材料与试剂

生物材料

表达氢化酶的大肠杆菌，携带hydA、hydE、hydF和hydG基因（该重组菌株是根据我们之前在 Kosem 等人 (2023) 中的报告在我们实验室构建的）。

注意：许多已发表的文章报道了氢化酶成熟过程中特定基因表达的每种蛋白质的功能，例如 Broderick 等人。（2014）和卢比茨等人。（2014）。

试剂

LB肉汤，Miller（Nacalai Tesque，目录号：20068-75）
甲基紫精（东京化成工业，目录号：D3685）
连二亚硫酸钠（Na ₂ S ₂ O ₄）（Sigma-Aldrich，目录号：71699-250G）
Pierce ^TM BCA 蛋白质检测试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23227）
氯化钠（NaCl）（Wako Chemical，目录号：191-01665）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Nacalai Tesque，目录号：35434-21）
盐酸（HCl）（Wako Chemical，目录号：080-0106）
三氯乙酸（TCA）（Nacalai Tesque，目录号：34637-14）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（Nacalai Tesque，目录号：23415-25）
氢氧化钠（NaOH）（变色龙试剂，目录号：000-75165）
氨比西林钠（Wako，目录号：014-23302）
硫酸链霉素（Wako，目录号：194-08512）
葡萄糖（Nacalai Tesque，目录号：16805-35）
柠檬酸铁铵（Nacalai Tesque，目录号：19425-12）
L-半胱氨酸（Nacalai Tesque，目录号：10309-12）
富马酸钠（TCI，目录号：F0070）
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（FujiFilm，目录号：094-05144）

解决方案

LB（Luria-Bertani）肉汤（参见食谱）
1 M MOPS-NaOH（参见配方）
100 mg/mL 氨苄青霉素钠（参见配方）
40 mg/mL 硫酸链霉素（参见配方）
50% (w/v) 葡萄糖（参见食谱）
250 mg/mL 柠檬酸铁铵（参见配方）
1 M 富马酸钠（参见食谱）
1 M IPTG（参见配方）
0.9% (w/v) 氯化钠（参见配方）
50 mM MV ²⁺ /Na ₂ S ₂ O ₄溶液（参见配方）
1 M Tris-HCl pH 7（参见配方）

食谱

LB肉汤

注意：将培养基和所有试剂溶解在 500 mL 锥形瓶中，然后在使用前在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。

试剂	最终浓度	数量
LB肉汤	2.5%（重量/体积）	5克
1 M MOPS-NaOH (pH 7.4)（配方 2）	100毫米	20毫升
水	不适用	180毫升
全部的	不适用	200毫升
高压灭菌后添加以下物质（参见配方 3-8）：
100 mg/mL 氨苄青霉素钠	100微克/毫升	0.2毫升
40 mg/mL 硫酸链霉素	40微克/毫升	0.2毫升
50% (w/v) 葡萄糖	0.5%（重量/体积）	2毫升
250 mg/mL 柠檬酸铁铵	250微克/毫升	0.2毫升
L-半胱氨酸	2毫米	50毫克
1 M 富马酸钠	20毫米	4毫升
1M IPTG	1毫米	0.2毫升

1 M MOPS-NaOH pH 7.4

注意：在磁力搅拌器上溶解在 100 mL 烧杯中。

试剂	最终浓度	数量
MOPS	1M	20.9克
水	不适用	80毫升
氢氧化钠 (8 M)	不适用	缓慢添加直至pH 7.4
全部的	不适用	将最终体积补至 100 mL

100 mg/mL 氨苄青霉素钠

注意：溶解在 5 mL 微量离心管中，用手轻轻摇动充分混合。将储备液等分到 1 mL 微量离心管（每管 500 μL）中，并储存在 -20 °C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

氨苄西林钠 100毫克/毫升 0.5克

灭菌水不适用 5毫升

全部的不适用 5毫升

40 mg/mL 硫酸链霉素

注意：溶解在 5 mL 微量离心管中，用手轻轻摇动充分混合。将储备液等分到 1 mL 微量离心管（每管 500 μL）中，并储存在 -20 °C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

