材料与试剂

生物材料

从研究参与者新鲜获得的人血清或血浆样本，在 56 °C 下加热灭活 30 分钟，并在 18–25 °C 下以 1,000× g离心10 分钟。离心后预计会得到大约 1.8 mL 的血清/血浆，每管中底部有沉淀，顶部有上清液。应收集上清液并等分到不同的管中，储存在-80°C。一旦取出并解冻等份，应将其保存在 2-8°C 的冰箱中，并在一周内使用。

试剂

1.重组 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白（R&D Systems，目录号：10474-CV-01M）
2.重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白（R&D Systems，目录号：10549-CV-01M）
3.重组 SARS-CoV-2 Spike S2 亚基蛋白（R&D Systems，目录号：10594-CV-100）
4.SARS-CoV-2 RBD (S1) S 蛋白从HEK 293T/17 细胞中的pHL -sec 表达载体获得[从美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 获得，目录号：CRL-11268]。 pHL -sec 表达载体是伦敦国王学院 Doores 实验室的善意捐赠
5.山羊抗人 Kappa-UNLB 抗体（Southern Biotech，目录号：2060-01）
6.山羊抗人 Lambda-UNLB 抗体（Southern Biotech，目录号：2070-01）
7.纯化的人 IgG（Sigma，目录号：I2511）
8.纯化的人 IgA（Sigma，目录号：I2636）
9.纯化的人 IgM（Sigma，目录号：I8260）
10.山羊抗人 IgG-HRP（Sigma，目录号：A0170 或 AP113P）
11.抗人 IgM-HRP（Sigma，目录号：A6907）
12.抗人 IgA-HRP （Sigma，目录号：A0295）
13.山羊抗人 Fc IgG-生物素缀合物（Southern Biotech，目录号：2048-08）
14.山羊抗人 IgA-生物素（Southern Biotech，目录号：2050-08）
15.山羊抗人 IgM-生物素（Southern Biotech，目录号：2020-08）
16.PBS/吐温袋（PBST）（Sigma，目录号：P3563）
17.Tween-20（Sigma，目录号：P2287）
18.1×杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS），CaCl 2 (-) MgCl 2 (-)（Sigma，目录号：D8537）
19.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A3803）
20.山羊血清（Sigma，目录号：G9023）
21.链霉亲和素-HRP（R&D Systems，目录号：DY988）
22.四甲基联苯胺（TMB）底物（ SeraCare ，目录号：5120-0080 或 52-00-02）
23.TMB 终止溶液（ SeraCare ，目录号，5150-0021 或 50-85-06）
24.酪蛋白封闭缓冲液（ Thermo Scientific，目录号：37582）
25.Poly-HRP-40（Fitzgerald，目录号：65R-S104PHRP）

解决方案

1.PBST 洗涤缓冲液（参见配方）
2.BSA 测定缓冲液/样品稀释液/封闭缓冲液（参见配方）
3.山羊血清测定缓冲液/样品稀释液（参见配方）

食谱

1.洗涤缓冲液
试剂最终浓度(%)数量或体积
1 × DPBS pH 7.499.95%999.5毫升
吐温-200.05%0.5毫升
全部的100%1,000 毫升
装在有盖的瓶子中，在室温下最多可保存 7 天。

2.BSA 测定缓冲液/样品稀释液/封闭缓冲液
试剂最终浓度(%)数量或体积
1 × DPBS pH 7.499.95%499.75 毫升
吐温-200.05%0.25毫升
牛血清白蛋白1%5克
全部的100%500毫升
通过 0.22 µm 过滤器单元过滤缓冲区。在 2–8 °C下保存最多 7 天。

3.山羊血清测定缓冲液/样品稀释液
试剂最终浓度(%)数量或体积
1 × DPBS pH 7.494%470 毫升
吐温-201%5毫升
山羊血清5%25毫升
全部的100%500毫升
通过 0.22 µm 过滤器单元过滤缓冲区。在 2–8 °C下保存最多 7 天。

实验室用品

1.U 形底，96 孔稀释板（Corning，目录号：3690）
2.中等结合平孔 ELISA 板（Greiner Bio-One，目录号：655001）
3.密封胶带（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15036）
4.储层（CoStar，目录号：4870）
5.移液器（P2、P5、P20、P100、P200、P300-多通道、P1000）（由实验室自行决定）
6.移液器吸头（10、20 和 200 µL）（由实验室决定）
7.50 mL 离心管（Sigma，目录号：T1943）
8.纸巾卷（由实验室决定）
9.2 mL 冷冻管（Sigma，目录号：BR114832-1000EA）
10.0.22 µm 注射器过滤器（TISCH Scientific，目录号：SPEC16251）

设备

1.-20 °C 或 -80 °C 冷冻柜（由实验室决定）
2.台式离心机（由实验室自行决定）
3.洗板机（ BioTek洗板机，ELx405 UCWVSD）
4.读板器（ BioTek读板器，Elx808IU）

