材料与试剂

生物材料

1.CD1 小鼠（6 – 12 周）（Charles River，目录号：022）

试剂

1.不含 Ca 2+ /Mg 2+的Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14175095）
2.1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080）
3.青霉素-链霉素（P/S），10,000 U/mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
4.木瓜蛋白酶（缓冲水悬浮液，≥16单位/毫克蛋白质）（Millipore Sigma，目录号：P3125）
5.来自溶组织梭菌的胶原酶（Millipore Sigma，目录号：C6885）
6.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），低葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：11885084）
7.胎牛血清（FBS），热灭活（Fisher Scientific，目录号：MT35011CV）
8.两性霉素 B（Thermo Fisher Scientific，目录号：15290026）

解决方案

注意：在层流细胞培养罩中准备所有溶液。
1.H BSS 解离溶液（参见配方）
2.木瓜蛋白酶溶液（参见食谱）
3.胶原酶原液（参见食谱）
4.胶原酶溶液（参见食谱）
5.DMEM 培养基（参见食谱）

食谱

1.HBSS 解离溶液（4°C 保存长达六个月）
试剂最终浓度数量
HBSS不适用490 毫升
HEPES1%（体积比）5毫升
压力/压力1%（体积比）5毫升
全部的不适用500毫升

2.木瓜蛋白酶溶液（新鲜配制和使用）
试剂最终浓度数量
木瓜蛋白酶总计 40 单位108μL _ _
HBSS解离液不适用3毫升
全部的不适用3.108毫升

3.胶原酶原液（200 μL等分，-20 °C 保存长达六个月）
试剂最终浓度数量
胶原酶22.5毫克/毫升100毫克
HEPES1%（体积比）44微升_
HBSS不适用4.4毫升
全部的不适用4.444 毫升

4.胶原酶溶液（新鲜配制和使用）
试剂最终浓度数量
胶原酶原液1.5毫克/毫升200μL _ _
HBSS解离液不适用2.8毫升
全部的不适用3.0毫升

5.DMEM培养基（4°C 保存长达六个月）
试剂最终浓度数量
胎牛血清10%（体积/体积）50毫升
压力/压力1%（体积比）5毫升
两性霉素B1%（体积比）5毫升
DMEM，低糖不适用440毫升
全部的不适用500毫升

实验室用品

1.异氟烷（Henry Schein，目录号：1182097）
2.装有 70% 乙醇的喷雾瓶（Fisher Scientific，目录号：BP82031GAL）
3.组织培养皿（35 × 10 mm）（Fisher Scientific，目录号：08-772A）
4.微管，1.7 mL（Fisher Scientific，目录号： 14-222-168）
5.离心管，50 mL（Fisher Scientific，目录号：06-443-18）
6.细胞过滤器 40 μ m（Fisher Scientific，目录号：22-363-547）
7.细胞过滤器 10 μ m（PluriSelect，目录号：43-50010-03）
8.细胞培养 12 孔微孔板（Fisher Scientific，目录号：07-000-202）
9.盖玻片（Fisher Scientific，目录号： 22-050-232)

设备

1.体视显微镜系统（Olympus，目录号：SZ51）
2.生物安全柜（Fisher Scientific，目录号：NC0986267）
3.等温水浴（Fisher Scientific，目录号：FSGPD2S）
4.水套CO 2培养箱（Fisher Scientific，目录号：13-998-078）
5.Sorvall Legend Micro 21R 微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002445）
6.离心机 5702（Eppendorf，目录号：022628102）
7.标准剪刀（精细科学工具，目录号：14002-12）
8.镊子（World Precision Instruments，目录号：501987）
9.学生弹簧剪刀（精细科学工具，目录号：91500-09）
10.Dumont #5 镊子（精细科学工具，目录号：11251-20）
11.Gilson（或同等产品）移液器和吸头（P20/P200/P1000）（Fisher Scientific，目录号：各种）

程序

A.前期准备

1.在开始任何手术之前，用 70% 乙醇对所有手术工具和工作区域进行消毒。
2.接下来，准备一个培养皿，填充 4 mL 的 HBSS 解离溶液（参见食谱），用于 DRG 组织的初始收集和清洁。准备两个微管，每个微管含有 1 mL 的 HBSS 解离溶液，将清洁的组织转移到其中。将培养皿和微管置于 4 °C的冰上。
3.此时也可以制备木瓜蛋白酶和胶原酶溶液（参见配方）并保存在 4 °C下。使用前将这些溶液和 DMEM 培养基（参见配方）加热至 37°C。
4.将动物放入罐子/室中进行麻醉，最终麻醉小鼠。将含有 1 mL 异氟烷的纱布添加到罐子中，小鼠将在一分钟内麻醉。为了确保完全麻醉，检查是否对捏后脚垫没有反应。
5.接下来，用剪刀将小鼠斩首在水槽中，以达到安乐死和去除血液的目的。这将有助于组织解剖过程。