硫酸链霉素 40毫克/毫升 0.2克

灭菌水不适用 5毫升

全部的不适用 5毫升

50% (w/v) 葡萄糖

注意：在磁力搅拌器上将葡萄糖粉末用温热的灭菌水溶解在 100 mL 烧杯中。一旦完全溶解，将总体积达到 100 mL。将储备溶液等分在 15 mL 管中（每管 10 mL），并储存在 -20°C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

葡萄糖 50%（重量/体积） 50克

灭菌水不适用 60毫升

全部的不适用将最终体积补至 100 mL

250 mg/mL 柠檬酸铁铵

注意：溶解在 5 mL 微量离心管中，用手轻轻摇动充分混合。将储备液等分到 1 mL 微量离心管（每管 500 μL）中，并储存在 -20 °C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

柠檬酸铁铵 250毫克/毫升 1.25克

灭菌水不适用 5毫升

全部的不适用 5毫升

1 M 富马酸钠

注意：溶解在 50 mL 管中，用手轻轻摇动充分混合。将储备溶液等分在 15 mL 管中（每管 10 mL），并储存在 -20°C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

富马酸钠 1M 8.0克

灭菌水不适用 50毫升

全部的不适用 50毫升

1M IPTG

注意：溶解在 5 mL 微量离心管中，用手轻轻摇动充分混合。将储备液等分到 1 mL 微量离心管（每管 500 μL）中，并储存在 -20 °C 直至使用。

试剂 最终浓度 数量

IPTG 1M 1.2克

灭菌水不适用 5毫升

全部的不适用 5毫升

0.9% (w/v) 氯化钠溶液

注意：在磁力搅拌器上溶解在 100 mL 烧杯中。

试剂 最终浓度 数量

氯化钠 0.9%（重量/体积） 0.9克

水不适用 100毫升

全部的不适用 100毫升

50 mM MV ²⁺ /Na ₂ S ₂ O ₄溶液

注意：在手套箱内的厌氧密封小瓶中新鲜制备，并用手轻轻摇动彻底混合。

试剂 最终浓度 数量

甲基紫精 50毫米 0.0257克

钠₂ S ₂ O ₄ 250毫米 0.0870克

水不适用 2毫升

全部的不适用 2毫升

1 M Tris-HCl pH 7

注意：在磁力搅拌器上溶解在 100 mL 烧杯中。在通风橱中用 3 M HCl 调节 pH，并严格遵循九州大学教育安全指南：实验室活动。化学公司提供的安全数据表，如支持材料中指南 1 所示。

试剂	最终浓度	数量
特里斯	1M	12.1克
水	不适用	80毫升
盐酸 (3 M)	不适用	缓慢添加直至pH 7
全部的	不适用	将最终体积补至 100 mL

实验室用品

3 号玻璃瓶，10 mL 尺寸（ASONE，目录号：5-111-03）
橡胶塞（ASONE，目录号：5-112-01）
铝盖（ASONE，目录号：5-112-03）
1 mL注射器（Terumo，目录号：SS-01T）
针号 27 G × 3/4"（Terumo，目录号：NN-2719S）
10 μL 移液器吸头（Molecular BioProducts，目录号：3510-05）
200 μL 移液器吸头（Violamo，目录号：3-6504-12）
1,000 μL 移液器吸头（Violamo，目录号：3-6504-13）
1 mL 微量离心管（Quality Scientific Plastics，目录号：L-510-GRD-Q）
5 mL 微量离心管（ASONE，型号：AST0500）
96孔板（ASONE，目录号：2-8085-02）
99.999% N ₂气体（液化空气，目录号：JAGA 13038）
手套（Showaglove，目录号：882.L.BLUE）
纸巾
一次性比色皿（Violamo，型号：UVC-Z8.5）

