材料与试剂

整体切片和冷冻切片之间常见
1.16％多聚甲醛溶液（电子显微镜科学，目录号：15710）
2.甲醇（ MetOH ）（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
3.小鼠抗 E-钙粘蛋白单克隆抗体（Monoclonal Ecad Ab）（BD Biosciences，目录号：610182）
4.单克隆兔抗体抗磷酸组蛋白 H3 (Ser10) (D2C8)（单克隆 H3P Ab）（Cell Signaling Technology，目录号：3377S）
5.多克隆山羊抗体抗兔 IgG H&L Alexa Fluor 647预吸附（Abcam，目录号：ab150083）或 F(ab')2-山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 647（ Thermo Fisher，目录号：A48285）
6.多克隆山羊抗体抗小鼠 IgG H&L Alexa Fluor 555预吸附（Abcam，目录号：ab150118）或 F(ab')2-山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor TM Plus 555（ Thermo Fisher，目录号：A48287）
7.TWEEN ® 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
8.100 mm 培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
9.马血清，热灭活（ Thermo Fisher ，目录号： 26050070）
10.山羊血清（ Thermo Fisher ，目录号： 16210072）
11.胎牛血清（FBS）（ Thermo Fisher，目录号：A5256801）
12.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich ，目录号： 472301）
13.氮化钠（NaN 3 ）（Sigma-Aldrich ，目录号： S2002）
14.罗氏蛋白质封闭试剂溶液（Sigma-Aldrich ，目录号： 11921673001）
15.甘油（Sigma-Aldrich ，目录号： G7893）
16.YOYO-1 碘化物 (491/509)，1 mM DMSO 溶液（ Thermo Fisher，目录号： Y3601）
17.30 mL 聚丙烯罐（Fisher Scientific，目录号：02-891A）
18.MS-222（Sigma-Aldrich，目录号：E10521）
19.甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：695076）
20.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
21.氯化钾（ KCl ）（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
22.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S9763）
23.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
24.500 mL 瓶顶真空过滤器，0.22 µm 孔径（Corning，目录号：431118）

整体安装
1.60 毫米培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-757-100B）
2.杜蒙钳（Fisher Scientific，目录号：NC9518792）
3.无菌 50 mL 锥形管（Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
4.10 mL 移液器（Fisher Scientific，目录号：13-678-12E）
5.剃须刀刀片（Fisher Scientific，目录号：12-640）
6.移液管（Fisher Scientific，目录号：13-711-5B）
7.Ibidi USA µ 皿盖玻片底部 35 毫米高培养皿（Fisher Scientific，目录号：50-305-805）
8.白色鹅颈灯（宜家 JANSJÖ 3W 灯）
9.DER 332（Sigma-Aldrich，目录号：31185）
10.DER 736（Sigma-Aldrich，目录号：31191）
11.异佛尔酮二胺（IPDA）（Sigma-Aldrich，目录号：118184）
12.过氧化氢 (H 2 O 2 ) 30% (w/w) H 2 O溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
13.二氯甲烷（DCM）（Sigma-Aldrich，目录号：270997）
14.二苄醚（DBE）（Sigma-Aldrich，目录号：33630）
15.Corning 10 mL 聚苯乙烯血清移液器（Fisher Scientific，目录号：07-200-12）

冷冻切片
1.30% 蔗糖溶液（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）。将溶液储存在 4 °C
2.Falcon TM 15 mL锥形离心管（Fisher Scientific ，目录号： 14-959-49B）
3.Fisherbrand TM一次性基模（ Thermo Fisher，目录号：22-363-552）
4.SuperFrost Plus 显微镜载玻片（Avantor，VWRI631-0108）
5.超级 PAP 笔（ Thermo Fisher，目录号：008899）
6.Triton TM X-100 溶液（Sigma-Aldrich，目录号： 93443)
7.漂白试剂：
a.H 2 O 2 （Sigma-Aldrich，目录号：88597）
b.甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：11814320001）
8.最佳切割温度 (OCT) 嵌入化合物（SAKURA，目录号：4583）
9.TrueBlack脂褐素（ Biotium ，目录号：23007）
10.ProLong Gold 抗淬灭封固剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：P36930）
11.Tsugar记忆微型油漆刷（亚马逊，目录号：ASIN B0BJQ2CC8D）
12.DAPI 溶液 1 mg/mL（ Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）
13.200 度乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）