B.组织解剖

1.将鼠标移至设计的组织解剖区域，并用 70% 乙醇自由喷洒背部毛皮。
2.为了暴露背部肌肉，使用标准剪刀在背部皮肤中间做一个大的横向切口。然后，向相反方向拉动皮肤以去除所有背部皮肤。
3.要去除背部肌肉，请在靠近脊柱左右两侧的位置切两个长切口。然后，用镊子从嘴端开始拉开肌肉。
4.为了暴露脊髓和背根神经节，通过切除椎管顶部来进行椎板切除术。使用弹簧剪以45 °角剪断椎管两侧的骨头，以免损坏或丢失DRG。继续从一侧到另一侧切割，同时抬起椎管顶部，从喙端开始，一直向下到脊柱尾端。
5.接下来，使用镊子慢慢地从柱头到尾方向取出脊髓，并暴露 DRG。丢弃脊髓。 DRG 位于椎管的背外侧位置，可以通过其圆形和透明外观来识别，这与附着的神经纤维的白色不同（补充图 1）。
6.使用立体显微镜，用#5镊子抓住背根，小心地将其拉动几毫米，并用弹簧剪刀剪断脊神经（紧邻神经节的远端）。接下来，切割背根并将收集的 DRG 放入冰上的培养皿中。通常，经验丰富的实验者可以收集每只小鼠大约 40 个神经节。
7.如果需要，将培养皿移到立体显微镜下，并使用一把弹簧剪刀和 #5 钳子从 DRG 中去除任何额外的神经、根和结缔组织。然后，将清洁的 DRG 均匀转移到两个微管中。

C.细胞解离

1.将含有清洁 DRG 的微管以 200 × g离心 1 分钟，并除去 HBSS 解离溶液。
2.将 1.5 mL 木瓜蛋白酶溶液添加到微管中，进行第一次酶解。轻轻轻弹微管以重新悬浮 DRG，并在 37°C 水浴中孵育 20 分钟。
注意：请勿用移液器重悬或剧烈摇晃以保持细胞的完整性。
3.将微管以 200 × g离心 1 分钟，除去木瓜蛋白酶溶液。
4.用 1 mL HBSS 解离溶液清洗 DRG，离心（200 × g ，1 分钟），然后除去溶液。
5.通过将 1.5 mL 胶原酶溶液添加到微管中来执行第二次酶解。轻轻轻弹微管以重新悬浮 DRG，并在 37°C 静止水浴中孵育 20 分钟。
注意：请勿用移液器重悬或剧烈摇晃以保持细胞的完整性。
6.将微管以 200 × g离心 1 分钟，除去所有胶原酶溶液。
注意：从此时开始，包含任何组织、细胞、培养基或试剂的管/板的打开应在层流细胞培养罩中进行。
7.将 DRG 重新悬浮在 1 mL 的 DMEM 培养基中。 200 × g离心1 分钟，小心去除所有培养液，不要干扰组织。
8.将 DRG 重新悬浮在 0.5 mL 的 DMEM 培养基中。使用 P1000 移液器研磨进行机械解离，直至溶液变得混浊（上下约 15 – 20 次）。在研磨过程中，组织最初通过尖端时应有少许摩擦，然后逐渐轻松通过。这一步动作要轻柔，避免引入气泡；这很关键。
9.将 1 mL 的 DMEM 培养基添加到每个微管中。接下来，将所有微管的内容物转移到一根 50 mL 锥形管中。用 DMEM 培养基将体积调整至约 5 mL，并通过轻弹管轻轻混合内容物。
10.μm细胞滤网过滤混合物，然后使用 10 μm细胞滤网过滤。每次将滤液收集于 50 mL 管中。如有必要，用 DMEM 培养基将滤液体积调整至 5 mL，并通过轻轻弹管重悬细胞。