软件和数据集

1.读板机软件：Gen5 TM微孔板数据采集和分析软件（v3.12，11/23/2021）；通过BioTek购买或随阅读器提供的许可证 CD
2.电子表格软件：Microsoft Office Excel v16.0，2016 或更高版本 (09/22/2015)；需要 Microsoft Office 许可证。
3.数据分析软件：GraphPad Prism v9.3（GraphPad，2021年11月15日）；通过GraphPad获得的许可证
4.软件编程语言； R 版本 4.3.1 (21/04/2023)；免费使用

程序

传统的 ELISA 可有效检测和定量大量抗原暴露后（例如自然感染后）血浆或血清中的抗体。传统 ELISA 适用于预期目标分子以相对较高浓度存在的情况。另一方面，灵敏的 ELISA 在免疫反应或疾病的早期检测中被证明是有利的，特别是当特异性抗体或抗原的水平极低时。当在临床试验中观察到低抗体水平时，采用 ELISA 测定的敏感版本，其中添加了生物素-链霉亲和素检测步骤，该步骤对于放大和检测传统 ELISA 可能无法识别的抗原的背景反应特别有用。应从血清分离管 (SST) 中收集的血液中获取血清，并从酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 管中收集的血液中获取血浆，以确保获得不含污染物的高质量样品。

A.血清或血浆样品和试剂的制备

1.血清或血浆样品应在 56 °C 下热灭活 30 分钟，并在 18–25 °C 下以 1,000× g离心10 分钟，以在测试前收集上清液。如果不能立即处理血清或血浆样品，应将其等分并保存在-80°C，以确保抗体的结构完整性和长期稳定性。
关键：血清/血浆经过热灭活，以确保操作人员的安全，因为该测定是在工作台上进行的，而不是在生物安全柜下进行的。这会杀死血清/血浆中存在的任何潜在病原体。
2.除非另有说明，常规 ELISA 的所有程序均在室温 (20–25 °C) 下进行，敏感 ELISA 的所有程序均在 37 °C 下进行，如下所述。
3.应绘制板计划以记录每个 ELISA 板中样品、对照和标准品的位置。图 1 展示了一个示例。
4.按照配方 1 中的说明制备洗涤缓冲液，或将一袋 PBS/TWEEN 溶解在 1 L 蒸馏水中。
5.分别按照配方 2 和 3 中所述，为常规 ELISA 准备 BSA 测定缓冲液或为敏感 ELISA 准备山羊血清测定缓冲液。
6.所有制备和分装的试剂，即所有标准品和检测抗体，应保存在-20°C冰箱中。一旦采摘并解冻等份，应将其保存在冰箱中并在一周内使用。应清楚地标明首次打开/准备的日期。
7.使用新且仍在指定有效期内的试剂至关重要。

B.中等结合 ELISA 板的涂层

注意：不一致的移液可能会影响样品稀释、气泡形成或方案偏差等过程的准确性。确保检测过程中采用正确的移液技术，例如控制上下移液以尽量减少气泡。请参阅故障排除部分下的问题 2。

1.在 96 孔介质结合 ELISA 板的 A1–H2 孔（参见图 1）中，每孔添加 50 µL 含有用 DPBS 稀释的抗人 kappa 和抗人 lambda 捕获抗体的溶液（最终稀释度） 1:500，抗人 kappa 和抗人 lambda 捕获抗体的比例为 1:1，如表 1 所示。包被孔将含有用于标准曲线的纯化抗体。
2.孔培养基结合 ELISA 板的其余孔添加 50 µL 抗原 [重组 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白、重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白、重组 SARS-CoV-2 刺突 S2 亚基蛋白或 SARS-CoV-2 RBD (S1) S 蛋白]在 DPBS 中预稀释至 3 µg/mL 的工作浓度，每种蛋白质都有一个单独的板。抗原的预稀释参数取决于储备溶液的浓度，该浓度可能因批次而异。表 2 中所示的稀释度使用 500 µg/mL 作为储备浓度。
注意：中等结合板更具成本效益，适合非特异性结合可能干扰测定的本方案。它们通常更容易清洗并且不太可能保留残留蛋白质。虽然高结合板具有很强的结合力，但由于其较高的结合能力，彻底清洗可能更具挑战性。
3.用密封胶带盖住板，并在加湿培养箱中于 37°C 孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜。
注意：在2 小时孵育时间内，继续进行 C 部分。
注意：孵育期间不要摇动板，因为摇动会中断包被抗原/抗体与板表面之间键的形成。
4.孵育后，使用洗板机用每孔 200 µL 的洗涤缓冲液清洗 ELISA 板五轮，将板轻拂容器以除去多余的缓冲液，然后轻轻拍打纸巾以干燥板。然后，继续进行 D 部分。
注意：使用洗板机时，通过输入每个孔所需的洗涤缓冲液的体积以及每个 ELISA 板上每个孔应洗涤的次数来设置方案。将板放在板架上并运行协议。如果没有自动清洗机，可以使用设置为 200 µL 的多通道移液器进行 5 倍手动清洗。

