材料和试剂

生物材料

1.人类间充质干细胞衍生的从脐带的绳索组织冷冻管，已存储液氮2 汽相（提供经过公爵大学 MC3)
2.人类周边血十分之一白细胞介素新鲜的（干细胞技术， 200-0092）

试剂

1.Prime-XV MSC 扩展（ XSFM）（尔湾科学，目录号： 91149 ）
2.青霉素/链霉素（P/S）（密理博 Sigma，目录号： P4333 ）
3.磷酸盐缓冲的盐水 (PBS) 不含 Ca 2+ 、Mg 2+ （Millipore Sigma，目录号： TMS-012-A ）
4.PLTGold ®人类血小板裂解物（ hPL ）（ Millipore Sigma，目录号： SCM151；）
5.胰蛋白酶表达 1 × （密理博西格玛，目录号： 12605028 ）
6.Cryostor® CS -10（费舍尔科学，目录号： NC9930384 ）
7.Lymphoprep TM （干细胞技术，目录号： 07801 ）
8.胎牛血清（胎牛血清）（任何小贩）
9.僵尸紫外线可修复活力套件（ BioLegend® ，目录号： 423107 ）
10.人类特鲁染色 FcX TM （ BioLegend® ，目录号： 422302 ）
11.BD Cytofix TM固定缓冲液（BD 生物科学，目录号： 554655 ）

解决方案

1.稀释缓冲区（参见食谱）
2.FC 缓冲区（参见食谱）
3.活力染色解决方案（参见食谱）
4.氟碳堵塞解决方案（参见食谱）

食谱

1.稀释缓冲
试剂最终的专注数量
不含PBS Ca 2+ /Mg 2+ (1 × )98%98毫升
人PL2%2毫升
全部的100%100毫升

2.FC缓冲器
试剂最终的专注数量
公共广播公司钙2+ /镁2+ 自由的 (1 × )98%98毫升
胎牛血清2%2毫升
全部的100%100毫升

3.活力染色液
试剂最终的专注数量
公共广播公司钙2+ /镁2+ 自由的 (1 × )99.999%9.99毫升
僵尸紫外线染料（重组）0.001%10微升
全部的100%10毫升

4.Fc 块溶液
试剂最终的专注数量
FC 缓冲90%9毫升
人类特鲁染色 FcX10 %1毫升
全部的100%10毫升

实验室用品

1.CellBIND® _ 表面超级烧瓶® 细胞培养容器（康宁® ，目录号： 10020）
2.50 毫升锥管（任何小贩）
3.无菌储存瓶（任何供应商）
4.血清移液器和吸头，各种卷（任何供应商）
5.微量移液器和尖端， P10 – P1000 微升（任何小贩）
6.T-150 转移包（Fisher Scientific，目录号： NC0470433 ）
7.菲尼亚 50 管组（ Terumo 血和细胞技术，目录号： 22050 ）
笔记：这管道放包含一个混合袋，一个质量控制袋 (10 – 40 mL)，以及三个贮存袋（总共 10 – 84 毫升）。
8.菲尼亚 250 管道套装（辉茂血和细胞技术；目录号： 22250 ）
笔记：这管道放包含一个混合袋，一个质量控制袋 (10 – 40 mL)，以及三个贮存袋（总共 29 – 210 毫升）。
9.汽阶段贮存用于细胞样品的冷冻管，包括 QC （任何小贩）
10.微量离心机管低的捆绑（任何小贩）
11.Via-1-Cassette TM墨盒（ Chemometec ，目录号： 941-0012 ）
12.注射器 10 毫升和鲁尔乐（任何小贩）
13.钝充满针 18 标距长度 1.5英寸（任何供应商）
14.受控速度冰箱罐架子可调节的（热电偶费舍尔科学，目录号： 11679084 ）
15.不锈钢冷冻罐和包容量 250 毫升（热电偶费舍尔科学，目录号： 4000335 ）
16.框架到抓住 LN2 中的罐存储（热费舍尔科学，目录号： 4R5461 ）
17.坦克的液体氮（任何供应商）
18.96 孔板（任何供应商）

设备

1.生物安全内阁（平衡计分卡）级别 A2 （例如， Thermo Fisher Scientific，目录号：1377 ）
2.孵化器放到 5% 二氧化碳_ 和 37 ℃ （例如， HeraCell VIOS；赛默飞世尔科技）
3.细胞计数器（例如， Chemometec ，型号：核计数器_ NC- 200TM ）
注意：细胞计数方法可能有所不同。使用可靠且可重复的方法来获取细胞计数和直径非常重要。
4.冷藏离心机有能力的的达到800 rcf /g 和使用 50 毫升锥管（任何小贩）
5.微量移液器 P10–1000 μL _ （任何小贩）
6.吸管控制器（任何小贩）
7.倒显微镜（例如， Thermo Fisher Scientific，型号：EVOS M5000）
注意：显微镜仅需要用于细胞的相差成像。
8.菲尼亚充满和结束系统（辉茂血和细胞技术）
9.无菌管焊机（辉茂血和细胞技术、型号：TSCD-II)
10.管道密封剂（辉茂血和细胞技术，型号： T-SEAL 移动的）
11.流动细胞计数器，例如CytoFlex （贝克曼库尔特）， LSRFortessa （BD）
12.液体氮气 (液氮2 ) 杜瓦瓶或者冷冻装置（任何供应商）
13.受控速度冰箱（例如， Thermo Fisher Scientific， CryoMed ，目录号： 7454 ）
注意：冷冻机需要可编程至 -90 °C 。

