材料与试剂

生物材料

猕猴（5.7公斤；实验开始时年龄=6.0岁；由日本文部科学省国家生物资源项目“日本猴”提供）
腺相关病毒载体（例如，AAV2.1-hSyn-hM4Di-IRES-AcGFP，由日本京都大学高田实验室提供）

试剂

盐酸氯胺酮（第一三共化学制药，产品名：肌肉注射用 Ketalar 500 mg）
盐酸赛拉嗪（拜耳，产品名：Seraktar 或 Rompun）
头孢美唑钠（Alfresa Pharma，产品名称：肌注头孢美他松 0.5 g）
酮洛芬（Kissei Pharmaceutical，产品名：肌内注射用 Capisten 50 mg）
含肾上腺素的 2% 利多卡因溶液（Sandoz KK，产品名：含肾上腺素的 2% Xylocaine 注射液）
利多卡因喷雾剂（Sandoz KK，产品名称：Xylocaine 泵喷雾剂 8%）
灭菌盐水（大冢制药，目录号：1326）
聚维酮碘溶液（明治精化制药，产品名：聚维酮碘10%）
异丙酚（Nichi-Iko，产品名称：异丙酚1%静脉注射液）
甘露醇（Yoshindo，商品名：甘露醇注射液）
硫酸阿托品（Nipro，产品名：硫酸阿托品水合物 0.5 mg/mL）
异氟烷[Mylan，产品名：异氟烷吸入溶液（辉瑞公司）]
输液（Terumo，目录号：TP-AB05NR）
骨蜡（TOKYO MI，目录号：J901）
乳酸钠林格氏液（Terumo，产品名：Soluact 输液）
灭菌蒸馏水（大冢制药，目录号：1323）

实验室用品

气管插管（Fuji Systems，目录号：FR-26）
IV导管（Terumo，目录号：SR-FF2419）
25G针（Terumo，目录号：NN-2525R）
手术胶带（Nichiban，目录号：21N）
手术棉（Hakujuji，目录号：11371）
用于心电图的一次性电极（Nihon Kohden，目录号：M-150）
1 mL注射器（Terumo，目录号：SS-01T）
50 mL注射器（Terumo，目录号：5SS-50ESZ）
阀门注射器（Eastsidemed，目录号：ES-17005）
微量注射器（Hamilton，型号：1701RN 直连2英寸PT3型30G针头）
脱毛膏（Center Shoji，商品名：Fi-i-mo Epi DX Plus）
解剖刀
1. 11号（Akiyama Medical MFG，目录号：FS11）
2. 21号（Akiyama Medical MFG，目录号：FS21）
用针缝合
1. Vicryl Plus 3-0（Ethicon，目录号：VCP460H）
2. Vicryl Plus 5-0（Ethicon，目录号：VCP303H）
3. Monosof 2-0（COVIDIEN，目录号：SN-628）
输液管（Terumo，目录号：TK-U200L）
无菌礼服（Nissho Sangyo，目录号：24503）
无菌手套
1. Overglove（Mölnlycke Health Care，目录号：42175）
2. 内衣（Mölnlycke Health Care，目录号：41670）
无菌手术单
1. 1,200 mm × 1,200 mm，无孔（Nissho Sangyo，目录号：23203）
2. 900 mm × 900 mm，带孔和胶带（Nissho Sangyo，目录号：23265）
3. Ioban 抗菌切割手术巾（3M，目录号：6661EZ）
无菌手术标记（Muranaka Medical Instruments，目录号：2730PBX）
无菌纱布（Hakujuji，目录号：14824）
弗里尔电梯（Roboz，目录号：RS-8820）
Ruskin 咬骨钳（生物医学研究仪器，目录号：46-1655）
Knapp 剪刀（Roboz，目录号：RS-5965）
钻头
1. 金刚石圆盘，Ø 6–9 mm 圆盘（生物机械，定制）
2. 麻花钻，Ø 2 mm 尖端（Nakanishi Inc.，目录号：ES-TD-S20）

