材料与试剂

生物材料

1.人永生化 RPE -1细胞（ATCC、hTERT RPE-1、CRL-4000），稳定表达人 mCherry-p62

试剂

1.200 目金Quantifoil网格 R2/1，带 SiO 2支撑层（ Quantifoil ，目录号：N1-S15nAu20-01，100/包）
2.PLL-g-PEG [ SuSoS ，目录名：PLL(20)-g[3.5]- PEG(5)]
3.聚 L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
4.mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯 MW 5,000 ( mPEG -SVA)（Laysan Bio, Inc. 目录号 MPEG-SVA-5000）
5.14.5 mg/mL PLPP（1 mL PLPP 溶液）[ Alvéole ，目录号：PLPP（用于液体）或PLPP_Gel （用于凝胶）]
6.纤连蛋白（人类天然纤连蛋白）（Gibco，目录号：PHE0023）
7.台盼蓝（0.4％台盼蓝染色剂）（Invitrogen，目录号：T10282）
8.胰蛋白酶（0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液与酚红）（Gibco，目录号：25300054）
9.Pen/strep（青霉素-链霉素，10.000 U/mL）（Gibco，目录号：15140122）
10.FCS（胎牛血清）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
11.磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Gibco，目录号：10010056）
12.DMEM（DMEM/F-12， GlutaMAX补充剂）（Gibco，目录号：31331028）
13.Fluorobrite （ FluoroBrite DMEM）（Gibco，目录号：A1896701）

实验室用品

1.镊子（生物镊子，高合金 DX Style 5 ）（Electron Microscopy Sciences，目录号：78325-5DX）
2.封口膜（Parafilm M）（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
3.培养皿（900 毫米培养皿）（VWR，目录号：391-2016）
4.Primo 模板（带 4 个孔的 PDMS 模板）（ Alvéole ，目录号：PDMS_STENCILS_4）
5.30毫米玻璃底培养皿（ Cellview细胞培养皿，35/10毫米，玻璃底）（Greiner Bio-One，目录号：627860）
6.T75组织培养瓶（T75组织培养瓶）（TPP，目录号：Z707503-100EA）
7.荧光标记（施德楼、 Textsurfer classic 364）
8.黑色记号笔（黑色实验室记号笔）（ SecurLine ，目录号：3083.2）
9.细胞计数载玻片（Countess细胞计数室载玻片）（Invitrogen，目录号：C10228）
10.细胞过滤器（ PluriStrainer mini 40 μm ）（ PluriSelect ，目录号： 43-10040-40 ）
11.15 mL falcon 管（15 mL 锥形离心管）（Falcon，目录号：352196）
12.Eppendorf 管（Safe-Lock 1.5 mL 微型试管）（Eppendorf，目录号：EP0030123328）
13.1微米_ FluoSpheres （ FluoSpheres ，羧酸盐改性微球）（Invitrogen，目录号：F8816）
14.乙烷（液化空气，目录号：P0500S10R0A001）或乙烷/丙烷混合物（37% 乙烷/63% 丙烷，日本天然气，目录号：611961）
15.用于未修剪网格的网格盒（Jena Biosciences，目录号： X-CEM-201）
16.用于修剪网格的网格盒（ Autogrid Compatible Cryo Grid Box）（ MiTeGen ，目录号：M-CEM-7AGB）
17.带有 FIB – SEM 切口的Autogrid环（ Thermo Fisher Scientific，目录号：1205101）
18.C形环（ Thermo Fisher Scientific，目录号：103171）

设备

1.佩尔科 easiGlow （派尔高 easiGLOW辉光放电装置）（Ted Pella Inc. 目录号：91000）
2.Pelco TEM 网格支架块（Ted Pella inc.，目录号：16820-25）
3.冰箱（三星，型号：RL30J3005SA）
4.倒置共焦或落射荧光显微镜（本协议中使用 Nikon Eclipse Ti2）
5.PRIMO 光图案设备 [ Alvéole ，光图案设备由（DMD + 激光 375 nm，75 mW ）Modulus、驱动电子设备、IHM 软件 LEONARDO 组成]
6.哺乳动物细胞培养箱（Binder，目录号：9040-0112）
7.层流罩（ Lamsystems ，Uniflow，目录号：2E-B.003-15）
8.水浴（ Julaba Pura 10，目录号：9 550 510）
9.细胞计数器（Countess II 自动细胞计数器）（Invitrogen，目录号：AMQAX1000）
10.宽视野显微镜（Zeiss Axio Vert.A1 FL）
11.离心机（Eppendorf，型号：5702RH，目录号：5704000010）
12.Vitrobot Mark IV（赛默飞世尔科技）
13.加热板（ CultureTemp 37 °C ，Bel-art Products，目录号： CHC7.1）
14.剪切站（ Thermo Fisher Scientific，目录号：1130697 或SubAngstrom产品代码 CSA01）
15.Aquilos2（赛默飞世尔科技）
16.CERES 冰罩（ Delmic BV，目录号：2708-999-0010-1）
17.METEOR 系统（ Delmic BV，目录号：2707-999-0014-2）
18.高端冷冻TEM，用于采集断层图像。这里使用了配备Bioquantum GIF ( Gatan ) 和 K3 直选探测器 (Gatan) 的200 kV Talos Arctica G2 ( Thermo Fisher Scientific)

软件和数据集

1.Inkscape 或 Adobe Illustrator（此处使用 2020，版本 24.1）
2.Leonardo（版本 4.15， https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/ ）（访问日期，2023 年 9 月）
3.xT Microscope Control（版本 20.1.1 ）（访问日期，2023 年 9 月）
4.MAPS（版本 3.19， https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/de/en/MAPS2 ）（访问日期，2023 年 9 月）
5.AutoTEM （版本 2.4.1， https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AUTOTEM5? SID=srch-srp-AUTOTEM5 ）（访问日期，2023 年 9 月）
6.ODEMIS（版本 3.2.2， https://github.com/delmic/odemis）（访问日期，2023 年 9 月）