软件和数据集

1.细胞加工应用（注册会计师）软件版本 2.1 和菲尼亚充满和结束系统
2.流动细胞计数术软件为了数据分析，例如， FlowJo TM软件（BD 生物科学），细胞库（贝克曼库尔特）

程序

全部细胞处理程序应该是执行的在平衡计分卡。菲尼亚系统_ 做不是要求用于平衡计分卡。以下程序概述了 MSC 和 PBMC 的细胞制备实践，作为使用自动化系统进行后续处理和冷冻保存的起始材料。更具体地说，这些程序包括冷冻保存的MSC的解冻、细胞培养和收获以及从新鲜的（即未冷冻保存的）十分之一的白细胞白细胞中分离PBMC 。
注意：不建议遵循直接解冻并从冷冻保存的白细胞介素中分离的 PBMC 的处理和冷冻保存程序。如果使用冷冻保存的leukopak ，则在处理和冷冻保存之前需要 24 – 48 小时的培养救援期。

A.细胞解冻（冻存细胞、MSC）

1.解冻 XSFM 媒体在 4 ℃ 过夜事先的到这的一天使用。
2.准备新鲜培养基通过增加 1% 压力/压力到 XSFM。
3.添加 8 毫升新鲜的媒体到 A 50 毫升锥形管。
4.取回一个小瓶的冷冻的细胞来自逻辑网络2 贮存。
5.解冻这小瓶在 A 水沐浴套装在 37 ℃ 为了 2 分钟或者直到 90% 的这冰有融化了。
注：这个可能取决于这大小小瓶和内容体积。
6.记录这解冻时间。
7.轻轻地转移这细胞从这冷冻瓶到 A 50 毫升锥管子使用 A 1,000 微升微量移液器和提示。
8.洗这小瓶和 1 毫升新鲜的媒体和添加这到这锥管子。这最终的体积的这解冻介质和细胞应该大约10 毫升。
9.轻轻地重新暂停这细胞和 A 10 毫升血清学的吸管。
10.履行 A 通过将 100 μL细胞悬浮液添加到微量离心管中来进行细胞计数 #1（“解冻预旋转计数”）。
11.插入 Via-1-Cassette 尖端进入微量离心管中进行吸收大约 60 微升的细胞暂停。
12.将盒式磁带装入这核子计数器和记录这细胞数数和直径。
注意：请在将细胞装入盒后 1 分钟内完成读数。
13.离心机这其余的细胞暂停在 500 ×克 5 分钟在 4 ℃ 。
14.吸出这上清液使用 A 10 毫升血清学的吸管和添加足够的媒体到给一个近似细胞专注之间 1 和 2.5 × 10 6细胞/mL （最佳的专注为了准确的决心的细胞数数）。
15.彻底重新暂停这细胞。
16.履行和记录细胞数数 #2（“解冻后旋转数数”）经过添加 100 微升的细胞暂停到 A 微量离心机管子。
注意：由于死细胞在旋转中被消除，旋转后的细胞测量可以给出调整后的活力测量，并且也可以更准确，因为细胞通常稀释程度较低。
17.插入 Via-1-Cassette 尖端到摄取大约 60 微升的细胞暂停。
18.加载进入这核子计数器和记录这细胞数数和直径。
19.计算这体积需要的的细胞暂停到给出 1.72 × 10 6 个细胞（数量的细胞需要的为了每个超级烧瓶）。
20.添加第560章毫升介质 (XSFM + 1% P/S) 放入存储瓶中。将 1.72 × 10 6 个细胞（1,000 个细胞/cm 2 ）添加到储存瓶和岩石中，以确保细胞均匀分布在培养基中。
21.轻轻地倒这细胞悬浮液进入超级烧瓶倾斜于 A 30 °角到水平的。
22.地方这帽和分发这细胞暂停之中所有层的这烧瓶经过放在它是长的侧面和然后它是短的边; 然后，放好它说谎平坦的并重复这些动作为了甚至分配的细胞在全部层。
23.确保那那里是不空气气泡在这身体的这烧瓶经过添加更多的媒体如果需要。小的附近的气泡是可以接受的这脖子的这烧瓶。
24.孵化五个_ 至 7 天在一个孵化器放在 5% 二氧化碳_ 和 37 ℃ 。

