裂解的机会；它不能完全防止自我退化。然而，正如我们最近的工作所示，蛋白酶@Ca-BPDC复合材料的可重复使用性非常高，表明固定化蛋白酶的自降解性是微乎其微的[25]。
此外，我们使用的蛋白酶是商业胰蛋白酶，在我们的固定化过程中相对稳定。然而，对于对某些金属离子（ ca.Ca 2+ ）或配体敏感的通用蛋白酶，固定化时应小心。我们最近发表了一篇关于金属离子和配体的更多可能组合来固定水中酶的论文，这可能有助于一般蛋白酶的定制固定化[37]。

故障排除（表 1）

表 1. 故障排除
麻烦可能的原因建议的解决方案
动力学太慢或太快蛋白酶@CaMOMs浓度不当调整蛋白酶@CaMOMs的浓度
固定化后蛋白酶活性低共结晶过程中的自降解调整蛋白酶初始浓度；降低共结晶温度

致谢

这项工作得到了国家科学基金会（NSF：MCB 1942596 和 DMR 2306137）的支持。我们感谢 Peter G. Fajer 博士向我们机构（北达科他州立大学）慷慨捐赠 Bruker ECS-106，感谢 Wayne Hubbell 博士慷慨提供 EPR 数据分析软件。该协议改编自我们最近的工作（Li et al., 2023）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

这项工作没有涉及人类受试者。

参考

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