设备

MR 成像扫描仪（布鲁克，型号：7 Tesla 400 mm/SS 系统）
X 射线计算机断层扫描 (CT) 扫描仪（J. Morita，型号：3D Accuitomo170）
手术显微镜（Leica Microsystems GmbH，型号：M220）
病人监护仪（福田，型号：Bio-Scope AM140）
无影手术灯（山田，型号：CRV0404V）
呼吸机（Shin-Ei Industries, Inc.，型号：ADS 2000）
汽化器（Shin-Ei Industries, Inc.，型号：I-200）
立体定位装置（David Kopf Instruments，型号：1530）
电解水生成器（Omco，型号：NDX-70KMW）
显微操作器（David Kopf Instruments，型号：2166A）
微型注射泵（世界精密仪器公司，型号：UMP3T-1）
循环热水系统（KIMURAMED，型号：T-CARE）
手术钻控制单元（Nakanishi Inc. 型号：Primado2）

软件和数据集

PMOD（PMOD Technologies Ltd. 版本 3.6 或更高版本）

程序

使用 MR 和 CT 图像规划手术
1. MR 和 CT 扫描（一般说明 1）。
  1. 在肌内注射硫酸阿托品（0.02–0.05 毫克/千克）后 5 分钟，通过肌内（肌内）注射氯胺酮（5–10 毫克/千克）和赛拉嗪（0.2–0.5 毫克/千克）麻醉猴子，以减少唾液分泌，然后连续静脉 (iv) 输注异丙酚 (0.2–0.6 mg/kg/min)，以在扫描过程中实现稳定的麻醉。
  2. 监测动物的心率和外周氧饱和度 (SpO ₂ ) 直到动物醒来。
  3. 在用气管插管固定气道之前，将利多卡因喷入气管。
  4. 在麻醉下对猴子进行 MR 成像。
    
    注意：只要目标位置清晰可见，任何 MR 扫描协议都是可接受的。例如，我们研究所使用的扫描仪、序列和参数如下： Bruker Biospec 40 cm 口径 7T-MRI 扫描仪；三维快速低角度拍摄梯度回波序列；重复时间/回波时间 = 30/3.7 ms；翻转角=10°；空间分辨率 = 0.5 mm 各向同性；视场 = 100 × 100 × 70 mm ³；采集时间 = 6 分钟；脂肪抑制开启；带宽 = 347 Hz/Px；加速因子 = 2。
  5. 对头部进行 CT 扫描。
    
    注意：我们通常采用 CT 扫描作为将 MR 图像与立体坐标对齐的参考。典型条件如下：对于 Ø 140 mm × 100 mm，90 kV、5 mA 和 18.5 s 旋转时间。CT 图像应包括耳朵和眼眶，以便它实际上可以与立体定位坐标对齐。允许这种对准的任何其他方法（例如，具有立体定位标志的MR成像）也是可接受的。
2. 估计注射部位。
  1. 使用图像分析软件（例如 PMOD）将 MR 图像与立体坐标对齐。在我们的典型程序中，我们首先通过匹配耳孔和眶下缘（眼窝下缘）的垂直水平将 CT 图像与立体定位坐标对齐，然后将 MR 图像融合到立体定位对齐的 CT 图像（图2）。
    
    注意：任何其他允许将 MR 图像对齐到立体坐标的软件都是可以接受的。
    
    图 2. 磁共振 (MR) 图像与立体定位坐标的对齐。A. 垂直对齐耳孔（白色箭头）和眶下缘（眼窝下缘）（黄色允许）。B. 水平 (i)、冠状 (ii) 和矢状 (iii) 平面上的融合 MR 和计算机断层扫描 (CT) 图像。比例尺（大脑图像下方的白色条）：10 毫米。
  2. 根据立体定位 MR 图像验证目标区域的位置。关键：我们通常检查沟距表面的深度、距耳间线的距离以及沟的水平角（通常沿前后轴和左右半球之间变化）。然后，我们根据图像设计注射轨迹和注射点。例如，在图3的情况下，沿着主沟背侧的皮质深度（从底部到表面）大约为8毫米，并且沟的角度为35°。对于这种情况，我们沿沟设计了五个注射点（间隔为 1.5 mm），以使矢量溶液遍布整个 dlPFC（图 3，另请参见图 1）。
    