桌子 1 .抗人 Lambda 和 Kappa 捕获抗体的预稀释
反人类卡伯 (μL)反人类拉姆达（微升）磷酸盐缓冲溶液（微升）全部的（微升）
33第1494章1500
注意：此 1:500 稀释度适用于一个板。将体积乘以测定中的板数。

桌子 2 . SARS-CoV-2 包被抗原的预稀释
捕获抗原（原液浓度，微克/毫升）工作浓度（ μg/mL）抗原体积（微升）磷酸盐缓冲溶液（微升）全部的（微升）
尖峰/核蛋白/RBD (500 µg/mL)3365,9646,000
注意：此稀释度适用于一块板。将体积乘以测定中的板数。

C.血清/血浆和对照样品的制备

1.样品制备应在测定当天进行（不应储存稀释的样品）。
2.使用用于传统 ELISA 的 BSA 测定缓冲液或用于敏感 ELISA 的山羊血清测定缓冲液在 U 型底稀释板中稀释样品。
3.对于 1:100 稀释，将 198 µL 测定缓冲液添加到稀释板的孔中，然后按照图 1 中的板计划在重复孔中添加 2 µL 测试样品。
4.对于 1:50 稀释，将 196 µL 测定缓冲液添加到稀释板的孔中，然后按照图 1 中的板计划在重复孔中添加 4 µL 测试样品。
5.以与测试样品相同的稀释度制备阳性和阴性对照样品；如果是商业用途，请根据制造商的建议进行准备。应使用 2 mL 冷冻管中的测定缓冲液制备阳性和阴性对照。
注意：对于 ELISA 板的每个孔，需要 50 µL 样品或对照。因此，在制备所需体积的阳性或阴性对照时，应考虑每个对照的孔数和实验中的板数。

D.封闭介质结合 ELISA 板

1.将 200 µL BSA 测定缓冲液（传统 ELISA）或山羊血清测定缓冲液（敏感 ELISA）添加到每个 ELISA 板的所有孔中。密封板并在室温（常规 ELISA）或 37°C（敏感 ELISA）下孵育 1 小时。
2.（重要）当距离封闭潜伏期结束还剩 20 分钟时，继续执行 E 部分。
3.孵育后，每孔用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤板五次。

E.标准的制定

1.使用纯化的人 IgG、IgA 或 IgM 在 2 mL 冷冻管中制备七种连续稀释的抗体标准品，如表 3、表 4 和表 5 所示。如果在特定时间运行多个板，则需要更有效地在冷冻管中制备标准品，然后将其移液至各自的 ELISA 板孔中。使用冷冻管还可以确保在进行系列稀释时正确混合。
注意：如果纯化抗体的库存浓度与表中提供的浓度不同，则必须调整初始稀释度以达到 1,000 ng/ mL 的起始浓度。
2.IgG 和 IgA 系列稀释为 10 倍，而 IgM 稀释为 5 倍。可以调整这些参数以适应特定的实验条件。

桌子 3 . IgG标准系列稀释化验缓冲。根据板计划和板数量调整体积。
人 IgG 初始 1:100 稀释
在制备系列稀释液之前，在适当的缓冲液中制备 1:100 稀释的人 IgG
稀释库存（毫克/毫升）库存（微升）测定缓冲液（微升）全部的（微升）
人类免疫球蛋白G1:1004.522198200
初始 1:100 稀释后连续稀释人 IgG
专注（纳克/毫升）免疫球蛋白G 标准（微升）测定缓冲液 (μL)总计（微升）拿超过（微升）左边超过（微升）
标准曲线人类 IgG（10倍稀释）1,00020第884章90490第814章
1009081090090810
109081090090810
19081090090810
0.19081090090810
0.019081090090810
0.00190810900-900

表4 . IgA标准系列稀释化验缓冲。根据板计划和板数量调整体积。
人 IgA 初始 1:100 稀释
在制备系列稀释液之前，在适当的缓冲液中制备 1:100 的人 IgA 稀释液
稀释库存（毫克/毫升）库存（微升）测定缓冲液（微升）全部的（微升）
人类IgA1:1002.02198200
初始 1:100 稀释后连续稀释人 IgA
浓度（纳克/毫升）免疫球蛋白A 标准（微升）测定缓冲液（微升）全部的（微升）拿超过（微升）左边超过（微升）
标准曲线人类IgA (1 0倍稀释)1,00045第855章90090810
1009081090090810
109081090090810
19081090090810
0.19081090090810
0.019081090090810
0.00190810900-900