程序

A.电子显微镜网格的微图案化（图1）

图 1. 微图案化工艺概述。电子显微镜网格经过辉光放电，使其具有亲水性。 (B) 将网格与用作防污层的 PLL-g-PEG 一起孵育。 (C) 配备Alvéole PRIMO 装置的荧光显微镜已聚焦，并且 DMD 镜已校准。 (D) 网格在 PLPP 中孵育，并用紫外激光局部去除 PLL-g-PEG 层。 (E) 将网格与纤连蛋白或另一种细胞外基质 (ECM) 蛋白一起孵育。 (F) 将哺乳动物细胞接种在微图案网格上。

1.板栅钝化：在板栅上施加防污层。在该过程的这一步中，整个网格表面都被 PLL-g-PEG 覆盖，这可以防止细胞粘附。
a.取几个200目金Quantifoil R2/1网格（SiO 2支撑层）。
b.Pelco对栅极两侧进行辉光放电 easiGlow 等离子清洁器。将网格放置在支架中或覆盖有封口膜的载玻片上，以便于拾取并在真空下辉光放电：15 mA，0.4 mBar ，60 – 90 s，保持 10 s。请注意，紫光表示正在发生辉光放电。用镊子翻转网格，使用相同的设置对另一侧进行辉光放电。辉光放电将使网格在接下来的步骤中得到适当的处理，而网格不会漂浮到液滴表面或粘附到所用的培养皿上（图1A）。
c.将网格放在培养皿中的一张封口膜上，滴有 30 μL PLL-g-PEG（PBS 中 ~0.5 mg/mL），并在 4 ° C 下孵育过夜（图 1B）。
d.将网格垂直浸入 PBS 中数次来清洗网格。
e.将网格暂时存放在带有 PBS 的盘中。网格可以在 4°C 下保存几天。
2.光图案化设备和 PLPP对网格进行微图案化。
a.打开荧光显微镜和电脑。
b.在 Inkscape 或 Adobe Illustrator 中绘制用于图案化的图案。将其另存为 . png文件，DPI 为 125。
c.将空玻璃底皿放在显微镜上以进行校准。用荧光记号笔在盘子上做标记，并用黑色记号笔画一个小十字。
d.插入 20 ×孔径（20 × S Plan Fluor ELWD，0.45 NA，本协议中使用空气）。
e.将显微镜聚焦在黑色十字上，并在此 z 高度设置完美的聚焦系统或其他自动聚焦系统（图 1C）。
f.将培养皿稍微移至有荧光标记的区域，打开 Leonardo 软件，然后单击“校准管透镜” 。
g.从 Leonardo 软件提供的选项中选择校准模式。您可以选择任何图案来校准管透镜，但我们建议使用特征低至 1 µm 的图案。此外，我们建议选择与您实际用于实验的模式相似的模式。如果您要设计线条图案，请选择带有线条的图案。如果您要绘制点或一些奇特形状的图案，请选择用点进行校准。 Leonardo 软件包含可供选择的基本校准模式。
h.调低激光功率和曝光时间，直到清楚地看到图案中最小的子结构。
i.当图案失焦时，转动 PRIMO 设备侧面的 DMD 轮。
j.在下一个屏幕上，显示像素比和激光功率。确认这些值在预期值之内。
k.将带有 4 毫米圆孔的 PRIMO 模板粘贴在新的 30 毫米玻璃底皿中。
l.将 2 μL的PLPP 移入孔中，并确保其扩散以覆盖孔的整个表面。
m.取一个网格并吸掉多余的 PBS。关键：不要完全吸干。
n.将网格放入 PLPP 液滴中，盖上培养皿的盖子，以防止网格干燥，然后将培养皿放在显微镜上。网格的方向并不重要（图1D）。
o.使用显微镜上的反射光模式将网格居中并聚焦在Quantifoil胶片上。
p.在 Leonardo 软件中打开您的图案文件。该图案包含黑色背景上的白色掩模网格，并确定适合您的细胞类型的形状直径。细胞需要有足够的空间来生长和扩散，同时理想情况下将每个遮蔽区域的面积限制为一个细胞（图 2）。移动并旋转图案，使其放置在网格方块的中心（如果需要）以及不对称标记附近的 EM 网格的中心。您可能需要访问高级功能才能启用图案旋转。建议仅对网格中间的正方形进行图案化，以便更容易通过 FIB 铣削和断层扫描进行访问。

图 2. EM 网格上使用的掩模图案示例。 A. 安 8 × 微图案过程中使用 8 个 20 μm 圆形掩模网格。 B、安 8 × 微图案过程中使用的 8 个 30 μm 圆形掩模网格。

q.将剂量设置为 900 mJ /mm 2并启用缝合模式。
r.将荧光显微镜切换到与 PRIMO 设备兼容的正确光路。
s.将图案锁定到位，然后按开始开始微图案程序。您应该看到网格表面反射出小光点。此过程应需要 3 - 10 分钟，具体取决于图案的大小和要图案化的正方形数量。
t.微图案化程序完成后立即取出网格，以避免过多的 PLL-g-PEG 层降解，并在新鲜 PBS 中清洗网格几次。
u.将网格放入装有 PBS 的新鲜 30 mm 玻璃底皿中。
v.在对其他网格重复该协议之前，用用于微图案的模板清洗玻璃底皿。
w.暂停点：微图案网格可以在 4°C 的 PBS 中保存长达四个星期。关键：小心并避免网格干燥。