    图 3. 磁共振图像上注射点的协调。红点和黄条分别代表预期的注射点和注射轨迹。比例尺（大脑图像下方的白色条）：10 毫米。

外科手术
1. 手术准备。
  1. 在注射硫酸阿托品（0.02-0.05 毫克/千克）后，注射氯胺酮（5-10 毫克/千克）和甲苯噻嗪（0.2-0.5 毫克/千克）麻醉猴子，以减少流涎。
    
    注意：注射适当剂量的氯胺酮和甲苯噻嗪的动物在注射后10分钟内可能会被固定，并且氯胺酮和甲苯噻嗪的作用可以持续30-40分钟。因此，接下来的两个步骤应在该时间范围内完成以保持固定。
  2. 将动物移至准备室。
  3. 通过面罩使用异氟烷 (2%–3%) 进行麻醉以保持固定，直至气道安全。
  4. 去除头部周围的毛发（首先用理发器粗略地去除，然后用脱毛膏去除）。
  5. 使用 IV 导管确保右足静脉的血管通路。
  6. 在用气管插管固定气道之前，将利多卡因喷入气管。
  7. 通过安全气道使用异氟烷 (1%–3%) 开始麻醉，并在整个手术过程中维持麻醉。
    
    注意：手术可以在连续使用面罩的情况下进行。我们建议使用气管导管来保护气道，这样可以通过减少死腔来微调麻醉控制。
  8. 在整个手术过程中监测动物的心电图、SpO ₂、呼气末CO ₂、体温和呼吸频率。
    
    注意：如果出现以下情况，应立即暂停手术并采取适当措施：体温>40℃或<35℃，心率>150次/分钟或<60次/分钟，SpO 2 <95 _％，潮气末 CO ₂ > 50 mmH ₂ O 或 < 20 mmH ₂ O。
  9. 在手术期间和手术后使用循环热水系统将体温保持在 36–38 °C，直到动物醒来。
  10. 将猴头固定在立体定位仪上，检查头部是否水平。
    
    注意：耳孔和眶下缘的垂直水平应与与立体坐标对齐的 MR 图像的对齐相匹配。
  11. 固定后，闭上猴子的眼睛，并用手术棉覆盖以进行保护。
  12. 将输液管连接至血管通路，并在手术过程中静脉注射输液（乳酸钠林格氏溶液，约 10 mL/kg/h）。
  13. 预防性使用抗生素（头孢美唑钠，25-50 mg/kg，肌肉注射）。
  14. 用次氯酸盐水（使用电解水发生器产生）刷洗猴子的头部。擦干头部并用消毒剂（聚维酮碘）溶液和无菌纱布擦拭。
    
    注意：用无菌纱布清洗时，操作人员应戴无菌手套。
  15. 以下外科手术应在无菌操作条件下进行。
2. 从手术开始到开颅手术前：
  1. 穿上无菌长袍和无菌手套（内手套和外手套）。
    
    注意：流程方案中的手持式注射需要两名佩戴无菌设备的人员，一名负责握住注射器，一名负责推动柱塞。此外，还需要第三人来处理病毒载体。
  2. 在无菌窗帘上准备无菌手术器械。
  3. 用无菌手术标记标记切口线，通常从前额尖端到头部中线的人字形缝合线约 10 毫米。
  4. 用 Ioban 抗菌切割布和无菌布（900 毫米 × 900 毫米，带 90 毫米孔）覆盖猴子，头部暴露。
  5. 开始静脉注射降压剂（即15%–20%甘露醇，4 mL/kg，持续30分钟）。
    
