设备

具有基于 Linux 的 64 位操作系统 (Ubuntu 18.04.6 LTS) 的服务器：512 GB RAM 和 Intel Xeon (R) Gold 6238 CPU
配备 Windows 10 操作系统的台式机：Intel Core i5-8300H CPU 和 8 GB RAM

软件和数据集

该协议中使用的软件和数据库如下：

Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64 ( https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh )
TBtools v1.120（Chen 等人，2020）
Diamond v2.1.7.161（Buchfink 等人，2015）
MAFFT v7.453（Katoh 和 Standley，2013 年）
trimAL v1.4.rev15（Capella-Gutiérrez 等人，2009 年）
IQ-TREE v2.2.2.6（Minh 等人，2020）
InterProScan 5.63-95.0（Jones 等人，2014 年）
1KP 数据集（千植物转录组计划，2019）
MEME 5.5.3（贝利和埃尔坎，1994）
iTOL （交互式生命之树）（Letunic 和 Bork，2021）
Jalview v2.11.2.0（Waterhouse 等人，2009）

程序

我们展示了利用大规模基因组数据进行同源/直向同源鉴定的详细程序（图 1）。

图 1. 大规模基因组和转录组的同源物/直系同源物鉴定流程

软件安装
1. Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64
  
  Miniconda3 是一个用于下载和安装生物信息学软件的包管理器。可以通过以下命令下载并安装到服务器中：
  
  wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh
  
  bash Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh
2. 钻石 v2.1.7.161
  
  Diamond 是一种用于蛋白质序列的快速蛋白质比对器，可以使用以下命令下载和安装：
  
  wget https://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v2.1.7/diamond-linux64.tar.gz
  
  tar -zxvf Diamond-linux64.tar.gz
  
  将Diamond的路径添加到环境变量中。
3. MAFFT v7.453
  
  MAFFT是一个序列比对包，可以通过conda安装：
  
  conda 安装 mafft
4. 修剪AL v1.4.rev15
  
  TrimAL 是一个自动对齐修剪的工具。
  
  wget https://github.com/inab/trimal/archive/refs/tags/v1.4.1.tar.gz https://github.com/inab/trimal/archive/refs/tags/v1.4.1.tar.gz
  
  tar -zxvf trimal-1.4.1.tar.gz
  
  cd ./trimal-1.4.1/source/
  
  制作
  
  编译完成后将当前目录添加到环境变量中。
5. IQ-TREE v2.2.2.6
  
  Q-TREE 2 是一种广泛使用的最大似然系统发育推断工具。
  
  wget https://github.com/iqtree/iqtree2/releases/download/v2.2.2.6/iqtree-2.2.2.6-Linux.tar.gz
  
  tar -zxvf iqtree-2.2.2.6-Linux.tar.gz
  
  将 ./iqtree-2.2.2.6-Linux/bin 添加到环境变量中。
6. 网关扫描仪 5.63-95.0
  
  InterProScan是一款蛋白质功能注释软件。可以按照以下说明下载并安装它：InterProScan 文档-interproscan-docs 文档 ( https://interproscan-docs.readthedocs.io/en/latest/ )。
7. TBtools v1.120
  
  TBtools 是一个用于生物信息分析的集成工具，可以从https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases/download/1.123/TBtools_windows-x64_1_123.exe下载。
8. 佳视 v2.11.2.0
  
  Jalview 是一个免费的跨平台程序，用于多序列比对编辑、可视化和分析。该软件可以从https://www.jalview.org/下载。

基因组和转录组下载和处理
1. 植物基因组下载。
  
  共选取了39种链植物（陆地植物和轮藻）、54种绿藻、9种红藻和1种灰藻，涵盖了古质体的所有主要分支（表S1）。下载蛋白质序列或编码序列（CDS）和GFF注释文件。使用的藻类转录组数据可在1KP网站（https://db.cngb.org/onekp/）上获取。
2. 去除多余的转录本和短基因。
  
  根据每个基因组的GFF注释文件，通过TBtools去除冗余转录本和短基因：（a）保留每个基因最长的转录本，以去除由于选择性剪接变异而产生的冗余（详细步骤在视频1中简要展示） ; (b)通过TBtools计算基因的蛋白质序列长度，手动过滤短于50个氨基酸的序列。
  
  视频 1. 通过 TBtools 删除冗余转录本识别大规模基因组/转录组数据中的直系同源基因
识别大规模基因组/转录组数据中的直系同源基因
1. 从基因组中识别候选同源物。
  
  为了识别拟南芥HLS1 (AtHLS1) 的候选同源物，我们对植物基因组的蛋白质序列进行了相对严格阈值（E 值 < 1 × 10 ^{5 ）的相似性搜索。}对于基因组数据，采用相对严格阈值（E值<1×10 ⁵ ），原因包括：（1）基因组数据的基因注释是基于多种证据（如基因数据库和转录组数据），这保证了基因序列的完整性和质量；（2）本研究的基因组数据主要来源于Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/），质量较高。我们在表 S2 中提供了命令行中使用的文件的简要描述。
  
  Diamond makedb --in all_genome_sequences.fa -d all_genome_sequences
  
  钻石blastp--db all_genome_sequences.dmnd--query AtHLS1.fa--out Genome_out.result--outfmt 6--sensitive-e 1e-5--block-size 1.0--index-chunks 1
2. 从转录组中识别候选同源物。
  