解决方案

1.PBS-吐温（参见食谱）
2.固定液（参见配方）
3.10% 吐温 20（参见食谱）
4.PBS-Tween-NaN 3 （参见食谱）
5.123 mM NaN 3 （参见配方）
6.漂白溶液（参见配方）
7.25% MetOH （参见配方）
8.50% MetOH （参见配方）
9.75% MetOH （参见配方）
10.封闭液（参见配方）
11.一抗溶液（参见配方）
12.二抗溶液（参见配方）
13.二抗储备液（参见配方）
14.核染料溶液（参见配方）
15.DCM- MetOH （参见食谱）
16.DAPI 解决方案（参见食谱）
17.磷酸盐缓冲盐水 (PBS 1 × pH 7.4)（参见食谱）
18.TrueBlack解决方案（参见配方）

食谱

1.PBS-吐温
试剂_最终浓度数量单元
10% 吐温 20（配方 3）0.1% (0.89 毫米)10毫升
PBS 1 × pH 7.41 ×990毫升
最终体积1,000毫升
笔记：无需调节pH值。

2.固定液
试剂_最终浓度数量单元
16% 多聚甲醛4% (117 万)10毫升
甲酸0.5% (132 毫米)200微升
PBS-吐温 (1 × )（配方 1）1 ×29.8毫升
最终体积40毫升
笔记：无需调节pH值。

3.10% 吐温 20
试剂_最终浓度数量单元
吐温2010% (89 毫米)10毫升
水分子_90毫升
最终体积100毫升
注：过滤溶液（0.22 μm孔径过滤器）。储存于 4°C。无需调节pH值。

4.PBS-吐温-NaN 3
试剂_最终浓度数量单元
123 mM NaN 3 （配方 5）6.15毫米500微升
PBS-吐温（配方 1）9.5毫升
最终体积10毫升
笔记：无需调节pH值。

5.123 毫米 NaN 3
试剂_最终浓度数量单元
氮化钠3123毫米400毫克
PBS 1 × pH 7.450毫升
最终体积50毫升
笔记：无需调节pH值。

6.漂白液
试剂_最终浓度数量单元
30% H 2 O 26% (195 万)2毫升
甲醇80% (1975 万)8毫升
最终体积10毫升
注意：务必配制新鲜的漂白溶液。无需调节pH值。

7.25%甲醇
试剂_最终浓度数量单元
甲醇25% (617 万)12.5毫升
PBS-吐温（配方 1）75%37.5毫升
最终体积50毫升
笔记：无需调节pH值。

8.50%甲醇
试剂_最终浓度数量单元
甲醇50% (1235 万)25毫升
PBS-吐温（配方 1）50%25毫升
最终体积50毫升
笔记：无需调节pH值。

9.75%甲醇
试剂_最终浓度数量单元
甲醇75% (1852 万)37.5毫升
PBS-吐温（配方 1）25%12.5毫升
最终体积50毫升
笔记：无需调节pH值。

10.封闭液
试剂_最终浓度数量单元
马血清2.5%250微升
二甲基亚砜5% (070 万)500微升
123 mM NaN 3 （配方 5）6.15毫米500微升
罗氏封闭液5%500微升
山羊血清10%1毫升
PBS-吐温（配方 1）7.25
最终体积10毫升
笔记：无需调节pH值。

11.一抗溶液
试剂_最终浓度数量单元
H3P 单克隆抗体400 分之一 (92.5 纳克/毫升)10微升
单克隆Ecad抗体200 分之一 (1.25微克/毫升)20微升
二甲基亚砜5% (070 万)200微升
123 mM NaN 3 （配方 5）6.15毫米200微升
胎牛血清10%400微升
PBS-吐温（配方 1）3.17毫升
最终体积4毫升
笔记：无需调节pH值。