表5 . IgM标准系列稀释化验缓冲。根据板计划和板数量调整体积。
人类 IgM 初始 1:100 稀释
在制备系列稀释液之前，在适当的缓冲液中制备 1:100 的人 IgM 稀释液
稀释库存（毫克/毫升）库存 (µL)测定缓冲液（微升）全部的（微升）
人类IgM1:1001.02198200
初始 1:100 稀释后连续稀释人 IgM
专注（纳克/毫升）免疫球蛋白M 标准（微升）测定缓冲液（微升）全部的（微升）拿超过（微升）左边超过（微升）
标准曲线人类IgM （5倍稀释）1,00090810900180720
200180720900180720
40180720900180720
8180720900180720
1.6180720900180720
0.32180720900180720
0.006180720900-900

F.添加样品、对照和标准品

1.按照板计划将 50 µL 样品/标准品/对照添加到板上相应的孔中。密封板并在室温下孵育 2 小时（常规测定）或在 37°C 下孵育 1 小时（敏感测定）。图 1显示了建议的样品、对照和标准品排列板计划。

图1 。代表板计划安排标准、样品、和控制。 “ SPL”代表样品，“对照”代表阴性对照， “+对照”代表阳性对照。

2.孵育后，每孔用 200 µL 洗涤缓冲液洗涤板五次。

笔记：
a.一些对照（对照 1、3 和 4）多次重复运行，作为在运行测定时测试操作员的一种方式。在不同位置运行对照可以显示当操作员将对照移液到各自的孔中时是否存在任何交叉污染或不一致。
b.您还可以选择不同类型的对照，其中一块板可以有两个阳性对照；一种是内部对照，另一种是商业制备的阳性对照，例如世界卫生组织血清阳性血清。
c.内部对照专门针对实验室的设备、试剂和技术来校准测定，而商业对照则充当可在不同实验室使用的标准化参考点，使不同实验室设置和实验之间的结果具有可比性。

G.添加二抗（检测抗体）

1.（重要）二抗应在使用前30分钟配制。添加检测抗体后，继续进行 H 部分。
2.对于常规测定：
a.对于IgG板，在测定缓冲液中按 1:10,000 稀释山羊 α-人 IgG-HRP 检测抗体。
b.对于IgM板，对于 Spike 蛋白，在测定缓冲液中按 1:1,000 稀释人抗 IgM-HRP 检测抗体，对于 N-蛋白，按 1:5,000 稀释。
c.对于IgA板，在测定缓冲液中按 1:1,000 稀释抗人 IgA-HRP 检测抗体。
d.每孔添加 50 µL 特定检测抗体。密封板并在室温下孵育 1 小时。孵育后，用 PBST 清洗板五次，每孔 200 µL。
3.对于灵敏测定：
a.每孔添加 50 µL 的一抗，按如下所述制备。密封板并在 37°C 下孵育 1 小时。
我。对于IgG板，在山羊测定缓冲液中按 1:15,000 稀释山羊 α-人 IgG-生物素检测抗体。
二.对于IgM板，在山羊测定缓冲液中按 1:20,000 稀释山羊抗人 IgM-生物素检测抗体。
三.对于IgA板，在酪蛋白缓冲液中按 1:20,000 稀释 α-人 IgA-生物素检测抗体。
b.孵育后，用 PBST 清洗板五次，每孔 200 µL。每孔添加 50 µL 按如下所述制备的二抗。密封板并在 37°C 下孵育 1 小时。
我。对于IgA板，在酪蛋白缓冲液中按 1:20,000 稀释 Poly-HRP40。
注意：对于 IgA 板，密封板并在 37°C 黑暗中孵育40分钟。
三.对于IgG和IgM板，请在山羊测定缓冲液中按 1:200 稀释链霉亲和素-HRP。
c.孵育后，用 PBST 清洗板五次，每孔 200 µL。

H.设置读板器和 Gen5 软件

1.打开阅读器 (Elx808)。读者将进行系统自检。
2.打开连接到读卡器的 PC，然后双击 Gen5 3.12 任务管理器图标将其打开。它将显示一个窗口，如图 2 所示。
3.单击Protocols > Create new创建一个协议，如图 2 中突出显示的那样。

图 2. Gen5 3.12 软件上打开任务管理器窗口

4.选中标准协议，然后单击确定。将显示如图 3 所示的窗口。

图 3. 选择标准协议选项后出现的窗口
5.单击用于创建或编辑步骤列表的图标，如图 3 所示。
6.之后，将出现如图4所示的窗口。选择板类型，例如96孔板。在“选择孔”下，选中“运行时”并指示您正在读取的板是否有盖子。