B.细胞扩增和收获

1.拿每日显微镜图像的这最低层的这烧瓶到测量合流。做不是允许这间充质干细胞到变得人满为患。收成间充质干细胞当 80% 合流已完成。
2.小心倒 50 介质毫升数从这烧瓶进入 A 50 毫升锥管子。标签和放在旁边。这是用过的之后到洗这烧瓶。
3.消除全部其余的媒体从这烧瓶经过浇注轻轻地进入 A 浪费容器。
4.添加 50 PBS毫升_ 1× 钙2+ , 镁2+ 自由的到这超级烧瓶和倾斜这烧瓶在它是长的结尾，短的结尾，和平坦的边多种的次为了一个均匀的分配的这试剂。
5.消除这公共广播公司经过浇注它轻轻地进入 A 浪费容器。
6.添加 50 mL的TrypLE 1× 到烧瓶并分发均匀地经过旋转这烧瓶沿着每个结尾到分离细胞。
7.孵化这烧瓶用于 5分钟在 37 ℃ 。
8.查看这细胞在下面 A 显微镜。轻敲这烧瓶轻轻反对这显微镜根据到驱逐细胞。如果不完整的分离的这细胞从这烧瓶是观察到的，重新孵化为了在至少另一个 5 分钟。
9.一次这细胞是完全地分离, 添加 50 XSFM 的毫升数到这烧瓶和通过沿两端旋转烧瓶来均匀分布以抑制TrypLE的活性。
注意：与TrypLE不同，其他解离试剂可能需要用含有血清的介质进行中和。
10.轻轻地倒这内容的这烧瓶（IE，细胞在解决方案）进入二 50 毫升管。
11.离心机这管在 500×克为了 10分钟在 4 ° C 。
12.小心消除这上清液从这管和结合这颗粒进入 A 单身的管子通过增加 5 新鲜毫升_ 媒体到一的这管, 重新悬浮这细胞，和转移这细胞悬浮状态到这第二管子和这细胞颗粒。
13.彻底重新暂停这细胞。
14.μL细胞悬浮液和 90 μL XSFM 添加到微量离心管中，执行并记录细胞计数 #3（“收获细胞计数”）。
笔记：给定一个预期的高的数字的细胞，它被推荐到履行细胞计数与 A 稀释的这细胞暂停到获得一个准确的细胞数数那是之内这范围的这仪器能力。制作当然到因素这稀释进入这最终的细胞数数。
15.吸收稀释的采样到 Via-1 盒和加载它进入这核oC计数器。
16.记录这细胞数数和直径。
17.保持这细胞在媒体在房间温度（室温）直到这菲尼亚系统是准备好。
注意：建议在Finia系统准备好进行处理后立即准备细胞，以尽量减少细胞在 RT 下的保存时间。

C.细胞制备（新鲜细胞、PBMC）

1.带PBS 钙2+ , 镁2+ 免费、 hPL和Lymphoprep 到 RT。
2.带来这离心机到 RT 经过交换离开这冷却功能和消除这制动经过环境这减速到 0。
笔记：去除这制动是必要的为了密度分离。
3.准备 100 mL 稀释缓冲液（参见配方）。
4.转移这内容的这十分之一 leukopak成 50毫升锥管子。
注：体积是之间 10 和 30 毫升为了十分之一白细胞介素。
5.记录这全部的体积和添加 2× 体积的稀释缓冲（IE， 7毫升白细胞介素 + 14 毫升稀释缓冲 = 21毫升全部的体积）。
6.履行和记录细胞数数 #1（“分离前细胞数数”）经过添加 10微升的细胞暂停和 90 微升的解冻缓冲到 A 微量离心机管子。
笔记：给定一个预期的高的数字的细胞，它是受到推崇的到履行细胞数数和 A 稀释的这细胞暂停到获得一个准确的细胞数数那是之内这范围的这仪器能力。制作当然到因素这稀释进入这最终的细胞数数。
7.准备 A 50 毫升管子和一个平等的体积的淋巴制备到这全部的体积的稀血准备。
8.小心层这稀血准备超过这淋巴制备经过保持管子在 A 45 °角和慢慢地添加这血大约一个英寸多于这淋巴制备使用 A 1,000 微升微量移液器带小费（看数字 1A）。

数字 1. 图片的白细胞介素加工前（A）和后分离 (二) 使用淋巴制备经过密度离心到隔离外周血单个核细胞（ PBMC）
9.离心机这管子在 800×克为了 20分钟与制动离开和温度放至RT。
10.小心消除和丢弃这上等离子体层。
11.收集这血沉棕黄外套含有这外周血单个核细胞在 A 50 毫升管（见图 1B）。
12.添加 10 毫升稀释缓冲到这管子到洗这 PBMC。
13.离心机在 300×克为了 5 分钟在 4 ℃ 和制动在经过环境减速到 9.
14.转移这上清液到一个新的管子并添加 10 稀释缓冲液的毫升数到洗。
15.保持并设置在旁边细胞颗粒。
16.将装有上清液的管在 4 °C下以 300× g离心 5 分钟，以回收剩余的细胞。
17.除去上清液，将两次离心的细胞沉淀合并为一个，向其中一根管中添加 5 mL 至 10 mL 稀释缓冲液，重新悬浮细胞，然后将悬浮液中的细胞转移到带有细胞沉淀的第二根管中。
18.执行计数#2（“分离后细胞计数”）。取 10 μL细胞悬液样品并在微量离心管中按 1:10 稀释。
19.将稀释后的样品装入 Via-1-Cassette 中，并将其装入Nucle oC计数器中。
20.记录这细胞数数和直径。
21.保持这细胞在稀释缓冲在 RT 直到这菲尼亚系统准备好了。

D.Finia系统的准备

1.日志进入这细胞加工应用（注册会计师）软件，和在下面配置设备（见图2），创建 A 风俗协议到放向上这材料，产品包，和质量控制包体积目标和温度放观点。节省这协议。

数字 2. 细胞处理应用图片 Finia系统中的注册会计师 (CPA)