12.二抗溶液
试剂_最终浓度数量单元
多克隆抗小鼠 AF555 Ab 库存（配方 13）千分之一（2微克/毫升）10微升
多克隆抗兔 AF647 抗体原液（配方 13）800 分之一 (2.5 μg /mL)8微升
二甲基亚砜5% (070 万)200微升
123 mM NaN 3 （配方 5）6.15毫米200微升
胎牛血清10%400微升
PBS-吐温（配方 1）3.182毫升
最终体积4毫升
笔记：无需调节pH值。

13.二抗储备液
试剂_最终浓度数量单元
多克隆二级抗体1 比 2 (1 毫克/毫升)100微升
甘油50% (678 万)100微升
最终体积200微升
注意：混合均匀。 -20 ℃保存。无需调节pH值。

14.核染料溶液
试剂_最终浓度数量单元
YOYO-1碘化物万分之一 (0.1 nM )1微升
PBS-吐温（配方 1）10毫升
最终体积10毫升
iDISCO清除方法中使用花青染料优于 DAPI（Renier 等人，2014）。无需调节pH值。

15.DCM-甲醇
试剂_最终浓度数量单元
甲醇33.3% (13M)3毫升
扩张型心肌病66.6% (1040 万)6毫升
最终体积9毫升
注意：始终在化学罩中处理 DCM。每次都做新鲜的。无需调节pH值。

16.DAPI解决方案
试剂_最终浓度数量单元
DAPI 1 毫克/毫升2纳克/μL（5.7μM ） _1微升
PBS-吐温（配方 1）第499章微升
最终体积500微升
笔记：无需调节pH值。

17.磷酸盐缓冲盐水 (PBS 1 × pH 7.4)
试剂_最终浓度数量单元
氯化钠136.89毫米8G
氯化钾2.68毫米0.2G
Na 2 HPO 4 ，二元，无水10.14毫米1.44G
KH 2 PO 41.76毫米0.24G
水分子_1 , 000毫升
最终体积1,000毫升
注意：混合成分。用 7 N HCl 将 pH 调节至 7.4。用 H 2 O 达到最终体积。高压灭菌 20 分钟。

18.纯黑解决方案
试剂_最终浓度数量单元
TrueBlack脂褐质1×50微升
200 度乙醇第665章微升
水分子_第285章微升
注意：通过涡旋混合成分。无需调节pH值。

设备

整个切片和冷冻切片共享
1.露天平台摇床（Eppendorf，新不伦瑞克省，Innova 2000，目录号： M1190-0000）
2.转盘共焦显微镜（Nikon CSU-W1）或激光扫描共焦显微镜（Zeiss，型号：LSM 780）
3.成像工作站（65 GB RAM）

整体安装
1.摇床（ Fisherbrand ， Fisher Scientific，目录号： 88-861-025）
2.移液器控制器（ Fisherbrand ， Fisher Scientific，目录号： FB14955202）

冷冻切片
1.低温恒温器（Leica Microsystems Inc.、Leica Biosystems、Leica CM1950）
2.SlideTray载玻片染色系统（Sigma-Aldrich，Z670146-1EA）

软件和数据集

1.斐济（ https://imagej.net/software/fiji/ ）
2.FCS Express 7 研究版（De Novo Software， https://denovosoftware.com/ ）

程序

A.样品采集和固定（整体安装和冷冻切片）

1.将 200 mL 的 100–150 mg/L MS-222 在鱼类系统水中制备到玻璃烧杯中。使用适当大小的网从鱼缸中捕获鱼并将其放入烧杯中。将鱼麻醉至少 5 分钟，然后使用塑料勺将它们转移到培养皿中进行鳍截肢。
2.使用无菌刀片在所需位置截断尾鳍，并允许再生进行到所选时间点（图 1A 和 1B）。为简单起见，我们建议垂直于前后轴进行截肢，去除鳍面积的 50%。大多数翅片在 30% 至 70% 去除面积范围内都会表现出强劲的再生能力。请注意，截肢位置会改变再生速度，如之前报道的那样（ Uemoto et al., 2020）。
3.根据您的研究机构批准的动物护理协议对鱼进行安乐死。我们建议使用低温休克来实施安乐死。将鱼浸入足够量的冷冻系统水（2-4°C）中以允许运动。等到方向和鳃盖运动消失；这可能会因鱼的大小和年龄而异。在失去方向和鳃盖运动停止后，将鱼放置至少 10 分钟，然后按照您所在机构的指南将其放入生物危害废物袋中并存放到生物废物冷冻柜中。
4.将 20 mL 固定液（参见配方 2）倒入 100 mm 培养皿中。
注意：虽然固定液中可能不含有 0.5% 甲酸，但已证明含有它可以提高整个安装样品的渗透性（Guerrero-Hernández 等人，2021）。
5.收集整个尾巴和脊柱碎片，如图1C所示；此步骤对于避免固定期间鳍组织折叠或起皱很重要。