    注：甘油也可以（推荐剂量：8 mL/kg，持续 30 分钟，静脉注射）。
  6. 沿预定切口线皮下注射含有肾上腺素的 2% 利多卡因溶液，以产生镇痛作用并防止出血。
  7. 用手术刀（21号）切开皮肤和皮下组织，用电梯剥离肌肉，露出头骨。
  8. 使用缝合线 (Vicryl Plus 3-0) 展开并固定两侧切开的皮肤和脱落的肌肉，以维持手术区域。
    
    注意：用湿纱布覆盖扩散的组织（如皮肤、皮下组织和肌肉），以在整个手术过程中保持湿润。使用阀门注射器添加盐水，保持纱布湿润。
3. 开颅手术、硬脑膜切开和病毒载体注射
  1. 用无菌手术标记标记预期颅骨提取部位的轮廓（图4）。
    
    图 4. 预期开颅部位的轮廓。从侧面（左）和顶部（右）视图显示猴子头部的预期颅骨提取部位（红色虚线）。红点表示要制作缝合孔的位置。
  2. 开颅手术。用圆盘钻切割预期区域的边缘，并使用升降机从头骨中提取骨瓣。
    
    注意：当针对两侧时，双侧宽开颅手术是可以接受的。然而，切割中线时，要非常小心，不要损伤上矢状窦。将椎间盘从垂直方向稍微倾斜，这样当骨头放回原位时，大脑就不会受到压缩。
  3. 使用拉斯金咬骨钳平滑打开的头骨的边缘（尤其是大脑侧）。
  4. 使用骨蜡止颅骨切口表面的任何出血。
  5. 用钻头在颅骨和骨瓣上打缝合孔，以便骨瓣返回到位（图 4，一般说明 2）。
    
    注意：首先钻孔，以防止钻孔过程中骨碎片进入硬脑膜下方。
  6. 用手术刀（11 号）和纳普剪刀切割硬脑膜，以便操作员可以看到大脑表面的标志，例如布罗德曼 46 区的弓形和主沟（图 5）。
    
    注意：切开的硬脑膜应移到一边（硬脑膜瓣向后折叠）以便稍后缝合。切割硬脑膜后，应特别注意用无菌盐水保持脑表面和硬脑膜湿润。
    
    图 5. 硬脑膜切口线。硬脑膜预期切口区域的插图（红色虚线）。切开硬脑膜，观察弓状沟升肢的喙尖 (as) 和主沟的尾尖 (ps)。
  7. 准备病毒载体溶液。
    
    注意：我们通常使用在通用或特定启动子控制下表达 DREADD 的腺相关病毒载体，带有标记蛋白或标签序列（例如，AAV2.1-hSyn-hM4Di-IRES-AcGFP，如我们之前的研究中使用的[ 10-12]）。有关我们最近工作中使用的高效病毒载体的更多详细信息，另请参阅[13]。
  8. 将要使用的载体溶液填充到注射器（10 μL Hamilton 注射器，带 PT3 型 30 G 针头）。
    
    注意：PT2 针头或 25 μL 微量注射器也是可以接受的。在用载体溶液填充注射器之前，先用乙醇清洗，然后用蒸馏水清洗。
  9. 执行注射。一名操作者应在手术显微镜的引导下手动握住注射器并将针头插入预定深度。然后另一名操作员推动柱塞（图 6）。关键：我们使用的针在距尖端 3 毫米和 7 毫米处进行了标记，以便我们可以轻松识别深度（图 7）。对于一个半球，在主沟周围进行九次穿透（图 8），每次穿透在不同深度（每次注射 1 μL）进行三到五次注射（另请参见图 3）。执行一次注射大约需要 2 秒。总共将 35–44 μL 载体溶液注入一个半球。
    
    注意：为避免注射器在注射过程中移动，握住注射器的手应放在立体定位架和颅骨上，并由同样放置在立体定位架上的另一只手支撑。
    
    图 6. 手持式注射。由一个人（前面）将针插入预定区域。第二个人（后面）按下柱塞以排出大约 1 µL 的溶液。注射器的角度通过目视校准为与机械手平行，机械手倾斜至龈沟的角度。
    