笔记：
a.这温度已选择为了间充质干细胞和外周血单个核细胞曾是 8 ℃ 。温度设置将要影响_ 全部的过程时间。为了例子，环境这温度的这协议到 8 ℃ 将要减少时间_ 与设置相比到 4 ℃ 。
b.为了这菲尼亚 50 管组，这产品包保持 10 – 28 mL 和这质量控制包持有 10 –4 0 毫升，所以最大产品体积是 124 毫升 + 6 毫升（保留在管道中）。为了这菲尼亚 250 管道放，这产品包抓住 29 – 70 毫升，这质量控制包持有 10 – 40 毫升，和这最大限度产品体积是 250 毫升 + 6毫升（保留在管），包括这质量控制体积。
2.点击配置材料和定义材料 ID 和具体的重力的每个材料。触碰节省。
3.创造条形码为了每个材料。
笔记：它是重要的到确保这材料 ID 在这条码火柴这材料 ID 在这注册会计师。条形码是已创建使用这下列的架构：为了材料1 （细胞）： [材料ID]|[材料批编号]|批次 ID，例如， MSC|20230207|批次ID。为了材料 2 （解决方案）： [材料类型]|[ Lot_ID ], 例如， CS10|批次 123. 记住到创造 A 独特的批 ID 为了每个实验到是有能力的到恢复这数据已存储在这注册会计师。 “批次ID ” 是用过的经过这系统到确认那材料批 ID 作为批次 ID 为了程序报告在注册会计师。
4.可选地，标记这无菌的 PVC 部分的这转移包每一个 3 英寸从它是开幕与一个标记到援助在焊接的这转移包到这管道放。
笔记：到确保你有充足的长度的管道，管子焊接在间隔的 3 英寸是受到推崇的。
5.转动在这焊机。
笔记：它将要拿 5分钟为了这焊机热身。
6.转动在这菲尼亚设备和日志在到这系统。触碰开始程序到进步到协议选择屏幕。
笔记：如果这设备曾是之前在，转动这设备离开为了 60 s 和然后力量它后退在。这设备收到配置和材料更新从这注册会计师每个时间它是供电的在和这用户日志在。
7.这列表的风俗协议是显示。触碰这协议那曾是已创建到使用为了步骤_ 和然后触碰确认。
8.查看这功能的这加载传感器经过第一的检查这 0克环境。和不重量在负载传感器，触碰查看 0 G 。
9.地方这 500克测试重量在这加载传感器。一次考试重量是在休息，触碰检查500克。
10.去除测试重量从这负载传感器并关闭门。
11.这风俗协议价值观为了材料，体积，和质量控制包目标和温度放点出现在这屏幕。目视确认价值和触摸确认。
笔记：
a.这步指的是到 A 协议生成的经过下列的步 D1 。
b.到改变目标或者温度设定观点，触碰任何场地在屏幕和输入新的价值观。触碰下一个到进步到这下一个屏幕。继续直到这程序目标是正确的并且触碰确认。
12.扫描这条码的这管道放和地方这混合包在这加载传感器。
笔记：擦拭这盘子在后面这混合包到消除任何缩合那可能原因这混合包到戳到这盘子。
13.连接全部管道通过这泵，管道持有者，和体液传感器，和关闭这泵盖子。
14.滑动这产品包和质量控制包进入这包持有者和加载这包线进入这阀门。拉_ 包排队通过阀门直到港口触及底部的这滑动支架（见图 3）。

图3. Finia填充和完成系统。 A. Finia系统在设备歧管下方具有通用用户界面和条形码扫描仪。 B. Finia系统设置与 FINIA 50 管道套件。

E.将细胞分装到袋子中并开始Finia程序

1.使用这收获细胞数数（间充质干细胞）或者分居后细胞数数 (PBMC) 到计算这数量的冷冻储存器 CS-10 必需的。
笔记：对于间充质干细胞来说，总数体积放置进入转让包曾是 30 毫升（10 毫升产品包 + 10 毫升质量控制包 + 6 毫升管道 + 15% 额外的）。为了外周血单个核细胞，这全部的体积曾是 41 毫升（20 毫升产品包+ 10 毫升质量控制包 + 6 毫升油管+ 15% 额外的。）确认那转移包（材料）含有足够的体积为了这菲尼亚系统到准备在这混合包。
2.打印冷冻标签和捐赠者信息，细胞专注，操作员缩写，日期，和任何额外的信息想要的（例如， PDL/段落#)。
3.取回这管子含有这细胞从步 B17 或者 C21。
4.离心机这细胞到获得这细胞颗粒。
笔记：离心为了间充质干细胞曾是 500× G 5个分钟和为了外周血单个核细胞曾是 300×克为了 5 分钟。
5.消除这上清液没有令人不安的这细胞颗粒。
6.添加一个适量的低温器 CS-10 到细胞颗粒在一个想要的细胞专注。
笔记：
a.记录这期间为了哪个这细胞是裸露到这冷冻保存解决方案。履行这下列的程序迅速地到最小化这期间为了哪个细胞是在冷冻保存解决方案，因为冷冻保存解决方案包含化学品那可能妥协细胞活力。
b.菲尼亚酒店系统是设计的到添加冷冻保护剂解决方案到 A 细胞暂停。
7.准备这转移包经过穿刺这样本港口和这长钉（在这转移包）到打开它和发布压力。
8.彻底重新暂停细胞和转移他们_ 变成一个注射器与 18 号针。
9.位于这针在这样本港口并填充这包和这细胞暂停。
10.插头这样品口和尖峰和捻它直到紧的到安全关闭样品端口。
11.使用这 T型密封件移动的到海豹这管道关闭经过这样本端口。这树叶这管道可用的为了焊接到这管道放。
12.地方这转移包在这钩外部这菲尼亚系统。
13.连接这转移包到这菲尼亚一次性的放经过放置这结束的这管道进入这焊接设备。
笔记：这转移包线能是焊接的仅有的到这供应线/PVC 部分的这菲尼亚一次性的放。
14.关闭这焊机和开始这焊接过程。
15.打开这焊机和打开这焊接。
16.扫描这条码为了这材料和触碰确认。
17.确认那这焊接从这转移包到这一次性的放是打开和触碰继续开始_ 这菲尼亚程序。
笔记：这菲尼亚系统混合和冷却这细胞暂停到这温度放观点。这系统泵三丸细胞暂停进入混合包，每个之后丸称重这包和报告这测量。然后，这系统启动每个产品包和细胞暂停前提取全部空气从这产品包。一次这产品包是填充，这包是自动地密封和这菲尼亚过程是完全的。
18.小心消除这产品包和质量控制包分别地经过拉向下这管道在顶端每个_ 包。消除和过程全部产品包前去除任何其他材料从系统。后这包有到过删除, 触碰确认在这屏幕到店铺全部细节过程的在这注册会计师。
19.在平衡计分卡，打开这质量控制包和等分试样这内容进入冷冻管为了下游分析细胞。
笔记：空气不是已删除从质量控制包。这的内容这质量控制包之前可以分析或者后冷冻保存。
20.在这菲尼亚设备，选择看法程序概括到看法这程序细节在这屏幕。
21.消除这休息的这一次性的放从这系统。
22.使用这批次编号到取回这批报告从这注册会计师。