图 1. 尾鳍样本采集可防止组织在固定过程中折叠。 A. 截肢前对全尺寸成年男性进行麻醉。 B. 尾鳍截肢和未来样本采集平面。 C.放置在冷室中的轨道摇床的固定步骤；右上角显示了样本的特写图片，其中在样本收集过程中包含了约 4 毫米的脊柱，以防止鳍在固定过程中折叠。

6.将样品转移到装有固定液的培养皿中，并在 4°C 下孵育过夜，或在轨道摇床中以 50 rpm 的转速在室温下孵育 2 小时。
7.用 20 mL PBS-Tween（参见配方 1）在轨道摇床中以 50 rpm 洗涤 3 次，每次 15 分钟。
8.上述所有步骤对于整体切片和冷冻切片都是常见的。对于冷冻切片，请跳至 F 部分；否则，继续进行整体安装准备。

B.透化和漂白（整体）

1.将样品转移到聚丙烯罐中。
2.将 10 mL PBS-Tween-NaN 3 （参见配方 4）在轨道摇床上以 50 rpm室温孵育 12 小时，以透化样品。
3.在室温下在 10 mL 25% MetOH （参见配方 7）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
4.在室温下，在 10 mL 50% MetOH （参见配方 8）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
5.在室温下，在 10 mL 75% MetOH （参见配方 9）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
6.在室温下在 10 mL 100% MetOH中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育过夜（> 12 小时）。
7.将样品转移至 60 mm 培养皿中。
8.于鹅颈白灯发出的白光下，在 10 mL 漂白溶液（参见配方 6）中室温孵育 12 小时，如图 2 所示。
注意：确保培养皿的盖子正确放置以避免蒸发，并且灯没有接触培养皿以避免加热样品和介质蒸发。

图 2.过氧化氢甲醇漂白。 A. 顶板漂白前和底板漂白后的脱水翅片。 B. 设置灯和装有漂白溶液的培养皿。 C. 翅片的放置可实现灯的最佳漂白效果。

9.每 12 小时用新鲜配制的漂白溶液重复上一步，直至达到所需的漂白效果；样品的色素越多，溶解所有色素所需的漂白迭代次数就越多。对于大多数样本，两步漂白就足够了（1 天），三步漂白就足以漂白颜色很深的样本（1.5 天）。
10.将样品转移到聚丙烯罐中。
11.在室温下在 10 mL 50% MetOH中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
12.在室温下在 10 mL 25% MetOH中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
13.在室温下，在轨道摇床中以 50 rpm 的速度用 10 mL 的 PBS-Tween-NaN 3清洗过夜（> 12 小时）。

C.染色（整个安装）

1.在室温下在 10 mL 封闭溶液（参见配方 10）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 24 小时。
2.在室温下，在轨道摇床中以 50 rpm 的速度用 20 mL 的 PBS-Tween 清洗两次，每次 15 分钟。
3.在室温下在 10 mL 一抗溶液（参见配方 11）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 24 小时。
4.在室温下，在轨道摇床中以 50 rpm 的速度用 20 mL 的 PBS-Tween 清洗四次，每次 15 分钟。
5.在室温下在 10 mL 二抗溶液（参见配方 12）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 24 小时。
6.在室温下，在轨道摇床中以 50 rpm 的速度用 20 mL 的 PBS-Tween 清洗四次，每次 15 分钟。
7.在室温下在 10 mL 核染料溶液（参见配方 14）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 24 小时。
8.重复上一步，直到达到所需的核染色效果。当处理较大的组织或在同一容器中对多个鳍进行染色时，这可能是必要的。根据我们的经验，两轮核染色足以以高信噪比对大组织进行完全染色。