D.细胞铺板和生长

1.将 400 μL 滤液移入装有灭菌盖玻片的每个孔中，将重悬的细胞转移至 12 孔微孔板中。然后，将板放入 CO 2细胞培养箱（37°C，5% CO 2 ）中孵育。
注意：在此孵育期间（24 小时），由于缺乏盖玻片涂层和使用 DMEM 低葡萄糖培养基，SGC 细胞将附着在培养皿底部，而 DRG 神经元和碎片将保持悬浮状态。
2.铺板细胞一天后，用 400 μL 新鲜 DMEM 培养基更换 DMEM 培养基，以去除细胞碎片。使用前务必将培养基预热至 37°C。
3.– 14 天内，SGC 增殖并形成纺锤形形态（图 1）。为了维持 SGC 培养，每2-3天更换一次 DMEM 培养基。

协议验证

在我们的研究文章中，我们使用该方案来研究基质金属蛋白酶在 SGC 和疼痛中的作用（Tonello 等人，2023）。在这里，我们通过使用分子和功能方法评估这些培养物提供了额外的证据，表明该协议既稳健又可重复。

SGC培养物平均细胞纯度超过90%

我们按照我们的出版物（Tonello 等人，2023）中描述的方法，使用免疫荧光评估了细胞培养物的纯度。简而言之，10-14天后，我们用4%多聚甲醛溶液替换DMEM培养基，并在室温（RT）下孵育15分钟。接下来，我们用 PBS 冲洗培养物，并用 1% BSA 和 0.2% Triton X-100 的 PBS（BSA 溶液）溶液封闭它们。然后，我们将它们在含有抗谷氨酰胺合成酶一抗（GS，兔，1:5,000）的 BSA 溶液中于 4°C 孵育过夜。然后，我们将培养物与缀合有 Alexa Fluor 546 (1:1,000) 的抗兔二抗在 BSA 溶液中室温孵育 1 小时。最后，我们用 PBS 中的通用核染色 DAPI 在 RT 下处理它们 1 分钟。然后，我们从微孔板上取下盖玻片，并用 Prolong Gold Antifade Mountant 覆盖培养的 SGC 侧面，将它们安装在玻璃显微镜载玻片上。使用 Keyence BZ-X800 显微镜获取图像，并使用 NIH Image J 开源软件（Schindelin 等人，2012）手动计数细胞。细胞纯度以百分比形式评估，通过将 GS+ 细胞（即 SGC）数量除以 DAPI+ 细胞（即培养物中的所有细胞）数量来计算（图 1A）。我们的方案产生的 SGC 培养物的平均细胞纯度为 91.4% ± 1.1%（图 1B）。大约 9% 仅 DAPI 呈阳性的细胞被认为是潜在污染物。成纤维细胞的特征是具有大细胞核的扁平细胞，被确定为潜在的主要污染物（图 1A）。值得注意的是，据报道，SGC 培养物中 GS 的表达量降低（Belzer 等，2010）。也可以使用 SGC 的其他标志物，例如脂肪酸结合蛋白 7（Avraham 等人，2020）。

图 1. 卫星胶质细胞 (SGC) 培养物的细胞纯度。 A. 10-14 天后 SGC 培养物中 GS 蛋白和 DAPI 的免疫荧光代表性图像。箭头表示大核细胞（例如成纤维细胞）。 B. GS+ 细胞（即，SGC）相对于 DAPI + 细胞（即，所有细胞）的百分比。图表是使用 GraphPad Prism（v. 10.0.2）生成的。平均值 ± SEM，n = 4 个独立的 SGC 培养物。

培养物显示 SGC 转录标记的高表达

我们按照我们的出版物 (Tonello et al., 2023) 中描述的方法，使用 qPCR 评估了各种细胞标记物的转录表达水平。简而言之，10-14天后，我们用TRIzol试剂代替DMEM培养基来裂解SGC并分离RNA。我们使用 Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒从 TRIzol 试剂中提取总 RNA，然后使用紫外-可见分光光度计评估其数量和质量。然后，我们使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒将 RNA 转化为 cDNA。各种细胞标记物和Gapdh （用于归一化）的特异性引物均从 PrimerBank 获得（Wang 等，2012）。引物序列可在补充表 1 中找到。qPCR 是在 QuantStudio 3 实时 PCR 系统上使用 PowerUp SYBR Green Master Mix 进行的。使用Pfaffl方法计算相对转录表达比率(Pfaffl，2001) 。图 2 显示，我们的方案导致培养物高表达 SGC 基因标记，如Glul 、 Gja1和Ednrb （Feldman-Goriachnik 和 Hanani，2017 年；Hanani 和 Spray，2020），同时显示非 SGC 基因标记的低表达。有髓鞘 ( Scn7a ) 和有髓鞘雪旺细胞 ( Mpz和Ncmap )、巨噬细胞 ( Aif1 、 Itgam和Cx3xr1 )、神经元 ( Nefh和Prph ) 和成纤维细胞 ( Fgf13和Fgf9 ) (Avraham 等人，2020；Jager 等人，2020) ，2020；Tonello 等人，2020；Chu 等人，2023；Tonello 等人，2023）。