图 4. Gen5 软件上的程序布局

7.单击“读取” ，选中所需的波长（即 450 nm），如图 5 所示，然后单击“确定”。

图 5. 您可以在其中输入读取 ELISA 板所需波长的窗口

8.所选波长将显示如图 6 所示。之后单击“确定”。

图 6. 用于读取 ELISA 板的选定波长

9.双击工具生成器上的板布局，如图 7 所示。

图 7. Gen 5 软件上的板布局步骤

10.选择适当的孔类型，如图 8 所示，然后单击Next 。至关重要的是要在板中包含您想要的检测对照的数量。在此协议中，使用了四种测定对照。选择后单击“下一步” 。

图 8. 根据 ELISA 板方案选择不同的孔类型（即图 1）

11.根据需要更新空白。输入 BLK 的全名 BLANK、重复空白的次数（例如 2）以及选择的颜色代码，如图 9 所示。输入此信息后单击“下一步” 。

图 9. 在板布局窗口中为空白孔输入的信息

12.对测定对照和样品重复步骤 11。
13.酌情更新标准。如图 10 所示，输入 STD 全名作为待测抗体（例如 IgG）、重复空白的次数（例如 2）以及选择的颜色代码。输入 IgG 标准品的单位（例如 ng）和稀释因子（例如 10）。在 STD1 中输入起始浓度，然后单击接下来的框以自动填写其余标准。输入此信息后单击“下一步” 。

图 10. 在板布局窗口中为标准孔输入的信息

14.单击“确定” ，将显示板布局，如图 11 所示。

图 11. 板布局，您将在其中突出显示 ELISA 板的不同孔
15.通过突出显示样品类型（例如，BLK 表示空白）并选择适当的方向，将不同的样品类型分配到板上。
16.使用指针在板布局中拖动该样品类型所需的孔。或者，单击系列中的第一个孔，以按所选方向自动用该类型所需数量的样品填充相邻孔。板布局将如图 12 所示。

图 12. 板布局窗口，准确显示 ELISA 板不同孔类型的位置

17.正确填充该板布局后，单击“确定” 。
18.双击图7所示工具构建器上的数据缩减。将显示如图13所示的屏幕。

图 1 3. Gen 5 软件协议中的数据缩减工具

19.转到标准曲线（数据输入）并将 y 轴设置为 450。转到曲线拟合并将其设置为非线性回归（图 14）。

图 14. ELISA 板读数的标准曲线要求

20.双击报告/导出将显示构建器和图 15 所示的窗口。

图 15. 报告/导出生成器窗口

21.单击新建导出到 Excel ，并在名称下输入报告输出的名称（例如导出 1）。检查Plate 、 Automatic或Custom （如果您想自定义输出）并单击Ok 。将出现图 16 中的窗口。

图 16. 报告输出的内容，导出 1

22.检查内容下的所有参数，如图 17 所示。

图 17. 实验室报告上下文副标题下的不同参数

23.在“工作流程”下，选中“自动执行”、 “每个工作簿中的每个部分”和“导出后保存” ，如图 18 所示。单击“下一步” 。

图 18. 工作流程参数

24.在文件>文件名下，输入文件名（例如，）。检查文件夹并浏览要保存文件的文件夹，如图 19 所示。

图 19. 用于输入文件名和您希望存储板读数的位置的字段

25.单击“下一步”和“确定” 。
26.要创建自定义协议，请单击“新建导出到 Excel” ，如图 15 所示。在“名称”下，输入报告输出的名称（例如“导出 2”），选中“板”和“自定义”（图 20），然后单击“下一步” 。

图 20. 创建自定义协议时的自定义参数

27.单击“编辑模板” ，这将打开一个 Excel 工作表。
28.单击Excel 电子表格工具栏上的加载项。自定义工具栏显示如图 21 所示。

图 21. Excel 工作表中的自定义工具栏

29.通过单击下拉菜单并将其拖动到工作表中，根据需要自定义您的模板。
a.进入“字段组” ，将类别设置为“板信息”，将字段设置为“板 ID”，将标签设置为“板 ID”。
b.转到矩阵并添加板布局。
c.转到矩阵并添加 450。
d.转到Matrix并添加浓度。
e.转到“表” ，然后转到“统计”并添加 450。
f.前往餐桌然后统计并添加浓度。
g.转到图表并添加标准曲线。
h.关闭 Excel 并继续执行上面的步骤 20-22，如在自动生成器中所做的那样。
30.转到文件并将该协议保存在标有“协议和实验”的文件夹中，以便于识别。
31.要在程序中创建实验，请打开 Gen5 软件。
32.将出现任务管理器框，如图 22 所示。从选项中选择Experiments ，然后选择 Create using an existing protocol 。从列表中选择您刚刚保存的协议。

图 22. 任务管理器框，突出显示提供的选项中的“实验”部分

33.创建一个新实验。在工具栏中，选择“文件” > “另存为”并使用适当的名称保存。
34.在任务栏中选择“板” ，然后选择“添加板”并添加所需数量的要读取的附加板。
35.板出现在菜单树中，如图 23 所示。
36.双击Plate 1 ，然后双击Information 。输入适当的板 ID 并重复此操作以标记所有其他板。