D.清理（整体安装）

1.在室温下在 10 mL 25% MetOH中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
2.在室温下在 10 mL 50% MetOH中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 4 小时。
3.在室温下在轨道摇床中以 50 rpm 的速度在 10 mL 75% MetOH中孵育 4 小时。
4.在室温下在 10 mL 100% MetOH中在轨道摇床上以 50 rpm 孵育 4 小时。
5.° C 的冰箱中于 100% MetOH中保存较长时间（约 1 个月）。容器密封是关键，以避免样品在储存过程中蒸发和干燥。
6.在室温下在 10 mL DCM- MetOH溶液（参见配方 15）中在轨道摇床中以 50 rpm 孵育 3 小时。
7.在室温下在轨道摇床中以 50 rpm 的速度在 10 mL DCM 中孵育 15 分钟。
8.重复上一步至少一次，直到样品沉到罐子底部。
9.用 5 mL 的 DBE 填充 5 mL Eppendorf 管。
10.将样品转移到 Kimwipe 纸巾上以除去多余的 DCM，转移到装有 DBE 的 Eppendorf 管中，并在摇床中孵育 15 分钟。
11.丢弃 DBE 并填充新鲜的 DBE。将样品避光放置过夜。

E.安装（整体安装）

1.° C烘箱或水浴中加热至少30分钟；它应该看起来均匀并且比室温下更加液态。
2.在 50 mL 锥形管中，倒入 23 mL DER 332、7 mL DER 736 和 6 mL IPDA。小心地从塑料移液管中倒出所有体积，因为树脂可能会粘附在移液管壁上。
3.用手打圈使溶液均质，直至溶液澄清。您将向树脂中引入气泡，这是预期的（参见图 3A 和 3B）。
4.将锥形管在≥ 3,000 × g ，室温下 10 分钟。如果仍然存在气泡，您可以提高离心速度（参见图 3C）。
5.极其小心地避免产生气泡，使用 10 mL 移液器以非常缓慢的移液动作将 10 mL 树脂倒入聚丙烯罐中，仅一次。重复使用移液器可能会导致树脂中引入气泡。
6.将 Eppendorf 管中的所有内容物转移到 100 mm 培养皿中。透明后样品应该是透明的并且可能很难找到。如果将 Eppendorf 管的内容物倒入培养皿中时样品没有出来，请使用镊子小心地从管中提取样品（见图 3D）。
7.极其小心地避免产生气泡，使用镊子拾取样品，并将样品轻轻插入位于聚丙烯罐中的树脂中（参见图 3E）。
8.用镊子夹住样品，轻轻搅拌几圈，洗掉 DBE，特别小心不要产生气泡。
9.将样品转移到盖玻片底部培养皿中，并极其小心，不要产生气泡，将其放在盖玻片顶部。
10.根据您的成像需要定向样品，使用镊子将样品推到盖玻片底部，使其位于盖玻片附近。这对于避免将样品放置在距离物镜工作距离太远的位置尤为重要。
11.倒入足够的树脂以填充盖玻片，但保持部分样品从树脂层突出。这很重要，因为如果样品完全浸没在树脂中，它会随着时间的推移而漂浮并远离盖玻片（见图 3F）。
12.将盖玻片底部培养皿与样品在黑暗环境中在室温下孵育 12 小时，盖上盖子以防止任何灰尘颗粒附着在树脂上。
13.根据上述程序准备新树脂，并倒入足够的体积以将样品完全浸没在树脂中（参见图 3G）。
14.可选：将盖玻片放在树脂顶部，不要引入气泡；这对于透射光成像可能特别有意义。
15.在成像之前，在室温下的黑暗环境中用样品固化盖玻片底部培养皿至少三天（参见图 3H 和 3I）。