图 2. 卫星胶质细胞 (SCG) 培养物的转录分析。使用 qPCR 对各种细胞标记物进行定量显示，SGC 标记物的表达高于雪旺细胞 (Schw.)、巨噬细胞 (Macro.)、神经元和成纤维细胞 (Fibro.) 标记物。该图是使用 GraphPad Prism（v. 10.0.2）生成的。平均值 ± SEM， n = 6 个独立的 SGC 培养物。

培养物对 EDNRB 激动剂表现出功能性反应

我们按照我们出版物中概述的方法，使用钙成像评估了 SGC 培养物的功能完整性（Lee 等人，2020 年；Ford 等人，2021 年）。简而言之，10-14天后，我们更换DMEM培养基，并用Fura2-AM（3 μg/mL）在含有10% FBS和1% P/的DMEM溶液中在室温下孵育SGC培养物45分钟。 S。然后，我们从细胞培养微孔板中取出盖玻片，并将它们转移到含有以下浓度的外部记录溶液的记录室中：130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl 2 、1 mM MgCl 2 、30 mM 葡萄糖，和 10 mM HEPES。使用 Olympus BX51 显微镜上的 MetaFluor 软件（Molecular Devices）控制的 365/385 nm 开关 LED 获取照度信号。先前的研究表明，内皮素-1 通过激活内皮素受体 EDNRB 有效增加 SGC 中的细胞内钙水平（Feldman-Goriachnik 和 Hanani，2017）。在这里，我们发现 IRL 1620 (10 nM) 是一种有效且选择性的 EDNRB 激动剂（Takai 等人，1992），可诱导大多数（如果不是全部）SGC 的细胞内钙增加（图 3A 和 B）。该实验作为我们 SGC 培养物功能完整性的概念证明。这些培养物可用于未来的研究，以评估和测量钙对各种激动剂的反应，包括神经递质或细胞因子（Souza 等人，2013 年；Afroz 等人，2019 年）。

图 3. 卫星胶质细胞 (SGC) 培养物中的钙反应。 (A) SGC 培养物中的 Fura-2 信号传导图像和 (B) SGC 响应 EDNRB 激动剂 IRL 1620 (10 nM) 的代表性钙成像痕迹（箭头）。颜色对应于 A 中圈出的感兴趣区域。

一般注意事项和故障排除

SGC 已被确定为治疗慢性疼痛的潜在治疗靶点。然而，由于缺乏体外研究这些细胞的技术，我们对 SGC 生物学的了解有限。在这里，我们提供了成年小鼠 SGC 的解离和培养的分步方案：

1.该协议易于实施，一个人通过一些练习大约需要 2 小时才能完成整个解剖和电镀过程。通常，8-12 周龄的 CD1 小鼠用于此方案。然而，该方案在不同年龄和遗传背景的小鼠中都取得了成功。
2.DRG 组织的解剖类似于先前发布的用于产生感觉神经元的协议（Malin 等人，2007）。然而，我们特别小心地去除任何附着的脊神经和背根，以尽量减少雪旺细胞的潜在污染（补充图1）。
3.为了最大限度地提高培养细胞的存活率和数量，我们建议解剖时间不超过 30-45 分钟。组织在冰上放置的时间不得超过 1 小时。
4.SGC 培养物不需要在盖玻片上生长。解离的细胞可以直接接种到 12 孔微孔板中，例如用于 qPCR 分析。
5.培养的SGC 需要培养 10 – 14 天才能达到 60%–80% 的汇合度并获得纺锤形、双极形态。较长的孵育时间有被成纤维细胞污染的风险。

总之，该方案产生的培养物纯度超过 90%，适合分子和功能测试。这些培养物可用于更好地了解 SGC 的生物学特性并开发缓解慢性疼痛的新疗法。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 的支持，通过对 TB 的 NS113243 拨款和对 SD 的 NS130138 拨款，辛辛那提大学加德纳神经科学研究所试点奖也提供了部分支持。该方案首次在我们的原始出版物（Tonello 等人，2023）中进行描述和验证，该出版物研究了卫星胶质细胞中的金属蛋白酶信号传导及其与疼痛的关系。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

动物的使用符合 NIH 指南，并得到辛辛那提大学机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

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补充资料

可下载支持信息这里。
1.补充图1
2.补充表1