设备

2–20 μL 可高压灭菌微量移液器（Nichipet Ex II，Nichiryo，目录号：J16Y01961）
20–200 μL 可高压灭菌微量移液器（Nichipet Ex II，Nichiryo，目录号：J16Z00871）
100–1,000 μL 可高压灭菌微量移液器（Nichipet Ex II，Nichiryo，目录号：J16X11751）
accu-jet ^® pro 移液器控制器（BRAND ^®，目录号：Z671533）
高速微型离心机（日立，型号：CF16RN）
个人离心机（Front Lab，型号：FLD2012）
气相色谱仪（岛津制作所，型号：GC-8A）
热导检测器（岛津制作所，型号：GC-8AIT）
积分器 C-R6A chromatopac（Shimadzu Corp.，目录号：223-04500-38）
分子筛 5A 珠（GL Sciences Inc.，目录号：1001-11503）
不锈钢柱，2 m 长 × 3 mm 直径（Shimadzu Corp.，目录号：201-48705-20）
振荡水浴锅（Yamato Scientific，型号：BW101）
振荡培养箱（EYELA，型号：FYC-100）
厌氧手套箱（MIWA，型号：1ADB-3）
超净工作台（日立电器公司，型号：CCV-1300E）
酶标仪（Corona Electric，型号：SH-1000）
500 mL 带挡板锥形瓶（IWAKI，型号：CTE33）
250 mL离心瓶（Nalgene，目录号：B1033）
20 mm 样品瓶封盖器（Chromatography Research Supplies，目录号：320990）
20 毫米小瓶开盖钳（Kebby，目录号：D-20）
1 mL气密注射器（ITO Corporation，目录号：MS-GAN100）
精度为 0.0001 g 的天平（Metter Toledo，型号：XS204）
涡旋混合器（Scientific Industries，型号：SI-0286）
pH计（Horiba Scientific，型号：9625）
水蒸馏装置（Advantec，型号：RFD240NA）
磁力搅拌器（Pasorina Stirrer，型号：CT-MINI）
100 mL 烧杯（AGC Iwaki，型号：CTE33）
通风柜（东方，型号：TNV-STZ-1800HCS）

软件和数据集

微软Excel
用于分光光度计的SF6（版本 5.6.0，版权所有^© 2005 Corona Electric）

程序

氢化酶表达细菌的培养
1. 在此协议中，编码用于氢化酶表达的hydA、hydE、hydF和hydG基因的重组大肠杆菌被用作我们实验室构建的H _{2生产模型，如 Honda 等人报道。}(2016) 和 Kosem 等人。（2023）。
  
  注意：该方案可用于确定其他产生氢化酶的细菌的效率，如 Benoit 等人报道。(2020) 和 Kosem 等人。（2024）。
2. 在 500 mL 锥形瓶中对重组大肠杆菌进行需氧预培养，其中添加 200 mL LB 肉汤，辅以 100 μg/mL 氨苄青霉素钠、40 μg/mL 硫酸链霉素、0.5%（w/v）葡萄糖、250 μg/mL 柠檬酸铁铵和 100 mM MOPS/NaOH pH 7.4。将预培养瓶在 37°C 下孵育，置于振荡培养箱中，转速为 120 rpm，直至细胞密度在 OD ₆₀₀处达到 0.4 的光密度，通过分光光度计使用一次性比色皿中的 1 mL 细胞悬浮液进行监测。然后，将 200 mL 预培养的大肠杆菌悬浮液转移到厌氧手套箱内的 250 mL 离心瓶中，并补充有 2 mM L-半胱氨酸（50 mg）、20 mM 富马酸钠（4 mL 1 M 库存溶液），和 1 mM IPTG（0.2 mL 的 1 M 库存溶液），并在手套箱中进一步孵育 18 小时以进行 [FeFe]-氢化酶表达（图 2A）。
  