图 3. 将样品安装到盖玻片底部培养皿中可提供最佳成像条件。 A. 浇注树脂三种成分后的锥形管。 B.树脂混合后，有预期的气泡。 C. 离心后无气泡即可使用的树脂。 D. 通过将 Eppendorf 管的内容物倒入 100 mm 培养皿中来定位样品的方法（蓝色箭头）。 E. 浸入树脂中的样品（蓝色箭头）预先倒入 30 mL 聚丙烯罐中；此步骤会洗掉样品中多余的 DBE。 F 。样品置于盖玻片底皿中。 G. 样品位于盖玻片底皿底部后，将样品完全浸入倒入的树脂中 12 小时。 H 和 I。样品准备好在有或没有反射光的情况下进行成像以进行可视化。除了 H 和 I 之外，所有图像都是用智能手机拍摄的，因此它们之间的比例不具有可比性。

F.冷冻切片（冰冻切片）

1.去除多余的组织以利于包埋和切片方向。
2.在 15 mL Falcon 管中于 4 °C 下在溶解于 1 × PBS的 30% 蔗糖中浸泡过夜。
暂停点：您可以将其在 4 °C 的 30% 蔗糖中放置最多一周。
3.使用 OCT 将样品从 30% 蔗糖转移到合适的组织模具中，并在 OCT 中平衡样品 30 分钟（图4A ）。

图 4.尾鳍样品采集和冷冻切片制备。 A. 将样品放置并定向到 OCT 包埋模具中，并且 OCT 冷冻后的模具。 B. SlideTray载玻片染色系统，在其中执行后续步骤。

4.将样品转移到具有新鲜 OCT 的新组织模具中，并使用细刷或探针根据解剖显微镜下的切片平面放置样品。
5.将含有组织模具的 OCT 放在干冰或其他冷冻介质（例如液氮（-40 °C至 -70 °C ））上以冷冻样品。 OCT 在室温下是粘稠的，但在 -10 °C 以下会冻结成固体支持物。
注意：不建议使用液氮，因为它可能会导致组织或块破裂。
6.在大约 -18 °C 的低温恒温器中切割 10–12 μm厚的切片。如有必要，根据所研究的组织调整低温恒温器室的温度±3°C。
注意：获得高质量冷冻切片的最佳温度可能因组织而异。建议使用骆驼毛刷将新出现的部分引导到刀片上或压平弯曲的部分。
7.在切割组织切片后 30 秒内，通过将载玻片接触组织，将具有可接受形态的切片转移到室温显微镜载玻片上。由于温差，组织切片会立即融化到载玻片上。
注意：这必须在切割后 30 秒内完成，以避免冷冻干燥和组织不必要的形态变化。聚 L-赖氨酸涂层或硅烷化载玻片可提高切片的粘附性（作为参考，请观看https://youtu.be/tA7S75MFdNk?si=7oq-uMaaxVEi1i_e&t=580上的 9:40–9:45 剪辑）。
8.快速评估组织保存/方向并在解剖显微镜下检查您的载玻片。根据需要或样品的大小，在每张幻灯片上收集足够的切片。在大多数情况下，一张幻灯片上可以容纳 10-12 个切片。
9.让切片在室温下在载玻片上风干 2 小时，以最大限度地提高收集的切片对载玻片的粘附力。
10.风干的载玻片可以立即处理，也可以放入盒子中并在 -20 °C 下保存长达一个月。切片完成后，您可以用一层 OCT 覆盖剩余的未使用的组织块，以防止冻干。