边协议—使用 PRIMO 和 PLPP 凝胶对网格进行微图案化：
或者，可以使用 PLPP 凝胶代替 PLPP 来完成使用 PRIMO 的网格微图案化（Engel 等人，2021）。事实上， Alvéole的PLPP光引发剂也有凝胶形式，与液体形式相比，其光致图案速度提高了 30 倍。另一个优点是，如果需要，您可以将样品翻转过来，以便能够在 EM 网格条上打印。使用 PLPP 凝胶的协议需要对网格进行几个干燥步骤，并使用聚赖氨酸(PLL) 和mPEG -SVA 进行钝化：
•与上述常规 PLPP 程序一样，进行辉光放电并将 PDMS 模板放置在网格上。
•网格钝化：用 PLL 溶液（100 μg /mL，30 分钟）孵育网格，用 pH = 8.5 的 20 mM HEPES 冲洗 3 次，然后用mPEG -SVA溶液（10–20 μL ，用于1小时）。或者，可以如上所述进行与 PLL-g-PEG 的孵育。
•使用 PRIMO 进行微图案化：将一滴 PLPP 凝胶 (1 μL ) 在去离子水 (2 μL )中稀释并铺在网格上。溶液完全干燥后，将网格倒置在显微镜平台支架上。
•使用 Leonardo 软件的步骤与上述 PLPP 协议类似，但紫外线剂量显着降低 (20 – 40 mJ /mm 2 )。
3.用纤连蛋白孵育网格。
a.准备一个带有一小块封口膜的培养皿。
b.将 30 μL纤连蛋白滴 (50 μg / mL ) 放在石蜡膜上，并在每滴上放置一个网格。室温孵育 20 – 30 分钟。通过在 PBS 中稀释纤连蛋白储备溶液来制备纤连蛋白溶液。
c.使用前，用 PBS 清洗网格两次 5 分钟，用 DMEM 清洗一次。
d.关键：小心并避免网格干燥。
e.暂停点：网格可以在 4 ° C 的 PBS 中保存长达 7 天。关键：小心并避免网格干燥。

B.在微图案网格上接种哺乳动物细胞
接下来的步骤均在层流罩中的无菌条件下进行。
1.准备细胞进行接种。
a.在标准显微镜下检查细胞的活力和细胞健康状况。我们的细胞保存在 T75 烧瓶中，含有 12 mL DMEM 培养基，并补充有 Pen/strep 和 FCS。
b.吸出培养基并用温 PBS 短暂洗涤细胞。
c.2下孵育几分钟，直至细胞从培养皿中分离。
d.添加 5 mL 的 DMEM，重新悬浮细胞，并将其移至 15 mL Falcon 管中。
e.将细胞以 500 ×离心 g ，37°C 5 分钟。
f.吸出上清液并小心地将细胞重悬于少量新鲜、温热的 DMEM 中。
g.将整个细胞悬液通过 40 μm细胞过滤器放入新的 15 mL Falcon 管中以获得单细胞。
h.将 10 μL细胞悬浮液与 10 μL台盼蓝混合，并在计数玻片上移取 10 μL混合物。使用细胞计数器测定活细胞浓度（以细胞数/ mL 为单位）。
i.将微图案网格放入新鲜的 30 mm 玻璃底培养皿中的 ~1 mL 补充有 Pen/strep 和 FCS 的 DMEM 中，并小心地将 200,000 个细胞滴加到网格顶部。确保网格位于培养皿底部， Quantifoil薄膜朝上，间距均匀且距培养皿边缘较短距离。将培养皿与网格和细胞在细胞培养箱中于 37°C、5% CO 2下孵育。将剩余的细胞保存在温暖的地方（图 1E）。
关键：优化细胞系的细胞密度和孵育时间。添加过多的细胞将导致细胞也在覆盖有防污层的网格区域上生长。添加太少的细胞将导致通量降低并损失足够的适合 FIB 铣削的位点。
2.网格评估。
a.30-60分钟后，从培养箱中取出网格，并在光学显微镜下观察。
b.细胞应将自身附着到微图案化的网格区域以及网格周围的培养皿区域。当微图案区域没有大量细胞时，滴加额外的细胞并再次孵育。
c.将细胞在网格上孵育 4 – 5 小时，然后在 37 °C、5% CO 2下冷冻。

C.哺乳动物细胞的玻璃化冷冻

1.打开vitrobot并将室加热至37°C，湿度为85%。
2.在培养箱的小加热板上预热一些Fluorobrite介质，并在需要时制成 1 μm的悬浮液 Fluorobrite介质 (1:30)中的FluoSphere基准点。
3.用液氮组装并冷却氮气容器。一旦冷却，用乙烷或乙烷/丙烷混合物填充乙烷容器。当冷冻剂处于正确的温度时，乙烷会变得浑浊并冻结在杯子的侧面。
4.将网格、用于洗涤的Fluorobrite介质和基准悬浮液放在 37°C 热板或小型培养箱上。
5.将吸墨纸放在一个吸墨垫上，将一圈封口膜放在另一个吸墨垫上，进行背面吸墨。
6.Vitrobot镊子小心地从外环拾取网格，尽量不要干扰Q uantifoil薄膜。将镊子连接到vitrobot ，网格顶部和细胞面向带封口膜的垫。将网格短暂浸入Fluorobrite中以除去自发荧光 DMEM 介质。
7.添加 3.6 μL 1:30 FluorSphere s 骤冷前的基准暂停。确保悬浮液通过涡旋正确混合。
8.用 10 点印迹力和 1 排水时间印迹网格 8.5 秒。由于Vivibot机器不完全可重复，因此在需要增加或减少冰厚度时可能需要调整设置。建议每年由Thermo Fisher进行一次仪器校准，以帮助提高重现性。印迹力可以根据 Sader 等人的方案进行测量。（2020）。
9.暂停点：电子冷冻后，将网格存放在网格盒中，以将未夹住的网格放入液氮杜瓦瓶中。

D.冷冻FIB – SEM将细胞细化至约 150 nm

1.评估 FIB – SEM 室中的冰污染率。
注意：室真空会影响污染率。安装Delmic CERES冰罩可以显着降低污染率。评估不同条件下的污染率可以帮助确定用户可以铣削网格多长时间而不会使薄片恶化到无法使用的厚度（图 3）。