F.细胞冷冻保存

1.标签和地方这产品包进入这不锈钢罐。
2.地方这罐子进入这可调节的冷冻架子。
3.标签和地方质量控制冷冻管在管子架子。
4.履行冷冻运营使用这控制速率冰箱放到 A 想要的冷冻程序。
注意： CryoMed程序以 1 °C/分钟的冷冻速率从 4 冷却到 -40 °C，然后以每分钟 10 °C 的冷却速率冷却，直到达到 -90 °C 最终温度。
5.转移这罐子到这随同框架。
6.转移这质量控制冷冻管进入贮存盒子和地方他们在这贮存架子。
7.店铺这框架和架子进入这液氮2 汽阶段保持在 -140 ℃ 到 -180 ℃ 。

G.通过流式细胞术进行细胞表型分析

1.跟随脚步 A1–A18 解冻和记录前和旋转后细胞计数间充质干细胞和外周血单个核细胞。
笔记： XSFM + 1% 压力/压力曾是用过的到解冻间充质干细胞或者 PBMC。
2.每孔1 × 10 5 个细胞添加到 96 孔 V 形底中板[四技术的重复每样品和荧光减一 (FMO) 控制样品]。
3.离心机这盘子在 500×克为了 5 分钟和醒酒这上清液。
4.重新暂停这细胞颗粒在 100 µL活力_ 弄脏解决方案（看食谱）或者公共广播公司为了控制（僵尸FMO 和未染色的控制样品）。
5.孵化 15 分钟在 RT 在这黑暗的。
6.履行 A 洗经过重新悬浮这细胞在 150 μL FC _ 缓冲（看食谱）。
7.离心机这盘子在 500×克为了 5 分钟和醒酒这上清液。
8.为了外周血单核细胞染色仅有的，添加 50 µL Fc _ 堵塞解决方案（看食谱）每出色地到全部井并孵育5 _ 分钟在 RT 在黑暗中。
9.重新暂停细胞颗粒在表面标记弄脏混合物（见表1）或者 FMO 混合物用于控制和孵化 20 分钟在 4 ℃ 在黑暗。

表 1. 细胞表型组的抗体信息
表面标记稀释
（在FC 缓冲）共轭小贩目录 #克隆激发（纳米）发射（纳米）
人PBMC组抗体CD31:100AF700生物传奇317340OKT3第638章719
CD141:100聚乙烯醇生物传奇325606HCD14第561章第576章
CD161:100PerCP-Cy5.5生物传奇3020283G8第488章第679章
CD191:100PE- Cy7生物传奇302216HIB19第561章780
CD561:100APC生物传奇3625045.1H11第638章660
HLA- DR1:100异硫氰酸荧光素生物传奇327006液氮3第488章第517章
人类间充质干细胞抗体组CD141:100PE- Cy7生物传奇36711263D3第561章780
CD191:100APC- Cy7生物传奇302218HIB19650第785章
CD341:100异硫氰酸荧光素生物传奇343504第581章第488章第517章
CD451:100APC生物传奇304012H130第638章660
CD731:100聚乙烯醇生物传奇344004AD2第561章第576章
CD901:100PerCPCy5.5生物传奇3281185E10第488章第679章
CD1051:100BV605BD生物科学公司562664266405第421章
HLA- DR1:100BV421生物传奇307636L243405605

10.离心机这盘子在 500×克为了 5 分钟和醒酒这上清液。
11.全部重新暂停细胞颗粒在 BD 细胞固定剂固定 b提供。
12.孵化为了 15 分钟在 4 ℃ 在里面黑暗的。
13.离心机这盘子在 500×克为了 5 分钟和醒酒这上清液。
14.重新暂停全部细胞颗粒在这 FC 缓冲和然后履行数据收购于流量具有适当设置和设计面板补偿的细胞仪。