G.染色和封片（冷冻切片）

1.使用SlideTray载玻片染色系统在载玻片上执行以下步骤，如图 4B 所示。
2.Super PAP 笔圈出组织，以避免液体泄漏到感兴趣区域之外。
3.PBS-Tween清洗两次（参见配方 1）室温放置 10 分钟。载玻片可能来自冰箱或刚刚风干后。
4.块数为 500 每张玻片加入μL PBS-Tween，含 10% FBS 和 5% DMSO，室温下 1 小时。
5.室温下用PBS-Tween清洗一次10 分钟。
6.在室温下与 200 µL TrueBlack溶液一起孵育 1 分钟。
7.PBS（不含 Tween）在室温下清洗两次10 分钟。
8.上使用 500 μL的一抗（H3P，1:400；Ecad，1:200）PBS-Tween 进行免疫标记 10% FBS 和 5% DMSO 溶液室温孵育 1 小时。
9.室温下用PBS-Tween清洗两次，每次 10 分钟。
10.加入 500 μL二抗（兔-AF647，1:400；小鼠-AF555，1:500），在室温下产生荧光信号1小时。
11.PBS-Tween室温清洗 3 次，每次 10 分钟。
12.每张玻片使用500 μL的核染料溶液（参见配方 14）将细胞核在室温下染色 1 小时。或者，您可以使用 DAPI 溶液（参见配方 16）在室温下放置 15 分钟。
13.PBS-Tween室温清洗 3 次，每次 10 分钟。
14.倒入一滴ProLong Gold 抗褪色封固剂。
15.安装盖玻片并让载玻片避光固化过夜。

H.成像（整体切片和冷冻切片）

1.将样品放在载物台上，并根据与二抗结合的荧光团进行成像。
2.对于整个安装样品的体积成像，在尼康转盘共焦显微镜上使用 10 ×空气物镜，并为整个样品（80 至 120 个切片）每 5 μm 收集一个切片，确保荧光信号不会使相机的检测范围饱和（见图 5）。

图 5. 整体安装矢状视图最大投影。顶部图像显示 H3P-AF647 染色的有丝分裂细胞；中间图像显示 Ecad-AF555 染色的表皮；底部图像显示 YOYO-1 核染色。左栏：来自稳态未切割尾鳍的代表性图像；中栏：截肢后 1 天的再生样本：右栏：截肢后 2 天的尾鳍再生。 400 μm厚的共焦堆栈是在转盘共焦显微镜上使用 10 ×空气物镜获得的。

3.对于冷冻切片，在点激光扫描共焦显微镜上使用 40 × 浸入式物镜，并为整个切片每 1 μm 收集一个切片（ 10个切片，见图 6）。

图 6. 冠状面冷冻切片的最大投影。顶部图像显示用 Phospho-Histone H3 (H3P)-AF647 染色的有丝分裂细胞；中间图像显示 Ecad-AF555 染色的表皮；底部图像显示 YOYO-1 核染色。左栏对应于截肢后 1 天的再生样本；右栏显示截肢后 2 天尾鳍的再生情况。 25 μm厚的共焦堆栈是在激光扫描共焦显微镜上使用 40 ×水物镜获得的。

数据分析

A.数据预处理

1.位于插件/缝合/网格/集合缝合选项卡下的斐济 ( https://imagej.net/software/fiji/ )的网格/集合缝合工具将堆栈缝合在一起。

B.数据分析

由于标记稀疏，H3P 染色的数据分析通常通过手动注释来完成。然而，在整体样品和大体积成像中，这项任务变得极其耗时。为了解决这个问题，可以使用 Fiji 宏按颗粒面积和荧光强度进行阈值化，以量化大量组织。下面，我们描述了我们的定量流程，该流程可以充分区分 H3P 染色的细胞核和来自二抗聚集体的大荧光碎片。请参阅补充信息（代码文件夹），了解用于数据分析的现成管道。

1.对于每个 Z 平面，执行以下步骤（宏 01-Make_pH3_csv.ijm，参见图 7A）：
a.复制图像。
b.使用中值滤镜（5 像素半径）模糊图像。
c.通过 50 像素滚动减去背景。
d.使用高斯模糊滤镜（4 像素西格玛）模糊图像。
e.找到突出度为 10 的 Maxima 并输出点选择。
f.测量并记录每个最大值的 X 和 Y 位置。
g.将坐标保存在 csv 文件中。
h.关闭模糊图像并返回到原始图像。
i.对于每个最大值，执行以下步骤（宏 02-H3P_Intensity_csv.ijm，参见图 7B）：
我。围绕 40 像素 x 40 像素的点坐标绘制一个正方形。
二.复制此图像。
三.可选：保存图像以供将来参考。
四.使用中值滤镜（3 像素半径）模糊图像。
v. 使用高斯模糊滤镜模糊图像，半径为 3 像素。
六.复制模糊图像。
七.使用“Otsu”算法设置自动阈值。
八.转换为蒙版。
九.运行分水岭。
X。分析大小为 10-400 像素（不包括边缘）的粒子并添加到 ROI 管理器。
xi.如果没有任何粒子，则丢弃该坐标。
十二.否则，选择原始荧光图像并使用 ROI 管理器中的粒子进行测量。在大多数情况下，它是一个粒子，但裁剪后的图像中可能有多个粒子。