图 3. EM 网格的微图案化可用于大大提高低温聚焦离子束扫描电子显微镜 (FIB – SEM) 的网格质量。 A. 顶部：网格图案的示意图。底部：与人类间充质干细胞一起孵育的典型 EM 网格。 B. 上图：网格正方形中心有直径为 20 μm的圆圈的网格图案，用于在网格上接种细胞之前进行 PRIMO 光图案化。底部：带有中央粘附的 RPE-1 细胞的光图案 EM 网格。 C. 顶部：在所有网格正方形的中心绘制两个接触的 20 μm直径圆圈图案，以对齐细胞粘附，以便从不同角度进行铣削。底部：使用 PRIMO 系统进行光图案化的 EM 网格。可能的铣削位置用红色箭头表示。

a.将空的、剪裁好的网格加载到 FIB – SEM 中。
b.导航到网格中心的区域，聚焦并确定中心高度。使用 110° 的载物台旋转和 30° 的载物台倾斜。有关完整过程，请参阅下面的详细信息。
c.设置放大倍数以覆盖大约 4 μm水平场宽度 (HFW) 和电子束图像。将注意力集中在孔旁边的薄膜上。使用 0° 的扫描旋转。
d.在靠近网格顶部的支撑膜上选取两个孔，并测量孔边缘的膜厚度。对网格中心的两个孔和靠近网格底部的两个孔重复此操作。
e.等待一段固定的时间并重复该过程。对同一区域进行多次成像可能会缩小形成的冰层。为了避免这种情况，在每个时间点之后，使用一组不同的孔进行测量。
f.将数据绘制在图表中并计算斜率以获得污染率。
2.选择和准备适合铣削的场地。
a.准备冷冻FIB – SEM：
我。在xT显微镜控制软件中唤醒系统。
二.在“光束控制”选项卡中，选择“溅射真空”并吹扫管线五次。这大约需要 20 分钟。完成后返回高真空。
三.在冷冻TEM 准备选项卡中，净化 GIS 线路 30 秒。
四.向杜瓦瓶中注入液氮，并将热交换器放入其中以冷却系统。
b.剪裁网格：
我。按照Thermo Fisher 的程序夹住网格。
关键：小心操作，避免网格上积聚冰污染。
二.使用带切口的特殊自动网格环以改善网格访问。用黑色或蓝色标记标记环的边缘，以帮助将网格定位在 TEM 显微镜的自动加载器中。
三.将网格保存在液氮下AutoGrid的网格盒中。
c.将网格加载到 FIB – SEM 中：
我。冷却装载站并插入预倾斜的梭子。
二.冷却后，将网格盒放入工作站中，并将两个网格装入穿梭机中。确保自动网格切口完美位于顶部。小心操作，避免网格上积聚冰污染。
三.将穿梭机快速装载到 FIB – SEM 室中，并在断开传输杆之前使用室内摄像头检查正确位置。
d.阿特拉斯获取：
我。使用x T显微镜控制软件将航天器移动到腔室中的映射位置。它可能有助于将离子束和电子束的扫描旋转设置为 180°，以便于可视化。
二.使用 SEM 光束和 Everhart-Thornley 探测器 (ETD)，将光束聚焦在网格上并校正像散。对于薄冰样品使用 25 pA的 2 kV 光束，对于较厚冰的样品使用 5 kV 光束。
三.打开 MAPS 软件并拍摄整个网格的快照。
四.将一组图块放在网格的中心，5 × 7块瓷砖，瓷砖高度为600μm HFW ，总HFW为2.76毫米。将分辨率设置为 3,072 × 2,048，像素大小设置为 195 nm，停留时间设置为 1 us。开始收购。
e.同心高度和铣削角度的确定：
我。通过单击“添加薄片”在 MAPS 软件中标记潜在的铣削位点站点在这里。理想情况下，这些是位于网格正方形中间的单个单元，顶部没有任何冰污染。理想情况下，应仅选择靠近网格中心的正方形，因为靠近Autogrid环的位置会因高铣削角度而产生小薄片。
二.使用“驱动到映射位置”按钮导航到每个站点，增加 SEM 光束的放大倍数，并将光束聚焦在碳膜上。使用 2 – 5 kV、13 pA和 300 ns 驻留时间。在实时模式下，链接 z 。
三.使用手动方法确定每个铣削部位的同心高度； MAPS 中提供了提示， AutoTEM中提供了自动化程序。打开离子束并使用 ETD 探测器对每个站点进行成像。聚焦光束。使用 30 kV、30 pA和 100 ns 驻留时间。将舞台倾斜 20° 并对现场进行成像。如果可以看到自动网格环的边缘，请增加倾斜角度。当看不到它时，减小角度。从Autogrid环边缘可见的点向上倾斜 1 – 2°，以获得足够的间隙，使离子束不会偏转。通过单击“存储角度”在 MAPS 软件中标记此铣削角度。薄片站点名称旁边的图标将从橙色变为绿色。
四.在 FIB – SEM GUI 中标记每个位点的中心高度和铣削角度，以便稍后导航。
3.通过 METEOR 系统评估铣削场地。
a.确保载物台的 z 高度在显微镜 GUI 中链接。
b.打开 O DEMIS软件并新建一个项目文件夹。按 FM 成像将载物台移至 METEOR 位置并插入物镜 (LMPLFLN 50 × /NA = 0.5/WD = 10.6 mm)。
c.为每个荧光团添加成像流，选择每个通道的功率，并将曝光时间设置为 ~300 μs 。通常，200 – 400 mW就足够了，具体取决于荧光团、ROI 的丰度以及系统上的相机。使用绿色通道中的自发荧光信号聚焦图像，用物镜慢慢接近样品，直到目标细胞内的信号清晰或直到您可以看到Quantifoil支撑膜上由于其自发荧光特性而出现的孔。
重要提示：请勿将物镜插入太远，因为它可能会撞上梭子并损坏透镜。
d.获取每个薄片部位的图像，以确认细胞中是否存在ROI 。相机设置的良好开端是：bin 1、分辨率 1,190 × 928 px 、增益 16 位、读出速率 310 MHz。将其余通道中的曝光时间和功率调整为能够产生清晰信号但不会产生过饱和直方图的值。
e.将这些成像位置保存在 FIB – SEM xT显微镜控制软件中，以便以后更轻松地导航。
f.SEM 成像切换回腔室中的铣削位置。等待物镜缩回，梭子移回到腔室中的铣削位置。
g.xT显微镜控制软件中保存的位置导航到下一个铣削位置，然后重复步骤D 3d – D 3f。
4.批量研磨协议的设置。
a.打开AutoTEM 。它应该读取 MAPS 软件中的所有位置。
b.将具有以下参数（表 2）的模板应用于所有站点。