    图 7.带有注射标记的定制针头。箭头表示距针尖 3 毫米和 7 毫米处的标记。
    
    图 8. 注射区域。箭头表示沿主沟的注射轨迹。
4. 关闭头部。
  1. 在检查脑脊液 (CSF) 渗漏之前，用易熔缝线 (Vicryl Plus 5-0) 缝合硬脑膜。
    
    注意：缝合线应均匀间隔约 2 毫米，以防止脑脊液渗漏。如果发现脑脊液渗漏，继续缝合直至不发生渗漏。
  2. 用易熔缝线 (Vicryl Plus 3-0) 将骨瓣缝合回原位（一般说明 2）。
  3. 用易熔缝合线 (Vicryl Plus 3-0) 缝合筋膜和皮下组织，然后用尼龙缝合线 (Monosof 2-0) 缝合皮肤。
  4. 给予镇痛（酮洛芬，1-2 mg/kg，肌肉注射）。
  5. 醒来后，将猴子放回笼子里。
    
    注意：为了防止受到其他猴子的伤害，最好让猴子单独呆着，直到拆线为止。

术后程序
1. 围手术期管理
  1. 通过肌内注射预防性使用抗生素（头孢美唑钠，25-50 mg/kg/天）和止痛药（酮洛芬，1-2 mg/kg/天），持续 7 天。
  2. 皮肤愈合后（≥两周后）拆线，然后即可开始实验。

协议验证

在每项研究中，使用我们之前报道的方案，通过尸检组织学检查（图 9）证实了 DREADD 的成功表达 [7-9]。我们还通过在手术后 45 天用放射性标记的 DREADDs 配体进行正电子发射断层扫描 (PET) 扫描来证实 DREADDs 体内表达 [8, 9]。

图 9. 组织学切片。3,3'-二氨基联苯胺染色切片显示针对报告蛋白 (AcGFP) 的免疫反应性。

我们还观察到服用 DREADD 激动剂（去氯氯氮平）后对行为（即工作记忆障碍）产生强烈的化学遗传学影响 [7-9]。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

MRI 和 CT 扫描在同一天进行。根据 MRI 估计注射部位后，手术将在第二天进行（通常≥一周后）。
在颅骨和硬脑膜之间插入升降机或扁平器械，以防止在制作缝合孔和缝合恢复骨瓣时损伤硬脑膜和大脑。

致谢

这项研究得到了文部科学省 (MEXT)/日本学术振兴会 (JSPS) KAKENHI 的资助，资助号为 JP21K07268、JP22H05521（至 KO）、JP19K08138、JP23H02405（至 YN）、和 JP20H05955（转为 TM）；JST PRESTO 拨款编号 JPMJPR22S3（至 KO）；AMED 授权号 JP18dm0307007（授予 TM）。原作（Oyama 等，2021）中使用的两只日本猴由日本文部科学省的国家生物资源项目“日本猴”提供。我们感谢 Jun Kamei、Ryuji Yamaguchi、Yuichi Matsuda、Yoshio Sugii、Takashi Okauchi、Rie Yoshida、Risa Suma 和 Tomomi Kokufuta 提供的技术援助。我们还感谢 Mark AG Eldridge 和 Richard C. Saunders 为我们提供了有关手术技术的大量指导和建议。该协议改编自我们之前的作品[7-9]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有涉及动物的实验程序均按照《神经科学研究中非人类灵长类动物的护理和使用指南》（日本神经科学会；https://www.jnss.org/en/animal_primates）进行，并得到动物管理局的批准美国国家量子科学技术研究院伦理委员会。

参考

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罗斯，BL（2016）。神经科学家的恐惧。神经元89(4)：683–694。doi：10.1016/j.neuron.2016.01.040
Khateeb, K.、Griggs, DJ、Sabes, PN 和 Yazdan-Shahmorad, A. (2019)。在在线 MRI 图像的指导下，对流增强光遗传学腺相关病毒载体向恒河猴皮质的传递。J. 维斯。过期。(147)：e3791/59232-v。doi：10.3791/59232-v
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