图 7. 数据分析工作流程。 A、左侧最大投影；中间有一个 Z 切片；和最大值覆盖在右侧。 B. H3P 阳性核的三个示例，左侧显示原始图像，中间显示掩蔽信号，右侧显示两个图像的合并。
j.使用相应的 X、Y 和 Z 坐标保存每个分析粒子的面积和强度测量值。
2.每个样本应该有一张表，其中包含与 X、Y、Z、面积和强度值相对应的所有粒子。
3.按 Z 步分割表并迭代整个堆栈，丢弃 X 和 Y 上彼此相距 5 个像素以内且强度值低于相邻 Z 平面中的粒子的任何粒子。这有助于过滤表以仅保留每个粒子的最亮测量值（脚本 03-ReduceZ.R）。
4.将过滤后的表格导入 FCS Express（De Novo Software， https://denovosoftware.com/ ），根据面积和强度绘制阳性事件的门。量化噪声并清楚地区分噪声粒子和真实信号非常重要。

图 8 显示了整体安装再生翅片中自动 H3P 定量的结果。我们在颗粒区域和荧光强度门内观察到 12.7% 的阳性事件。当在步骤 B1e 上检测到最大值时，该值将根据突出值而变化。为了验证图像量化，我们检查了绘图不同区域的代表性图像。显示核形态的图像包含在门内，显示小碎片的图像被排除在分析之外。高事件数是揭示核形态粒子（右上门控事件）和碎片之间清晰分离的关键。

图 8. 磷酸组蛋白 H3 (H3P) 门控策略。颗粒定量后，绘制门以包括具有高荧光强度的核大小的颗粒。在此示例中，所有粒子的 12.7% 在此门内，其余粒子被视为背景噪声。显示相应分布的代表性图像以进行验证。

一般注意事项和故障排除

1.由于组织之间的细胞质量差异，即使使用完全相同的试剂浓度和体积，染色强度也可能存在显着差异。如果您在平行的大型和小型组织中进行染色，试剂渗透组织时的局部浓度将引入技术变异性，从而导致真正的阳性信号之间的荧光强度存在显着差异。图 5 中的 YOYO-1 染色示例很明显，其中与其余样品相比，未切割的样品明显染色不足。
2.在步骤B1b、B1c、B1d和B3中，可能需要根据图像分辨率来调整模糊像素大小。为了进行数据分析，我们使用 1.5577 pix/ μ m的图像。

致谢

我们感谢霍华德休斯医学研究所和斯托尔斯医学研究所提供资金支持这项工作。我们还要感谢 C. Guerrero 在其出版之前与我们分享固定方案； J.昂鲁，B.斯劳特， C. Wood、R. Alexander、S. McKinney 和 L. Maddera关于图像采集和图像量化的建议； J. Jenkin、C. Guerrero 和 D. Zamora 在动物护理方面提供帮助；以及 Y. Wang、L. Holmes、J. Blanck、J. Haug 和 A. Box，对染色优化、试剂滴定和细胞计数分析进行了广泛讨论；桑切斯·阿尔瓦拉多实验室的所有成员进行了富有洞察力的科学讨论。该协议是以下协议中使用的协议的更新和详细版本：Science (2020)，DOI：10.1126/science.aaz3090。

利益争夺

不存在利益冲突或利益竞争。

道德考虑

所有非洲鳉鱼工作均按照 SIMR 机构动物护理和使用委员会批准的协议（协议 ID 2022-137）进行。

参考

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补充资料

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