表2. AutoTEM中使用的铣削参数。在AutoTEM中导入并在此协议中使用的所有参数的描述。可能需要依赖于样本的优化。
准备●离子 HFW 超大尺寸：80 μm
●优心倾斜：禁用
●人工特征：禁用
●铣削角度：禁用
●图像采集：禁用
●薄片放置：启用
○离子 HFW 超大：150%
○最小离子 HFW：10 nm
铣削●薄片尺寸：17 μm × 3微米
●修正系数：0.60
●延迟：禁用
●参考定义：启用
●电子参考定义：禁用
●应力消除切割：测试切割是否有助于防止样品中的薄片弯曲
●参考重新定义 1：如果未进行应力消除切割，则禁用，否则启用
●粗铣：
○图案偏移： 1μm
○正面图案高度：7.2 μm
○背面图案高度：6.3 μm
○深度校正：30%
○正面重叠宽度：1.5 μm × 1.5微米
○背面重叠宽度：1.5 μm × 1.5微米
○铣削电流： 0.5nA
○图案类型：矩形
○DCM 重新扫描间隔：120 秒
○显示图形：已启用
●粗铣 - 电子图像：
○1,536 × 1,024, 3微秒
○启用ACB
○启用自动对焦
○高频W： 70μm
●参考重新定义2：启用
●中等铣削：
○图案偏移：600 nm
○正面重叠宽度：650 nm × 650 nm
○背面重叠宽度：650 nm × 650 nm
○倾角：0°
○深度校正：160%
○铣削电流： 0.3nA
○DCM 重新扫描间隔：90 秒
○图案重叠：400%
○图案类型：清洁横截面
●中等铣削 - 电子图像：
○1,536 × 1,024, 3 微秒
○启用ACB
○禁用自动对焦
○高频W： 70μm
●精铣：
○图案偏移：300 nm
○正面宽度重叠：350 nm × 350 nm
○背面重叠宽度：350 nm × 350 nm
○倾斜0°
○深度校正：160%
○铣削电流： 0.1nA
○DCM 重新扫描间隔：60 秒
○图案重叠：200%
○图案类型：清洁横截面
●精铣 - 电子图像：禁用
●更精细的铣削：
○图案偏移：200 nm
○正面重叠宽度：50 nm × 50 nm
○背面重叠宽度：50 nm × 50 nm
○倾斜0°
○深度校正：140%
○铣削电流：50 pA
○DCM重新扫描间隔：30s
○图案重叠：200%
○图案类型：清洁横截面
●精细铣削 - 电子图像：禁用
间伐●残疾人

c.xT显微镜控制软件中保存的位置导航到每个铣削位置，聚焦两个光束，然后单击AutoTEM GUI中的更新。该软件将拍摄图像并存储载物台位置和焦点参数以供以后使用。
d.将铣削列表中的站点一一启用。对于每个站点，单击“运行” ，仅启用协议的“准备”部分，然后单击“确定” 。 AutoTEM将拍摄图像并根据模板中的规格将铣削框放置在图像的中心。调整铣削框的大小和形状，并将它们放置在单元的中间，中心位于 ROI 所在的位置。请注意，细胞的某些部分应保留在两侧以维持薄片。按“确定”确认站点并将其保存在程序中。导航到xT显微镜控制软件中的下一个站点并重复步骤D 4 c– D 4d。
e.一旦所有站点都被标记并在AutoTEM中显示为绿色，则在没有提升系统的 FIB – SEM中将 GIS 层应用在网格上 8 秒，或者在具有提升系统的系统中应用 90 秒。通过导航到xT显微镜控制软件中的Cryo TEM 准备选项卡、选择要沉积 GIS 的网格、设置流动持续时间并单击开始来启动层沉积。
f.填充FIB – SEM 的杜瓦瓶，以确保有足够的液氮来完成自动研磨过程。
g.单击“在AutoTEM中运行” 。在弹出窗口中，仅启用“粗铣”选项卡并确保单击所有站点。当您计划手动进行薄片抛光时，请禁用精细铣削。将程序设置为逐步铣削并启动程序。
h.一旦开始自动粗铣程序，CERES 冰罩应自动插入并在所有铣削步骤中保持插入状态。
5.使用 METEOR 系统评估薄片质量。
a.将平台移动到成像位置并插入物镜 (LMPLFLN 50 × /NA = 0.5/WD = 10.6 mm)。
b.根据需要对每个荧光团重复使用相同的成像流，并将曝光时间设置为 ~300 μs 。通过缓慢插入物镜，使用绿色通道中的自发荧光信号聚焦图像。
c.拍摄每个薄片部位的图像，以确认薄片中是否存在ROI ，使用的曝光时间将产生清晰的信号，但不会导致直方图过饱和。
d.xT显微镜控制软件中保存的成像位置（步骤D 4c），直接切换到下一个成像部位。确保在执行载物台移动之前将物镜缩回 5 – 10 mm。
e.O DEMIS软件中的SEM 成像将梭移回。
6.抛光薄片。
a.在AutoTEM中，单独导航到每个站点并手动检查以确认是否存在良好的薄片。聚焦光束。
b.xT显微镜控制软件中相距约 300 nm 的两个矩形盒，使用30 p A的 30 kV 离子束逐步抛光薄片。定期监测薄片并寻找薄片前缘上的裂缝、孔洞、弯曲和消失的 GIS 层。在xT Microscope Control中启用iSPI并将其设置为每 2 – 8 秒自动拍摄一张 SEM 图像会很有帮助。更多SEM 图像会损坏薄片，因此要保守。
c.将盒子移近约 200 nm 并重复该过程。
d.当薄片保持完整和稳定时，将束流降低至 10 pA ，使盒子接近约150 nm或更小，然后重复减薄过程。
关键：如果主要 GIS 图层开始退化，使用过度倾斜继续稀疏会有所帮助。禁用下部铣削盒并将平台额外倾斜 +0.5° – 1°。仅以 10 pA电流从顶部进行研磨。当薄片背面开始降解或 GIS 消失时，停止铣削过程。
e.适当的薄片厚度可以通过使用 SEM 拍摄两张图像来估计。在 5 kV 下拍摄一张图像，在 2 kV 下拍摄一张图像。当片层厚度约为 250 – 300 nm 时，该片层在 5 kV 图像中将呈现深灰色，但在 2 kV 图像中将呈现白色或浅灰色。当片层厚度接近 150 – 200 nm 时，片层在 5 kV 图像中将呈现黑色，在 2 kV 图像中呈现深灰色。
7.使用 METEOR 系统采集最终图像。
a.将平台移动到成像位置并插入物镜 (LMPLFLN 50 × /NA = 0.5/WD = 10.6 mm)。
b.根据需要对每个荧光团重复使用相同的成像流，并将曝光时间设置为 ~300 μs 。通过缓慢插入物镜，使用绿色通道中的自发荧光信号聚焦图像。
c.拍摄每个薄片部位的图像，以确认最终薄片中是否存在ROI ，使用的曝光时间将产生清晰的信号，但不会导致直方图过饱和。如果ROI较小或存在少量荧光团，这可能需要长达 30 秒的曝光时间。
d.xT显微镜控制软件中保存的成像位置，直接切换到下一个成像部位。确保在执行载物台移动之前手动将物镜缩回 5-10 mm。
e.对所有薄片进行成像后，在调整直方图异常值后将所有图像导出为“打印就绪 tiff”以获得最终图像。
8.溅射涂覆薄片。
a.在所有薄片顶部添加薄薄的铂层，以提高薄片稳定性并减少 TEM 显微镜中的样品带电。单击xT显微镜控制软件中冷冻TEM准备选项卡中的准备溅射。
b.一旦室压力达到 0.1 mbar，溅射按钮就会出现，溅射室将覆盖梭子，梭子已移动到不同的室位置。
c.溅射 5 – 7 秒。通过观察室内摄像机上是否发出白光来确认是否发生溅射。
d.溅射完成后，立即按“从溅射恢复”返回高真空。
9.卸载网格。
a.冷却装载站。
b.快速从 FIB – SEM 室中取出梭子，并使用传输杆将其放置在装载站中。小心不要将梭子撞击到装载站的底部。
c.将梭子翻转 90°，然后非常小心地将网格移至网格盒中以剪裁网格。小心操作，避免网格上积聚冰污染。
d.将网格盒存放在干净的液氮下，直到准备好进行 TEM 成像。
e.杜瓦瓶中取出热交换器，将FIB – SEM 室预热至室温，并使系统“休眠”。