数据分析

细胞“冷冻保存前”（ Finia程序后，即冷冻保存前的 MSC 和分离的 PBMC）和“冷冻保存后”（ Finia程序后，即冷冻保存的 MSC 和 PBMC 解冻后）的表型分析通过流式细胞术。表 1 中列出的表达表面标记物的细胞百分比按照对 > 10K 获得事件的前向和侧向散射 > 单峰 > 活细胞（僵尸 UV 活/死区分）的初始门控策略进行了分析。 MSC 的表型分析显示冷冻保存前和冷冻保存后细胞的表面标志物表达相当。结果显示标记物 CD73、CD90 和 CD105 阳性表达（>95%），标记物 CD14、CD19、CD34、CD45 和 HLA-DR 阴性表达（<5%）。对于 PBMC，CD3（冷冻保存前为 34.0%，冷冻保存后为 33.0%）和 CD56（冷冻保存前为 16.3%，冷冻保存后为 16.9%）的表面标志物表达具有可比性（图 4A 和 4C）。相反，结果显示，冷冻保存前和冷冻后的 PBMC 之间存在与 CD14 表面标志物表达相关的显着差异（冷冻保存前为 24.2%，冷冻后为 44.2%；P < 0.01）、CD16（冷冻前和冷冻后为 25.7%）。冷冻保存后为 30.8%；P < 0.05）、CD19（冷冻保存前为 13.6%，冷冻保存后为 17.1%；P < 0.05）和 HLA-DR（冷冻保存前为 46.9%，冷冻后为 56.7%； P < 0.05）（图 4B 和 4D）。表达 CD14、CD16、CD19 和 HLA-DR 的细胞群在冷冻保存后富集，这表明表面标志物表达的变化与冷冻保存直接相关，或者冷冻保存后 PBMC 内所有细胞类型的不完全恢复，其中细胞损失并不明显。由所使用的表型小组捕获。总体而言，冷冻保存后的细胞与新鲜细胞（冷冻保存前）一样保持表面标记表达。使用Finia系统和可控速率冷冻机可以维持贴壁细胞和悬浮细胞培养的细胞的表面标记表达。该工艺可以产生高质量的细胞，以确保细胞生产的成功。

图 4. 冷冻保存前后表型的流式细胞术分析结果。间充质基质细胞 (MSC) (A) 和外周血单核细胞 (PBMC) (B) 表面标志物表达的定量比较。 MSC 的代表性直方图 (C) 和 PBMC (D)，显示基于 FMO 应用于每个表面标记的正门控制。使用配对 t 检验对冷冻保存前和冷冻后的样品进行统计比较。 *，P<0.05； **，P<0.01； ***P < 0.001。

验证的协议

这协议优惠一个健壮的和可重现的工作流程为了这加工和冷冻保存的坚持和暂停细胞，哪个曾是证明了和间充质干细胞和 PBMC。这下列的结果是假如作为验证的这协议执行的在这不同的细胞类型到比较可测量的参数代表质量_ 的这细胞产品前和后冷冻保存（表 2 和 3）。此外，例子的预期的结果生成的从这注册会计师的这菲尼亚系统为了每个细胞类型是显示（表 4 和 5）。

桌子 2. 验证结果为了间充质干细胞
样本细胞/毫升可行性 (%)直径（微米） _全部的细胞 (× 10 6 )
样品1
新鲜的细胞在收成（预冻存）6.39×10 598.314.719.1（在 30 毫升）
解冻细胞预旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）6.91×10 596.015.413.8（在 20 毫升）
解冻细胞后旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）6.67×10 593.615.413.3（在 20 毫升）
旋转后解冻的细胞（产品袋；冷冻保存后）5.65×10 590.415.85.65（10毫升中）
样本 2
新鲜的细胞在收成（预冻存）1.02×10 693.915.730.6（在 30 毫升）
解冻细胞预旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）1.16×10 692.416.324.4 (21 毫升）
解冻细胞后旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）1.14×10 690.816.123.9（在 21 毫升）

桌子 3. 验证结果为了外周血单个核细胞
样本：外周血单个核细胞细胞/毫升可行性 (%)直径（微米） _全部的细胞 (× 10 6 )
新鲜的细胞在收成（预冻存）3.36×10 699.09.9137.8 （在 41毫升）
解冻细胞预旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）2.99×10 697.110.0101.7 （在 34毫升）
解冻细胞后旋转（质量控制小瓶；冷冻保存后）2.6×10 696.79.988.4（在 34 毫升）

在概括：
1.两个都 MSC 运行结果在 >90% 生存力的这解冻细胞冷冻保存后和相似的细胞计数。
2.这菲尼亚系统允许为了超龄在这质量控制包。事先的到密封，这系统泵在全部残余量从这混合包到这质量控制包。
3.在两个都案例，这菲尼亚系统跑步曾是 10 分钟从连接这转移包到这结尾的填充物程序。

桌子 4. 示例的由于。。。导致的结果这菲尼亚设备跑步报告为了间充质干细胞
样本计划（注册会计师协议）实际的（注册会计师报告）
全部的体积为了细胞暂停在低温器 CS1026毫升26毫升
包 1 MSC 产品10毫升9.9
质量控制包10毫升11.8
剩余的体积在管道6毫升-
总结束产品（包括质量控制小瓶）20毫升21.7
笔记：确认那转移包（材料）包含足够的音量为了这菲尼亚系统准备这混合包。

桌子 5. 示例的由于。。。导致的结果这菲尼亚设备跑步报告为了外周血单个核细胞
样本：外周血单个核细胞计划（注册会计师协议）实际的（注册会计师报告）
全部的体积为了细胞暂停在低温器 CS1036毫升35.1毫升
包 1 产品20毫升19.8
质量控制包10毫升14.3
剩余的体积在管道6毫升-
总结束产品（包括质量控制小瓶）30毫升34.1毫升
笔记：确认那转移包（材料）包含足够的体积为了这菲尼亚系统准备这混合袋。
在概括：
1.这可行性的这解冻细胞冷冻保存后曾是 >90% 和一些细胞损失从离心。
2.这菲尼亚系统跑步曾是 10 分钟从连接这转移包到这结尾的这填充程序。