图 23. 新实验下的菜单树。弹出窗口用于输入每个板的板信息，例如，在此图中，输入板 1 的板 ID。

37.使用 Microsoft Excel 创建每个板上的样品 ID 列表并将其粘贴到记事本文件中。
注意：您无法从导入样本 ID 列表。 xls文件导入到该软件中。
38.从每个板下方的下拉菜单中选择样品 ID ，如图 24 所示。

图 24. 下拉菜单中的 IDS 参数示例

39.从记事本文件导入样本 ID。或者，可以手动输入样本 ID。
40.将样品 ID 列表添加到每个板。保存包含更改的实验。
41.阅读器和软件现已设置为读取 ELISA 板。

I.添加底物并测定吸光度

1.（重要）TMB 底物溶液应在使用前至少 1 小时从冰箱中取出。
2.每孔添加 50 µL TMB 底物到板中，并在黑暗中孵育 3 分钟（传统 ELISA）或在室温黑暗中孵育 5 分钟（敏感 ELISA）。
3.添加 50 µL终止液来终止反应。
4.读吸收率在 450纳米通过研究定制方案，使用读板器和 Gen5 软件。
a.在您的实验中，右键单击您想要读取的板。在任务栏中，选择反应板，然后选择读取反应板 1 。
b.所有板，如图 25 所示。

图 25. 选择要使用 ELISA 阅读器读取的孔的窗口

c.将板放在载体上，然后单击OK读取板，如图 26 所示。

图 26. 将板装载到 ELISA 阅读器中的载体上的说明

5.将结果导出到 Excel 工作表并存储原始数据，其中包括每个板读取的标准曲线。这些标准曲线的示例如图 27、图 28 和图 29 所示。

图 27. 测量血清/血浆样品中 IgG 光密度 (450 nm) 和浓度时产生的标准曲线示例。 (A) IgG 浓度重组 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白。 (B) 针对重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 IgG 浓度。 (C) 针对 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD) (S1) S 蛋白的 IgG 浓度。 (D) 针对重组 SARS-CoV-2 刺突 S2 亚基蛋白的 IgG 浓度。

图 28. 测量血清/血浆样品中 IgM 光密度 (450 nm) 和浓度时产生的标准曲线示例。 (A) 针对重组 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 IgM 浓度。 (B) 针对重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 IgM 浓度。 (C) 针对 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD) (S1) S 蛋白的 IgM 浓度。

图 29. 测量血清/血浆样品中 IgA 光密度 (450 nm) 和浓度时产生的标准曲线示例。 (A) 针对重组 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 IgA 浓度。 (B) 针对重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白的 IgA 浓度。 (C)针对 SARS-CoV-2 受体结合域 (RBD)(S1) S 蛋白的 IgA 浓度。

数据分析

4.3.1或更高版本来分析数据。测定净光密度和浓度。

A.将读板器输出复制到一张 Excel 工作表上

如果一次运行多个板，则合并每个板的读数器数据并复制到一张 Excel 工作表上，清楚地标记每组数据及其板信息。

B.计算净 OD 值

要获得 450 nm 处的净光密度，请从每个板的每个样品的 OD 中减去空白孔的平均 OD。这可以使用图 30 中所示的代码片段来完成。或者，这可以在 Gen5 协议中指定，以给出净 OD 值作为原始数据。

C.计算净浓度值

要获得净抗体浓度，请将读板器数据中的给定浓度乘以样品稀释因子。这可以使用图 30 中所示的代码片段来完成。

图 30.显示如何计算净 OD 值和净浓度值的代码片段

注意：由于检测 LOD 和 LOQ，某些样品在板读数中不会有抗体浓度，并且此“??????”可能会出现而不是它们的浓度。然而，每个板的所有样品都应具有光密度。

1.使用上述R软件，对于没有浓度的样品（即带有“??????”的样品），净OD低于测定LOD的样品分配为“0”，高于测定LOQ的样品应滴定以确定其终点滴度/浓度。这可以使用图 31 中所示的代码片段来完成。

图31 。显示用于处理低于或高于检测限 (LOD) 的样本的 R 脚本的代码片段

2.Oluka 等人发表了使用包被抗原直接捕获和包被抗 kappa 和 lambda 抗体间接估计来确定测定截止值以及测定 LOQ 和 LOD 的详细说明。（2023）[1]。