  图2 MV ²⁺依赖性氢化酶活性实验流程

细胞收获和制备
1. 在手套箱中，将 200 mL 在 LB 培养基中培养的细胞悬浮液从锥形瓶转移到带有硅胶盖的离心瓶中，以保持厌氧环境。
2. 将瓶子以 2,000× g离心 10 分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
3. 用 5 mL 0.9% NaCl 溶液清洗细胞沉淀一次，并以 2,000× g离心10 分钟。
4. 要准备用于实验的细胞悬浮液，请将洗涤的细胞沉淀重新悬浮在 5 mL 的 0.9% NaCl 溶液中（图 2A）。
5. 为了标准化方案，反应中使用的细胞浓度基于 Pierce ^TM BCA 蛋白测定试剂盒在 96 孔板中测量的总蛋白含量。
  
  注意：当使用不同的细菌菌株或生物样品时，可以修改该方案。

氢化酶活性测定

_{所有化学试剂使用前用纯N 2}脱气5分钟并置于厌氧手套箱中。

准备以下试剂，如表 1 和图 2B 所示。

表1. MV ^•+-氢化酶活性测定的反应混合物制备

试剂	适用体积	最终浓度
1 M Tris-HCl pH 7	0.2毫升	100毫米
10 mg/mL 细胞悬浮液或提取物的蛋白质	0.2毫升	1毫克/毫升
无菌去离子水	1.4毫升
250 mM Na ₂ S ₂ O ₄中的50 mM MV ²⁺（还原 MV ^•+溶液）	0.2毫升	5毫米
全部的	2毫升

笔记：

将反应混合物在 10 mL 玻璃瓶中制备，并在手套箱内用橡胶塞和铝盖密封。
不同样品中的蛋白质浓度可以调整。
如果是阴性对照，则添加相同体积的无菌水而不是细胞悬浮液或提取物。
减少的 MV• ⁺溶液在单独的小瓶中制备，并在手套箱内用橡胶塞和铝盖密封。

从手套箱中取出反应瓶和 MV ^•+瓶。
_{用纯 N 2}吹扫每个小瓶中的污染气体5 分钟。
^{使用针头编号为 27 G × 3/4" 的 1 mL 注射器将 0.2 mL 50 mM MV 2+} /Na ₂ S ₂ O ₄溶液添加到反应瓶中来启动反应，并进一步在摇动水浴中孵育100 rpm 和 37 °C。

^{注：将MV 2+} /Na ₂ S ₂ O ₄溶液加入反应瓶后，反应混合物变成深蓝色。
孵育后每 20 分钟，使用针头编号为 27 G × 3/4" 的 1 mL 注射器添加 0.1 mL 100% TCA（商业储备溶液的浓度）来终止反应瓶。
使用1 mL气密注射器对反应瓶顶部空间产生的1 mL H _{2进行取样，并垂直注射到气相色谱仪中进行分析。}这里，使用配备有热导检测器和积分器C-R6A chromatopac的GC-8A气相色谱仪。产生的气体通过装在不锈钢柱（长 2 m × 直径 3 mm）中的分子筛 5A 珠，载气为氩气。工作参数如表2所示。

表 2. 色谱操作参数

参数单位

载气压力，Ar 100kPa

注射量 1毫升

检测器温度 50℃

注射温度 50℃

柱温 50℃

检测器电流 60毫安

数据分析

_{H 2}的定量：

_{由反应产生的H 2}的准确量根据H ₂浓度与GC分析色谱图获得的峰面积之间的校准曲线计算（图3）。

图 3. 标准 H ₂与气相色谱峰面积的校准图。_{根据校准曲线，H 2}的量可以通过以下等式计算：H ₂ (mol) = (峰面积-截距)/斜率。
氢化酶活性的计算

(1)

其中在每个时间点测量顶部空间中的H ₂ (μmol)量(图4A)并绘图以获得H ₂生产率(图4B)。

时间（分钟或小时）是反应的孵育时间。

注：潜伏期一般需要1-2小时。_{H 2}产生速率的量以μmol/分钟表示。

C_蛋白(mg/mL) 是反应混合物中蛋白质的最终浓度。

V_反应(mL)是反应混合物的总体积。

图 4. 甲基紫精 (MV ^•+ ) 依赖性氢化酶活性测定。(A)含有反应混合物的液相和顶部空间中产生的H ₂的气相的反应瓶。(B)H ₂生产率由y轴上的H ₂量与x轴上的时间之间的动力学图计算。氢化酶活性由方程(1)计算。