一般的笔记和故障排除

一般的笔记

1.最佳的解冻解决方案（例如，媒体），时间，和离心速度需要经过考虑的和可能是细胞特定类型为了解冻冷冻保存的细胞。
2.自动化细胞柜台和手动的数数方法可能结果在差异到细胞计数和可行性评估。选择这合适的细胞数数方法，仪器，以及相关的范围的检测需要考虑，可能是细胞特定类型什么时候获得细胞计数和可行性测量。
3.选择的文化媒体，基于酶的消化解决方案分离的细胞，增殖费率，和文化状况和持续时间是细胞类型特定。
4.什么时候估计合流的依附者细胞有文化的在超级烧瓶文化船只、观察这最底层层假设一个甚至分配之中十个层。
5.A 密度坡度离心程序是通常已关注为了这隔离的外周血单个核细胞从 A 白细胞介素或者血浆分离术衍生的产品。考虑的密度坡度解决方案，温度，和离心时间和条件是必要的获得 A 充足的血沉棕黄外套包括的 PBMC。
6.保留两个都这颗粒和这上清液从这第一的洗后淋巴制备分离是重要的，作为一些外周血单个核细胞将要保持在里面上清液。
7.这注册会计师能是调整过的为了这数字材料的用过的（IE，细胞暂停仅有的或细胞暂停加冷冻保存解决方案），这体积的每个材料，这温度，和这想要的结尾产品体积在每个包。这具体的重力信息是重要的，作为那是用过的经过这菲尼亚系统到决定这体积在这包。为了外周血单个核细胞 (1.077) 和间充质干细胞 (1.056 – 1.075) 和低温器 CS10 （1.065 – 1.069）， A 具体的重力的 1.07 克/毫升在 RT 曾是用过的。
8.这质量控制包确实不是有空气移动，和允许的体积范围在这质量控制包是 10–40 毫升。
9.一个数量等于15% 的这的体积细胞加冷冻保存解决方案加入到这转移包到帐户为了死的体积在这转移包。材料左边在这转移包（不是泵送的进入这菲尼亚系统）是不是记录的在这菲尼亚跑步报告。如果一个警报是触发的到期的至不足体积存在画从这转移包，它是通常必要的到转移这包内容到 A 新的转移装袋并开始这过程再次。
10.开始这焊接过程仅有的什么时候指导的经过这菲尼亚系统。焊接事先的到加载中这一次性的设置可以原因无意的流动的材料出去的这转移包和扳机警报。
11.措施这高度的这第一的罐插入在这框架确定如果这包会坐在这液体或者气相的液氮2。如果需要，添加平台立管举起这框架。
12.作为描述多于，菲尼亚有 A 用户可配置灵活的协议选项。在这程序，这作者已利用 A 手动的方法的冷冻保护剂添加事先的到加载中进入这混合包。这菲尼亚系统是设计的到混合向上到三材料和能自动地添加 A 冷冻保护剂解决方案到 A 细胞暂停如果想要的。这系统允许用户到建立通知旗帜到监视器这数量时间的这细胞暂停有到过接触和这冷冻保护剂解决方案。

故障排除

1.菲尼亚酒店系统必须是重新启动到收到 A 新的协议配置自这注册会计师。
2.卸货前到结束这运行应该是避免并且只能用作 A 最后的度假村, 作为这需要这所有的过程开始超过， IE，消除，重新计算基于在这丢失的体积在这线，和开始再次。
3.菲尼亚程序能是执行的在一个离线模式如果这系统失去联系到这网络。这菲尼亚系统将要发送 A 跑步报告一次它重新建立联系。这设备可能需要到是重新启动到发送运行_ 报告。更新自这注册会计师（例如，协议，用户）不能被添加到这菲尼亚设备当。。。的时候系统是离线。
4.总是履行一种行为前报告那一个行动有到过采取, 作为这确认将扳机这下一个步在这过程，以及你不能去回到这以前的屏幕。

当前良好实验室规范 ( cGLP )的考虑因素
葡萄糖醛酸酶是 A 放的标准和指导方针那确保这质量和可靠性的非临床实验室学习（塔伦科， 2023）。这 FDA的代码的联邦法规 (21 病死率 58）轮廓 GLP，哪个包括考虑因素为了组织和人员，测试设施手术，和测试和控制文章。这方法执行的之内这手稿坚持到这些葡萄糖醛酸酶指导方针。之内我们的设施，人员是训练有素的在穿宁合适的个人防护装备（发网，安全眼镜，脸面具，袍，鞋盖子，和手套）和无菌的技术是练习过，作为和全部细胞文化学习，到确保这正确的准备的细胞在 A 无菌的环境（西迪基， 2017）。沿着和这创建和坚持到标准操作程序，试剂和解决方案是适当地贴上标签到是在按照和葡萄糖醛酸酶指导方针。全部填充-完成工作曾是携带的出去在干净的房间空间有能力的的支持打开和关闭制造业流程为了阶段我好的制造业实践评估。环境的监控的无法生存的和可行的粒子计数有保证那这些计数留下来根据规定限制。为了冷冻保存的样品，每个容器曾是贴上标签和缩写，代码/批次数字，和过期日期和曾是适当地处理过和存储。全部样品之内这学习是条形码到区分每个批填充和这菲尼亚系统。一次这系统有完全的 A 跑步，这包是集和跑步通过 A 控制速率冷冻程序为了恰当的处理和贮存的这样品。经过下列的这良好实验室规范考虑因素，我们的实验室有保证这可靠性，再现性，和质量这数据生成的。