数据分析

FM/SEM 图像关联
使用 MATLAB R2021b（马萨诸塞州 Natick：The MathWorks Inc. ）执行 FM 和 SEM 图像之间的关联。简而言之，根据可识别的特征在两个图像上选择控制对组，并使用该点对点确定相似性变换矩阵。 FM 和 SEM 图像之间的点对应关系。最佳变换是使用合适成本函数的最小二乘最小化来确定的。

片层内可成像区域的量化
使用 ImageJ 软件对可成像区域进行量化 [美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国 ( Schindelin等人，2012)]。简而言之，片层的 TEM 概览图像最初按 3 倍进行分箱，以便更好地视觉区分片层内的清洁区域和污染区域。进行初始全局阈值处理以勾勒出被最厚冰晶（最低灰度值）污染的主要区域。然后使用免费选择工具手动选择较小的冰污染区域，并计算每个区域对应的面积。

断层图像的重建
使用 WARP 对倾斜系列进行运动校正和 CTF 校正（ Tegunova和 Cramer，2019）。接下来，使用AreTomo (Zheng et al., 2022)重建断层图像，并使用IsoNet (Liu et al., 2021)进行去卷积和去噪。使用 IMOD 完成数据可视化（ Mastronarde和 Hel，2017）。

协议验证

电子显微镜网格的微图案改善了细胞定位和细胞形状
图 3 显示了 PRIMO 系统光图案化的效果以及对网格质量的相关好处。图 3A 显示了传统的非微图案网格。请注意，细胞聚集在一起导致玻璃化效果不佳。许多细胞也位于网格条的顶部，使得它们无法通过冷冻FIB – SEM 进行减薄。图 3B 显示了光图案化的 EM 网格。细胞完美地位于网格正方形的中心，导致可能的 FIB 研磨位点显着增加，如红色箭头所示。图 3C 揭示了如何故意对齐细胞以覆盖所有可能的铣削方向。修改后的模式可用于帮助将 ROI 或细胞器重新定位到所选区域。

电子显微镜网格的微图案化有助于将 ROI 定位到网格方块的中心
在许多情况下，感兴趣的细胞特征很少，并且可能远离细胞核，这使得 ROI 在细胞外围的可靠定位变得复杂。
图 4 说明了如何使用微图案来帮助将 ROI 重新定向到网格方块的中心，从而提高针对这些细胞特征的能力。在图4A中，显示了未经过微图案化的网格。请注意，此网格正方形中有多个单元，单元体的最大部分位于网格条上或网格条附近。大多数 ROI 由于靠近网格方块的边缘或靠近质膜附近的细胞较薄区域而无法访问。在图 4B 中，使用简单的圆形图案来帮助重新定位细胞，但不帮助重新定位感兴趣的细胞器。此处，单元格的位置远离网格方形边缘。用mCherry标记的 ROI主要位于细胞外围，因此很难在细胞层中捕获，如白色虚线所示。在图 4C 中，使用修改后的模式来增加可以在薄片中捕获的 ROI 数量。大多数细胞的细胞外围都具有这些特征。因此，两个电池之间的界面被光图案引导至网格正方形的中心。现在可以将薄片定位在细胞外围，从而增加了在单个薄片中捕获 ROI（红点）的可能性。可以设计其他图案来专门定位其他细胞器或细胞特征。

图 4. 微图案化可实现位于细胞外围的 ROI 的细胞器定位。 A. 与 RPE-1 细胞一起孵育的典型 EM 网格。 B.在将 RPE-1 细胞接种到网格上之前，在所有网格正方形的中心用 20 μ m直径的圆圈进行光图案化的 EM 网格。 C. 一个 EM 网格，其网格正方形中心有两个相互接触的 20 μm直径圆形图案。可能的铣削位置用白色虚线表示，所使用的照片图案在每个图像的左上方表示。