协议验证

该协议已在 Kosem 等人中得到验证。（2023）。应用催化 A：一般，DOI：10.1016/j.apcata.2022.119019。

一般注意事项和故障排除

_{为了保护O 2}敏感酶的生物功能，必须保护含有氢化酶的生物样品免受空气影响。因此，细胞制备和实验的整个过程必须在厌氧环境或手套箱中进行。
根据米氏方程，通过改变作为底物的甲基紫精的浓度，可以分析来自不同生物来源的不同氢化酶的动力学参数：，其中v是速度，V _max是最大速度，K _m是米氏常数， [S] 是底物（甲基紫精）的浓度。

致谢

我要感谢 Tatsumi Ishihara 教授对我之前研究的监督，该研究最初在 Kosem 等人中验证了该协议。（2023），该项目由日本教育、文化、体育、科学技术部（MEXT）通过日本科学振兴会提供的特别促进研究补助金（编号 21K18213）资助。我还要感谢九州大学工学院应用化学系和九州大学国际碳中和能源研究所（I ² CNER）的研究设施和仪器。我感谢 Yuki Honda 博士，我从他那里改编了这个协议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Benoit, SL、Maier, RJ、Sawers, RG 和 Greening, C. (2020)。分子氢代谢：病原细菌和原生生物的广泛特征。 微生物。摩尔。生物。修订版84(1)：e00092-19。
Broderick, JB、Byer, AS、Duschene, KS、Duffus, BR、Betz, JN、Shepard, EM 和 Peters, JW (2014)。[FeFe]-氢化酶成熟过程中的 H 簇组装。 J.Biol。无机物。化学。19（6）：747-757。
Honda, Y.、Hagiwara, H.、Ida, S. 和 Ishihara, T. (2016)。表达[FeFe]-氢化酶和成熟酶基因的重组大肠杆菌细胞在全细胞反应的光催化H ₂生产中的应用。 安吉乌。化学。国际。埃德。55（28）：8045–8048。
Kosem, N.、Watanabe, M.、Song, JT、Takagaki, A. 和 Ishihara, T. (2023)。_{对光生物催化H 2}生产系统的合理生物催化剂和单个组件的综合研究。 应用。加塔尔。答：创651：119019。
Kosem, N.、Shen, X.-F.、Ohsaki, Y.、Watanabe, M.、Song, JT 和 Ishihara, T. (2024)。在环境条件下将太阳能从N ₂和H _{2 O光生物催化转化为NH}₃。应用。加塔尔。乙：环境。342：123431。
Lubitz, W.、Ogata, H.、Rüdiger, O. 和 Reijerse, E. (2014)。氢化酶。 化学。启示录114(8)：4081–4148。
小戈，S.，木岛，T.，矢田部，T.，宫泽，K.，山崎，R.，松本，T.，安藤，T.，吉川，M.，伊势川，M.，尹，KS，等等人。（2020）。异构体的 [NiFe]、[FeFe] 和 [Fe] 氢化酶模型。 科学。副词。6(24)：eaaz8181。
Orgill, JJ、Chen, C.、Schirmer, CR、Anderson, JL 和 Lewis, RS (2015)。预测生物应用中的甲基紫精氧化还原态。 生物化学。工程师。J.94：15-21。
塔德，C. 和皮克特，CJ (2009)。[Fe]-、[NiFe]- 和 [FeFe]- 氢化酶活性位点的结构和功能类似物。 化学。启示录109(6)：2245–2274。
宣杰、何丽、文文和冯宇 (2023)。氢化酶和固氮酶：生物氢生产中的关键催化剂。分子28(3)：1392。

补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

图S1。不同氢化酶的催化位点。
指南 1. 处理 HCl 的安全程序。