协议验证

该协议已在以下研究文章中得到验证和使用：
1.Oluka GK、Namubiru P、Kato L、 Ankunda V、Gombe B、Cotten M； COVID-19免疫分析团队； Musenero M、 Kaleebu P、Fox J、 Serwanga J。优化和验证乌干达的传统 ELISA 和截止值，用于检测和定量抗 SARS-CoV-2 尖峰、RBD 和核蛋白 IgG、IgM 和 IgA 抗体。前免疫学。 2023 年 3 月 14 日； 14：1113194。doi ： 10.3389/fimmu.2023.1113194。电话号码：36999017； PMCID：PMC10045470。
2.Serwanga J、 Ankunda V、Sembera J、Kato L、Oluka GK、Baine C、Odoch G、Kayiwa J、 Auma BO 、 Jjuuko M 、Nsereko C、Cotten M、 Onyachi N、Muwanga M、Lutalo T、Fox J、Musenero M ,迦勒P; COVID-19免疫分析团队。在乌干达，快速、早期和有效的尖峰定向 IgG、IgM 和 IgA 可区分无症状和轻度症状的 COVID-19，其中 IgG 持续存在 28 个月。前免疫学。 2023 年 3 月 16 日； 14：1152522。doi ： 10.3389/fimmu.2023.1152522。电话号码：37006272； PMCID：PMC10060567。
3.Nantambi H、Sembera J、 Ankunda V、Ssali I、 Kalyebi AW、Oluka GK、Kato L、Ubaldo B、 Kibengo F、Katende JS、Gombe B、Baine C、Odoch G、Mugaba S、Sande OJ； COVID-19免疫分析团队； Kaleebu P、 Serwanga J。大流行前 SARS-CoV-2 特异性 IFN-γ 和抗体反应在乌干达样本中较低，而在 HIV 阳性样本中显着降低。前免疫学。 2023 年 4 月 19 日； 14：1148877。doi ： 10.3389/fimmu.2023.1148877。电话号码：37153598； PMCID：PMC10154590。
4.Serwanga J, Baine C, Mugaba S, Ankunda V, Auma BO , Oluka GK, Kato L, Kitabye I, Sembera J, Odoch G, Ejou P, Nalumansi A, Gombe B, Musenero M, Kaleebu P. 抗体的血清阳性率和耐久性患有轻度或无症状 COVID-19 的乌干达人对阿斯利康疫苗接种的反应：对疫苗政策的影响。前免疫学。 2023 年 5 月 2 日； 14：1183983。doi ： 10.3389/fimmu.2023.1183983。电话号码：37205095； PMCID：PMC10187141。

可靠性、再现性和稳健性： .
1.在方案验证中，所有样品均重复运行，并确保变异系数≤25%。标准曲线符合R 2 ≥ 0.9 的拟合优度（图5、表6、图7）[1]。
2.使用 SARS-CoV-2 特异性阳性对照抗体 CR3022 和 CR3009 以及已知血清阳性的局部血浆样本，使用 Levey-Jennings 曲线监测测定的一致性（图 8A 和 8B）。 OD 始终在 25% 的 CV 和平均值的两个标准差范围内，符合 Westgard-Sigma 规则的建议 [1]。
3.在不同的日期和由不同的操作员重复测定，以确定测定间和操作员间的精度；所有测试均符合 CV ≤ 25%（图 5）[1]
4.伦敦帝国理工学院和乌干达病毒研究所之间对协议进行了现场验证，对同一组样本进行了测试，并获得了可比较的结果，如图 9 所示[1]。
5.上述协议验证结果发表在Oluka 等人的开放获取文章中。 2023年[1]。 https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1113194 。

一般注意事项和故障排除

局限性

由于实验室环境温度波动以及检测中使用的包被抗原和二抗等试剂批次的变化，该 ELISA 方案的 OD 值会发生变化。
1.为了确保不同试剂批次的测定一致性，用不同批次的抗原包被 ELISA 板，例如，按照上述程序将新购买的刺突抗原与当前使用的刺突抗原进行比较。
2.在每个板上运行一组已知的阳性和阴性血清/血浆样品，从这些板中获得两组结果。
3.使用散点图分析数据以确定相关系数并查看其是否显着。还可以对匹配对使用 Wilkson 检验来给出 p 值，这将确定两批中的分布是否相同。如果 p 值小于 0.05，我们得出结论，两组之间存在显着差异。
目标病原体抗原决定簇的变化需要新的测定验证，以确保一致性并生成新的测定质量控制以供使用。

故障排除

问题 1：板的空白孔背景较高。
可能的原因：空气中存在污染物颗粒或使用的缓冲液、板在读数前放置太久或底物孵育温度太高。
解决方案：在生物安全柜中对板进行涂层。在干净的环境中准备测定缓冲液。在室温（23 °C ）下添加底物，添加底物后立即读板。

问题 2：样品重复的 OD 值的 %CV 高于 25。
可能的原因：样品稀释期间移液不一致。阅读时孔中出现气泡。
解决方案：使用正确校准的移液器，并在样品稀释过程中避免干扰。确保在样品添加过程中控制上下移液。添加底物或终止液时避免产生气泡。