CERES 冰罩减少了样品上冰污染的增长
图 5A 和 5B 显示了代表性 SEM 图像，说明了 D1 节中描述的冰厚度估计程序。这些测量的结果用于量化室内冰生长的速率。图 5C 和 5D 中的图表显示了分别在安装 CERES 冰罩之前和之后一式三份确定的每个测量时间点的冰层平均厚度。安装前，3小时后测得的冰层厚度约为8.5±4.2纳米。相比之下，安装后延长网格在室内的停留时间并在 22 小时后测量冰层厚度，得到的冰层厚度约为 10.8 ± 2.0 nm。根据这些结果，在安装 CERES 冰罩之前和之后，平均冰生长速率估计分别为 3.0 nm/h 和 0.6 nm/h。这些差异相当于在存在 CERES 冰罩的情况下冰污染减少了 5 倍以上。请注意，这款 Aquilos2冷冻FIB – SEM 仪器在安装 CERES 冰罩之前已经进行了室真空改进，从而降低了污染率。较旧的类似设备显示冰生长速率约为 50 nm/h，安装 CERES 冰罩后，冰生长速率将降至 2.0 nm/h 以下（Tacke 等人，2021）

图 5. CERES 冰罩安装前后室内冰生长速率的测定。 A/B。用于测量冰层厚度的支架上Quantifoil孔的代表性 SEM 图像：顶行图像描绘了第一个时间点（T = 0 小时），底行图像描绘了最后一个时间点（T = 安装前 3 小时， T = 安装后 22 小时）。右上角的放大插图显示了图像上层厚度的测量结果。为了确定冰厚度，使用与 T = 0 h 的层厚度差。光盘。 CERES冰罩安装前后各测量时间点冰厚对应图。在不同的网格区域上进行三次测量以生成平均值。通过安装前后 3.0 和 0.6 nm/h 的线性拟合估算平均冰生长速率。

使用 CERES 冰罩和 METEOR 系统改进的工作流程减少了薄片上的冰污染，从而大大提高了样品通量
图 6 描绘了与使用独立冷冻荧光显微镜相比，使用 METEOR 确认 ROI 的影响。在没有 METEOR 的情况下，将批量研磨的薄片转移到冷冻共焦显微镜以确认 ROI 的存在。我们使用配备Linkam CMS196 冷冻台的 Zeiss LSM 800 直立共焦显微镜进行这项工作，但任何具有冷冻功能的荧光显微镜都可用于对薄片进行成像。污染物累积率因不同的显微镜和冷冻台配置以及处理速度和房间湿度而异。如图 TEM 概览图像以及图 6A 中的更高放大倍数特写所示，这一额外的转移步骤会导致严重的结晶冰污染，其形式为许多大（高达 1 μm ）的不透明冰晶遍布整个薄片，从而模糊了断层图像采集的潜在候选区域。额外的转移使样品面临进一步失透的危险。然而，如第 5 节所述，在 FIB 室中使用 METEOR 评估薄片质量，消除了这一额外的转移步骤，从而产生如图 6B 所示的干净、无霜的薄片。为了量化 METEOR 对减少结晶冰污染的影响，筛选了不使用 METEOR 的六个薄片和使用 METEOR 的九个薄片的 TEM 概览图像，以检测结晶冰颗粒。如果在工作流程中不使用集成 METEOR，则在 668 μm 2的总筛选区域中确定了 30.2% 的遮挡区域。使用 METEOR，在 2200 μm 2的筛选区域中检测到 2.8% 的遮挡区域。 CERES 冰罩和 METEOR 系统的存在使得能够铣削更完整的薄片（总表面积增加 329%），并导致每次会话的可用面积更大（增加 458%）。

图 6. 使用和不使用室内荧光检测时薄片上的霜污染程度。 A. 批量研磨薄片的 TEM 图像概述，其中使用单独的冷冻共焦显微镜对 ROI 进行确认。由于向冷冻共焦显微镜进行了额外的转移步骤，不同尺寸和形状的冰晶（以白色标记）覆盖了所示薄片区域的 25.4%。在特写镜头中，红色箭头指向模糊的潜在 ROI，否则该 ROI 可能是断层扫描采集的候选对象。 B. 批量研磨薄片的 TEM 图像概览，其中使用 METEOR 在真空室内确认了 ROI 的存在。消除了额外的最终转移到单独的荧光显微镜的步骤，导致干净的薄片具有 99.2% 的可成像区域（插图比例尺：500 nm）。

为了验证升级工作流程的有效性，在表达 mCherry-p62 的稳定、永生化人 RPE-1 细胞上测试了所描述的程序。 p62/SQSTM1（以下简称 p62）是一种经典的自噬货物受体，它在 C 末端结合多聚泛素化货物，并在 N 末端聚合成丝（ Ciuffa等人，2015 年；Jakobi 等人，2020 年）。这种聚合导致相分离，显示细胞内的液滴，从而促进自噬货物的浓缩和分离（Turco et al., 2021）。随后，液滴被限制在双层膜中，形成自噬体。最后，自噬体被转运至溶酶体。
图 7 描述了程序第 3 节中描述的分步目标薄片铣削过程。一旦根据 METEOR 提供的原位荧光信号选择了感兴趣的细胞（如图 7A – 7C 所示），研磨过程就开始了。为了避免铣削掉合适的 ROI，在铣削过程中进行了多次检查。在图 7D – 7F 中显示了 500 nm 薄片厚度处的检查点，因为它确认了潜在 ROI 的存在，从而允许薄片进一步变薄。一旦薄片达到所需的厚度，由 METEOR 进行最终检查，如图 7G – 7I 所示，以确定薄片是倾斜系列采集的合适候选者。冷冻FIB 铣削不同阶段的 SEM 和 FM 图像之间的相关性被叠加以监测进度，如图 8A –8 C 所示。该最终荧光图像还与最终薄片的 TEM 概览图像相关联，以准确定位 ROI，如图所示在图8D中。图像相关性用于记录感兴趣地点的倾斜系列冷冻透射电镜。随后，重建倾斜系列以生成断层图，并通过将 METEOR 图像与最终断层图相关联来确认 ROI 的存在（图 9）。