当前良好生产规范 (cGMP) 的注意事项
环鸟苷酸是 A 放的质量管理原则和指导方针那管辖生产、分销、和供应的 A 健康产品（古韦亚等等，2015）。世界健康组织（WHO）定义质量指标为了生产和质量控制（世界健康组织， 2023）。注意事项和钥匙方面的良好生产规范包括质量管理，设施和设备，人员，生的材料，过程控制，验证和资质、和文档。这美国食品药品监督管理局轮廓这良好生产规范指导方针之内这代码的联邦法规（21 美国联邦法规 211）。那里是五个P 的良好生产规范：人、产品、过程、程序和前提（塔伦科， 2023）。人员是完全训练有素的在他们的角色和职责和全部产品有清除规格在每一个阶段的生产。全部产品必须经历测试和质量保证前存在分散式到顾客 s。这菲尼亚系统和这受控速度冰箱能是经营的在良好实验室规范空间这样的那潜在的环鸟苷酸应用可被执行。

致谢

这学习曾是支持的经过这比利和伯尼马库斯基金会和辉茂血和细胞技术。

利益争夺

作者 ARH 和 SLG 隶属于 Terumo Blood Cell and Technologies。

道德考虑因素

不人类科目是用过的为了任何实验包括在这学习。全部程序使用间充质干细胞衍生的从脐带组织提供的经过合作者在公爵大学是在按照和这道德的标准和得到正式认可的经过这伦理委员会的这制度性的审查板在乔治亚州研究所的技术和公爵大学（IRB 协议不。 H17348）。

参考

Algorri , M.、Abernathy, MJ、Cauchon, NS、Christian, TR、Lamm, CF 和 Moore, CM (2022)。重新设想制药制造业：增加敏捷为了全球的病人使用权。 J.Pharm。科学。 111（3）：593-607。
Bunnell, B.、 Flaat , M.、Gagliardi, C.、Patel, B. 和 Ripoll, C. (2008)。脂肪来源干细胞：隔离，扩张和差异化。方法45(2)：115-120。
Cuesta-Gomez, N.、Verhoeff, K.、 Dadheech , N.、Dang, T.、Jasra, IT、de Leon, MB、Pawlick, R.、Marfil-Garza, B.、Anwar, P.、 Razavy , H.，等人。（2023）。暂停文化改善诱导多能干细胞扩张和多能性表型。干细胞研究。瑟尔。 14(1)：e1186/s13287-023-03382-9。
Cunningham, AW、Jones, M.、Frank, N.、Sethi, D. 和 Miller, MM (2022)。茎状记忆时间细胞是生成的期间空洞的纤维基于灌注的扩张和丰富的后冷冻保存在一个自动化的模块化的细胞治疗制造业过程。细胞疗法24(11)：1148–1157。
Sethi, D. 和 Cunningham, A. (2020)。去风险化这最终的公式，充满和结束步在细胞治疗制造业：考虑因素为了一个自动化的解决方案。细胞和基因治疗见解6(10)：1513–1519。
Sethi, D. 和 Cunningham, A. (2021)。是你精加工强的在细胞治疗制造业？应对你的最终的充满和结束挑战和自动化。细胞和基因治疗见解7(9)：1163–1171。
Galipeau, J. 和Sensébé , L. (2018)。间充质基质细胞：临床挑战和治疗性机会。细胞干细胞22(6)：824–833。
Gouveia, BG、Rijo, P.、Gonçalo, T. S.和Reis，CP (2015)。好的制造业实践为了药用的产品为了人类使用。 J.Pharm。生物联合科学。 7（2）：87-96。
Li, R.、Johnson, R.、Yu, G.、Mckenna, DH 和 Hubel, A. (2019)。保存的基于细胞的免疫疗法为了临床试验。细胞疗法21(9): 943–957。
Meneghel , J.、Kilbride, P. 和 Morris, GJ (2020)。冷冻保存作为 A 钥匙元素在这成功的送货的基于细胞的疗法——A 审查。正面。医学。 7：e592242。
默滕，OW (2015)。进展在细胞文化：锚地依赖性。菲洛斯.跨。 R.苏克。伦敦。 B 生物。科学。 370(1661):20140040。
小山K.、堀Y.、永井Y.、宫川N.、三村K.、平林T.、井上K.i.、须原T. 、高田M. 、樋口M. . , 等人 , 等人（2021）。灵长类动物前额叶-皮层下工作记忆和决策通路的化学遗传学解剖。科学。副词。 7(26)：eabg4246。
Palen, K.、Zurko, J.、Johnson, BD、Hari, P. 和 Shah, NN (2021)。制造业嵌合体抗原受体时间细胞从冷冻保存周边血细胞：时间为了 A 收集并冷冻模型？。细胞疗法23(11)：985–990。
Pigeau , GM、Csaszar, E. 和 Dulgar-Tulloch, A. (2018)。商业的规模制造业的同种异体细胞治疗。正面。医学。 5：e00233。
西迪奎，S.（2017）。这基本的概念的微生物学。真菌生物学。：1-15。
塔伦科_ J. （ 2023）。好的制造业做法：什么你需要到知道。可用的： https://safetyculture.com/topics/gmp/
van der Walle, C.、Godbert, S.、Saito, G. 和 Azhari, Z. (2021)。自体 T 细胞药物产品的配方注意事项。药剂学13(8)：1317。
世界卫生组织。（2023）。制定人体细胞和组织以及先进治疗药品监管框架的考虑因素，附件 3，TRS 1048。可用：https://www.who.int/publications/m/item/considerations-in-developmenting-a-人类细胞和组织以及高级治疗药物产品监管框架--annex-3--trs-1048