  我们使用相对宽松的阈值从植物转录组中搜索候选同源物（E值<1×10 ²）。原因包括可变剪接和过早终止导致的转录组固有的不完整性。视频 2 简要显示了详细步骤。
  
  视频 2. 1KP 网站上 AtHLS1 的 BLASTp
3. 过滤具有爆炸性打击的序列。
  
  来自基因组和转录组的候选同源物被整合到单个 fasta 文件 (ID_sequences.fa) 中，并使用 InterProScan 数据库过滤不带保守功能域的同源序列：N-乙酰转移酶 (PF00583)。将具有“N-乙酰转移酶”域的同源序列合并到新的 fasta 文件（PF00583_ID_sequence.fa）中，以进行进一步的系统发育分析。
  
  Interproscan.sh -i ID_sequences.fa -f tsv -appl Pfam -o interproscan_ID_sequences.txt

通过系统发育分析进行直向同源推断
1. 同源序列的比对和修剪。
  
  MAFFT 使用以下命令比对同源序列：
  
  mafft PF00583_ID_sequences.fa > mafft_out.fa
  
  注意：最多 ~200 个序列 × ~2,000 个位点的比对适用于精确选项 (L-INS-i)，<~30,000 个序列的比对适用于快速选项 (FFT-NS-2)。
  
  TrimAl 是一种广泛使用的工具，用于大规模系统发育分析中的自动比对修剪。在修剪之前，我们使用 Jalview 对序列比对进行手动检查，并排除一个序列（红色矩形中）的错误比对（图 2）。我们使用相对宽松的阈值（“-gt=0.13”：保留至少有 13% 无间隙位点的列，以保留尽可能多的保守域信息位点）来修剪多重序列比对 (MSA)。进一步目视检查修剪后的 MSA，以 (1) 过滤明显不明确的对齐区域，以及 (2) 保留功能域区域，确保更大比例的可靠系统发育信息位点。
  
  修剪-in mafft_out.fa -out mafftout_0.13.fas -gt 0.13
  
  图 2. AtHLS1 及其同源物的多重序列比对。我们凭经验关注保守结构域的比对区域，发现了明显比对不良的序列（没有比对氨基酸残基）。
2. 构建同源蛋白质的系统发育树。
  
  使用IQ-TREE 2推断同源蛋白的最大似然系统发育树，并通过ModelFinder确定最佳拟合模型。分支支持通过超快引导 (UFBoot) 方法和 SH 近似似然比检验（SH-aLRT 检验）进行 1,000 次重复评估。
  
  iqtree2 -s mafftout_0.13.fas -st AA -m MF
  
  iqtree2 -s mafftout_0.13.fas -m Q.plant+I+R6 -alrt 1000 -bb 1000 –bnni -pre 0.13_result
3. 使用功能域/基序确认直系同源序列。
  
  MEME 套件分析保守的功能域/基序。参数“期望找到的主题数量”设置为十（该参数的常见设置），其他参数为默认值。使用 iTOL 将每个直系同源序列的相应功能域和基序映射到系统发育树（视频 3）。在 MSA 中检查并突出显示两个保守残基（AtHLS1 中的 L327 和 E346）。保守的功能域/基序和残基均用于确认直系同源序列（图 3）。
  
  视频 3. 将结构域/基序映射到系统发育树
  
  图 3. 植物 HLS1 同源物的系统发育树、两个保守残基和保守基序

致谢

该工作得到江苏省高等学校自然科学基金项目（21KJB180015）的资助。该协议改编自我们最近的工作（Wang 等人，2023）。我们感谢编辑和匿名审稿人的有益建议。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突或利益竞争。

参考

Bailey, TL 和 Elkan, C. (1994)。通过期望最大化拟合混合模型以发现生物聚合物中的基序。 过程。国际。会议。英特尔。系统。摩尔。生物。2：28-36。
Buchfink, B.、Xie, C. 和 Huson, DH (2015)。使用 DIAMOND 进行快速、灵敏的蛋白质比对。 纳特。方法12(1)：59-60。
Capella-Gutiérrez, S.、Silla-Martínez, JM 和 Gabaldón, T. (2009)。trimAl：大规模系统发育分析中自动对齐修剪的工具。 生物信息学25(15)：1972–1973。
Chen, C.、Chen, H.、Zhang, Y.、Thomas, HR、Frank, MH、He, Y. 和 Xia, R. (2020)。TBtools：专为生物大数据交互式分析而开发的集成工具包。 摩尔。工厂13(8)：1194–1202。
Jones, P.、Binns, D.、Chang, HY、Fraser, M.、Li, W.、McAnulla, C.、McWilliam, H.、Maslen, J.、Mitchell, A.、Nuka, G. 等等人。（2014）。InterProScan 5：基因组规模蛋白质功能分类。 生物信息学30(9)：1236–1240。
Katoh, K. 和 Standley, DM (2013)。MAFFT 多序列比对软件版本 7：性能和可用性的改进。 摩尔。生物。进化。30（4）：772-780。
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补充资料

可以在此处下载以下支持信息：

表 S1。本协议中使用的基因组数据的来源
表S2。命令行中使用的文件的简要说明