1细胞进行靶向薄片研磨-。 A – C. 分别使用 SEM、FIB 和 METEOR 成像的感兴趣细胞的预研磨状态。 SEM 和 FIB 图像中的红色箭头指向同一细胞。 D – F. SEM、FIB 和 METEOR 图像分别对应于 500 nm 片层厚度的检查点。白色箭头指向潜在 ROI 发出的荧光。 G – I. SEM、FIB 和 METEOR 图像分别对应于最终检查点。 (I) 中的白框勾勒出最终薄片中的荧光区域。

对人 RPE -1细胞进行原位相关冷冻FIB 研磨。铣削前的 (A) SEM 和 METEOR 图像、(B) 500 nm 片层厚度和 (C) 最终片层厚度之间关联后的叠加图像。 (D) 薄片的最终荧光图像还与 TEM 概览图像相关联，以查明断层图像采集的合适位置（白框）。

图 9. 与 METEOR 图像相关的断层切片。 A. 断层扫描图像切片显示溶酶体。 B. 来自 METEOR 系统的相应荧光显微镜图像与断层切片透明重叠（红色：mCherry-p62；绿色：自发荧光背景信号，通常伴随溶酶体）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

通过将 PRIMO ( Alvéole ) 与 CERES 冰罩 ( Delmic ) 和 METEOR ( Delmic ) 相结合，我们的冷冻 ET 工作流程的生产率比传统工作流程提高了一个数量级（表1 ）。首先，通过使用 PRIMO 光图案化系统提高网格质量，我们能够通过将单元限制在网格正方形的中心来改善单元定位，从而将适合铣削的单元数量增加至少 4 倍。微图案化还提供对细胞形状的控制，因此允许重新定位感兴趣的细胞特征，例如，当它们位于细胞的外围时。随后添加的 CERES 冰罩大大降低了冷冻FIB – SEM 室中表面冰污染的堆积率。这种污染陷阱允许更长的铣削时间，从而提高产量。最后，通过使用 METEOR 室内荧光显微镜，我们减少了仪器之间的样品转移步骤数量，这是冰污染的主要来源。此外，METEOR 系统可以频繁检查薄片，以确保它仍然包含 ROI。在每个中间检查点，当 ROI 不再存在于薄片中并被铣掉时，可以跳过该薄片上的抛光步骤，并且可以节省宝贵的显微镜时间以用于更合适的位点。总之，标准 FIB – SEM 仪器的三个集成附加功能具有高度互补的价值，可提高原位结构生物学方法的片层生成的质量和效率。

故障排除

问题 1：没有观察到任何图案，网格上到处都有细胞生长。
解决方案 1：辉光放电可能效率较低。增加辉光放电持续时间或电流。确保您看到液体在网格表面散开，而不是聚集并从侧面滚落。
解决方案2：防污层/钝化没有在上述正确的条件下进行。增加 PLL-g-PEG 浓度或孵育时间。
解决方案 3：确保网格在处理时不会变干。干燥网格会导致防污层塌陷。
解决方案4.减少网格上细胞的孵育时间。当网格上的细胞过度生长时，细胞将继续分裂并最终扩散到非图案区域。
解决方案 5. 细胞可以在网格下方生长，而不是在网格顶部；将网格移至装有培养基的干净培养皿中，并检查网格上的细胞分布。在将细胞接种到顶部之前，请务必确保网格平放在培养皿底部。
光引发剂溶液中取出网格并彻底清洗。图案化后的大量孵育可能会导致自由基的形成，从而降解 PLL-g-PEG 层。

问题 2：没有观察到任何图案，细胞也没有在网格上的任何地方生长。
解决方案 1：在接种细胞前增加纤连蛋白浓度或孵育时间。
解决方案2：换用另一种细胞外基质蛋白，例如玻连蛋白，看看是否没有观察到细胞生长。
解决方案 3：确保网格材料对细胞无毒。例如，铜网格泄漏介质中的离子，导致细胞死亡。

问题 3：尽管有 CERES 冰罩，但薄片上仍可见大量冰污染。
冷冻FIB – SEM中卸载网格并将网格加载到 TEM 中时要格外小心。仅使用清洁的液氮，在低湿度的房间中工作，工作快速而准确，最后，在处理网格时考虑戴上面罩。
解决方案 2：检查冷冻FIB – SEM 室真空度。正常磨损会导致管道泄漏和真空室真空值降低。

问题 4：使用 METEOR 系统成像的薄片上可以看到广泛的失透现象。
解决方案 1：减少激发光功率和/或曝光时间。
解决方案2：使用前务必确保所有工具充分冷却至液氮温度，尤其是用于直接操作网格的镊子。

问题 5：尽管目标存在于薄片中，但使用 METEOR 系统在薄片中看不到荧光。
解决方案 1：增加激发功率和/或曝光时间并使用相机合并。
解决方案 2：具有低丰度或微弱标签的蛋白质可能很难在最终的约 150 nm 厚的薄片中检测到。切换到新一代更亮的荧光团，编码三重标签，即 3 × eGFP而不是eGFP ，或者考虑标记另一种更丰富的蛋白质，该蛋白质也将定位到您的 ROI。

致谢

作者衷心感谢研究中心 Ernst-Ruska 中心生命科学 EM 设施提供的电子显微镜培训、成像和访问时间于利希。作者衷心感谢 JARA Vergabegremium授予的计算时间以及在Forschungszentrum超级计算机 JURECA 的 JARA 分区部分上提供的计算时间于利希。萨布丽娜·贝尔坎普 ( Sabrina Berkamp)获得了亚历山大·冯·洪堡基金会博士后研究员奖学金的资助。作者衷心感谢挪威奥斯陆奥斯陆大学医院的 Andreas Brech 和 Sebastian Schultz 在本方案中使用的细胞系。图 1 的部分内容是使用BioRender ( www.BioiRender.com )创建的。微图案化方案改编自Toro- Nahuelpan等人。（2020）。

利益争夺

M. Smeets、C. Jonker 和 D. Daviran是Delmic BV 的员工。 A. Caignard和 RA Jani 是Alvéole的员工。 S. Berkamp 、P. Sundermeyer、S. Gerlach、B. Hoffmann 和 C. Sachse 声明不存在竞争利益。

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