材料与试剂

4× Laemmli 缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
10× Tris/甘氨酸/SDS（Bio-Rad，目录号：1610732）
二硫苏糖醇（DTT）（Fisher BioReagents，目录号：BP172-5），请参见制备配方
乙醇（EtOH）（Fisher Scientific，目录号：2818500）
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP229-1）
HiTrap 肝素柱（GE Healthcare，目录号：17-0407-03）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：LC149502）
咪唑（分子生物学级，> 99%）（Fisher Scientific，目录号：O3196-500）
异胚-β-D-1-硫代半乳糖（IPTG）（Fisher Scientific，目录号：BP1755100），请参见制备配方
LB琼脂，Miller（Fisher Scientific，目录号：BP1425-2）
LB肉汤（LB），Miller，颗粒状（Fisher Scientific，目录号：BP9723-2）
溶菌酶（Fisher Scientific，目录号：BP535-5）
Precision Plus Protein ^TM All Blue 预染蛋白质标准品（Bio-Rad，目录号：1610373）
粉末配方混合物 (PIC) 粉末（在本方案中使用 1,000× 库存，并按照在线说明制备：https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p2714）（Sigma-Aldrich，目录号： P2714-1BTL）
氢氧化钠 (NaOH) 颗粒（Fisher Scientific，目录号：S318-500）
β-涡轮基乙醇（BME）（Fisher Scientific，目录号：AC125472500）

第一部分：POLRMT 收缩材料和试剂

Amicon Ultra-15离心过滤装置（50K MWCO，15 mL）（Millipore Sigma，目录号：UFC905024）
硫酸铵（AS）（Fisher Scientific，目录号：A702-3）
氨比西林（Fisher Scientific，目录号：BP1760-25），参见制备配方
Cytiva Capto ^TM DEAE 色谱（Fisher Scientific，目录号：45-002-960），或者，如果使用 FPLC，则使用 HiTrap DEAE Fast Flow（Cytiva，目录号：17-5154-01）
HisTrap FPLC 色谱柱（Cytiva，目录号：17-3712-06）
聚乙烯亚胺（PEI），MN 60,000 50%（Fisher Scientific，目录号：AC178571000），请参见制备配方
Poly-Prep ^®色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358-212，CAS 号：7647-14-5）
Tris碱（Fisher BioReagents，目录号BP152-1）
Tween 20（Fisher BioReagents，目录号：BP337-100）

第二部分：TFAM收缩材料和试剂

1 kb DNA梯子（NEB，目录号：N3232S）
4-（2-丙酮）-1-紫色乙乙烯基（HEPES）（Fisher Scientific，目录号：BP310-1）
Amicon Ultra-15离心过滤装置（3K MWCO，15 mL）（Millipore Sigma，目录号：UFC900324）
溴化乙锭溶液，10 mg/mL（Bio-Rad，目录号：1610433）
HisPur Ni-NTA 树脂（Thermo Scientific，目录号：88222）
卡那霉素（Fisher Scientific，目录号：611290050），参见制备配方
氯化钾（KCl）（分子生物学级）（Fisher Scientific，目录号：P217-3）
氯化钠（Fisher Scientific，目录号：BP358-212，CAS 号：7647-14-5）

第三部分：TFB2M收缩材料和试剂

4-（2-丙酮）-1-紫色乙乙烯基（HEPES）（Fisher Scientific，目录号：BP310-1）
Amicon Ultra-4离心过滤装置（10K MWCO，4 mL）（Millipore Sigma，目录号：UFC801008）
HisPur Ni-NTA 树脂（Thermo Scientific，目录号：88222）
卡那霉素（Fisher Scientific，目录号：611290050），参见制备配方
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-3）
氢氧化钾（KOH）（Fisher Scientific，目录号：P250 500）

生物材料

可根据要求提供成绩

大肠杆菌 (E. coli ) BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 感受态细胞（安捷伦，目录号：230280）或

大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL感受态细胞（Agilent，目录号：230245）
任选：大肠杆菌ArcticExpress (DE3)感受态细胞（安捷伦，目录号：230192）
烟草蚀纹病毒 (TEV) 亚太（Kapust 等人，2001 年；Raran-Kurussi 等人，2017 年）
pPROEXHTb 中的 POLRMT 构建体。它包含残基 43–1230 [缺乏其 N 端线粒体测序序列 (MTS)]，带有 N 端六组酸性 6x-His 标签
pPROEXHTb 中的 TFAM 构建体。它包含残基 43–246（缺少 N 端 MTS），带有 N 端 6x-His 标签和 TEV 重置位点
pT7TEV-HMBP4 中的 TFB2M 构建体。它包含残基 20–398，标有 N 端 6x-His 标签、麦芽糖结合蛋白 (MBP) 标签和 TEV 淀粉位点

解决方案

请参阅食谱的所有解决方案。

第一部分：POLRMT 夹紧

5%聚乙烯亚胺(PEI)溶液pH 7.0
POLRMT 东亚缓冲液
POLRMT HisTrap 缓冲液 A
POLRMT HisTrap 缓冲液 B
POLRMT 肝素无盐缓冲液
POLRMT 肝素缓冲液 A
POLRMT 肝素缓冲液 B