问题3：非S形标准曲线。
可能的原因：标准品稀释不当。标准品的污染。标准恶化。
解决方案：严格遵循根据方案执行的稀释步骤。使用适当的稀释剂作为空白。尽量减少标准品的冻融周期，并在一周后更换等分试样。

问题 4：标准信号弱或阳性对照信号强。
可能的原因：样品或标准品中的抗体变质。
解决方案：准备等份，应在一周内使用并储存在 -20 °C下。

问题 5：样品重复孔的 OD 值未解析。
可能的原因：测试样品中目标抗体的高滴度高于标准的可定量范围。
解决方案：在新板上用 2 倍或 3 倍系列稀释液一式三份滴定未分离的样品，或在另一块板上以更高的稀释度测试未分离的样品。

问题 6：阴性对照样品的 OD 值不一致，高于预期范围。
可能的原因：制备过程中对照或测定缓冲液受到污染。
解决方案：在干净的小瓶中准备对照品。

问题 7：信号非常低或非常高。
可能的原因：忽视检测每一步的孵育时间和温度说明、污染、交叉反应、板清洗不良。
解决方案：如果高信号在整个板内是均匀的：
1.如果它是单个样品而不是整个板显示高信号，则应考虑该特定样品具有由高信号指示的高抗体浓度。
2.应确保检测中使用的抗体对目标具有特异性，并且不会与样品中的其他物质发生交叉反应。
3.建议在实验室中对该协议进行多次优化，以确保实施前结果的一致性和可重复性。
如果信号太弱：
1.可以增加酶与底物的孵育时间。
2.人们应该重新评估洗涤步骤，以确保它们彻底去除可能干扰信号的未结合物质。

致谢

作者感谢乌干达政府通过总统科学、技术和创新秘书处办公室 (STI-OP) 提供的资助，拨款号：MOSTI-PRESIDE-COVID-19-2020/15。该方案的验证是在 MRC/UVRI 和 LSHTM 乌干达研究单位完成的，该研究单位由英国研究与创新 (UKRI) 下属的英国医学研究理事会 (MRC) 和英国外交、联邦和发展办公室 (FCDO) 共同资助）根据 MRC/FCDO Concordat 协议，也是欧盟支持的 EDCTP2 计划的一部分。
使用该协议的项目是欧盟支持的 EDCTP2 计划的一部分（授权号 RIA2020EF-3008-COVAB）。用于协议验证的初始标本采集得到了格拉斯哥大学 GCRF COVID-19 快速反应基金（乌干达 COVID-19 血清学反应 UGANCOSER）的支持。
该协议基于比尔和梅琳达·盖茨基金会通过 GIISER 乌干达赠款协议投资 ID INV-036306 部分资助的研究。其中包含的研究结果和结论是作者的研究结果和结论，并不一定反映比尔和梅琳达·盖茨基金会的立场或政策。
以下试剂是在 HHSN272201400008C 下生产的，并通过 BEI Resources、NIAID、NIH 获得：单克隆抗 SARS 冠状病毒重组人抗体、克隆 CR3022（在 HEK293 细胞中产生）、NR-52481。以下试剂是通过 BEI Resources、NIAID、NIH 获得的：单克隆抗 SARS 冠状病毒重组人 IgG1，克隆 CR3022（产自本塞姆氏烟草），NR-52392。用作阳性对照的核蛋白mAb CR3009（NIBSC Repository，产品编号 101011）获自英国 NIBSC 艾滋病试剂中心。第一个 WHO SARS-CoV-2 国际标准，RN 20/136，人免疫球蛋白，S321534 获自英国 NIBSC 艾滋病试剂中心。第一个 WHO SARS-CoV-2 人类免疫球蛋白 20/B770 国际标准获自英国 NIBSC 艾滋病试剂中心。 SARS-CoV-2 RBD 的哺乳动物表达质粒是伦敦国王学院 Doores 实验室的善意捐赠。该协议的站点间交叉验证中使用的样本来自英国伦敦帝国理工学院 Hannah Cheeseman 博士的实验室。 696. 该方案已按照先前出版物 [1] 中的概述进行验证，并用于多项后续研究 [7, 9-11]。

利益争夺

作者声明，该协议是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下制定的。

道德考虑

使用人类参与者获取用于制定本协议的样本得到了乌干达病毒研究所 (UVRI) 研究和伦理委员会（参考号：GC/127/833）和乌干达国家科学技术委员会的审查和批准（参考：HS637ES）。患者/参与者提供了参与的书面知情同意书。

参考

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2.Faizo , AA、 Alandijany , TA、Abbas, AT、Sohrab, SS、El- Kafrawy , SA、Tolah, AM、Hassan, AM 和 Azhar, EI (2021)。用于检测针对 SARS-CoV-2 NP 蛋白的人类抗体的可靠的间接 ELISA 方案。诊断11(5)：825。
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