第二部分：TFAM收缩及活性测试

TFAM 缓冲液
TFAM Ni-NTA 缓冲液 A
TFAM Ni-NTA 缓冲液 B
TFAM TEV 储物缓冲液
TFAM 肝素缓冲液 A
TFAM 肝素缓冲液 B
TFAM 瀑布 (2×)
10× TFAM 结合缓冲液
TFAM 瞬时迁移率变化测定 (EMSA) 缓冲液

第三部分：TFB2M 夹紧

TFB2M 安置缓冲液
TFB2M Ni-NTA 缓冲液 A
TFB2M Ni-NTA 缓冲液 B
TFB2M TEV 缓冲液
TFB2M 无盐肝素缓冲液
TFB2M 肝素缓冲液A
TFB2M 肝素缓冲液B

食谱

普通股解决方案

注意：通过0.22 μm注射器过滤器过滤对所有库存进行灭菌，等拆分1 mL份，并储存在-20 °C。

100万IPTG库存

2.38克IPTG

溶解在Milli-Q水中澄清最终体积达到10 mL。

*每1 L细胞培养物中添加200 μL 1 M IPTG，最终浓度为0.2 mM IPTG。

安库存培（100毫克/毫升）

1克氨苄西林

溶解在Milli-Q水中澄清最终体积达到10 mL。

Kan 库存 (25 毫克/毫升)

0.25克卡那霉素

溶解在Milli-Q水中澄清最终体积达到10 mL。

1M DTT 库存

1.54克DTT

溶解在Milli-Q水中澄清最终体积达到10 mL。

第一部分：POLRMT 夹紧

注：所有缓冲液（5% PEI 交替）均用 HCl 或 NaOH 调节至 pH 7.9，用 0.22 μm 过滤器灭菌，并保存在 4 °C 下。使用前将 BME 添加到 Lysis 和 HisTrap 缓冲缓冲液中，将DTT加到HiTrap肝素缓冲缓冲液中。准备冷的、过滤的Milli-Q H ₂ O和20% EtOH，以在使用后清洗和储存FPLC柱。

5%PEI溶液

试剂（原液浓度） 最终浓度 数量

爱德华王子岛 (50%) 5% 10毫升

Milli-Q H ₂ O 不适用 90毫升

全部的 100毫升

当溶液冷却或在冰上时，用HCl将pH调节至7.0。无需过滤。

POLRMT 东亚缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	10毫升
氯化钠 (3 M)	400毫米	33.3毫升
甘油（100%）	15%体积比	37.5毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	0.25毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	0.5毫升
BME* (14.3 M)	5毫米	看注释
溶菌酶*	1毫克/毫升	看注释
图片(1,000×)*	1×	看注释
Milli-Q H ₂ O	不适用	168毫升
全部的		250毫升

*使用前添加。将50 mL缓冲液缓冲液锥形管中，然后将这些成分（5 mg溶菌酶、17.5 μL BME和50 μL PIC）添加到管中，而不是整瓶缓冲液。PIC按照在线方式说明制备，并使用1,000×库存：https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p2714。

POLRMT HisTrap 缓冲液 A

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	40毫升
氯化钠 (3 M)	300毫米	100毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	1毫升
咪唑	20毫米	1.36克
BME* (14.3 M)	5毫米	350微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	707毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加BME。

POLRMT HisTrap 缓冲液 B

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	20毫升
氯化钠 (3 M)	300毫米	50毫升
甘油（100%）	15%体积比	75毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	0.5毫升
咪唑	500毫米	17.02克
BME* (14.3 M)	5毫米	175微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	353毫升
全部的		500毫升

*使用前添加BME。

POLRMT 肝素无盐缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	4毫升
氯化钠 (3 M)	0毫米	不适用
甘油（100%）	15%体积比	15毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	0.1毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	0.2毫升
数码地面传输* (1 M)	1毫米	100微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	81.6毫升
全部的		100毫升

该缓冲液用于调节HisTrap柱洗脱液的盐浓度。*使用前添加DTT。

POLRMT 肝素缓冲液 A

试剂（库存浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	40毫升
氯化钠 (3 M)	150毫米	50毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	1毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	2毫升
数码地面传输* (1 M)	1毫米	1,000 微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	756毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加DTT。

POLRMT 肝素缓冲液 B

试剂（库存浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.9）	40毫米	20毫升
氯化钠 (3 M)	1,000毫米	167毫升
甘油（100%）	15%体积比	75毫升
吐温 20 (100%)	0.1%体积比	0.5毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	1毫升
数码地面传输* (1 M)	1毫米	500微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	236毫升
全部的		500毫升

*使用前添加DTT。

第二部分：TFAM 压缩

注：所有缓冲液均用 HCl 或 NaOH 调节至 pH 7.5，用 0.22 μm 过滤器灭菌，并储存在 4 °C 下。准备冷的、过滤的 Milli-Q H ₂ O 和 20% EtOH，以在使用后清洗并储存FPLC柱。

TFAM 缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	20毫米	4毫升
氯化钠 (3 M)	200毫米	13.33毫升
甘油（100%）	15%体积比	30毫升
咪唑	10毫米	0.136克
BME* (14.3 M)	5毫米	看注释
溶菌酶*	1毫克/毫升	看注释
双胞胎混合物* (1,000×)	1×	看注释
Milli-Q H ₂ O	不适用	152.47毫升
全部的		200毫升

*使用前添加。我们只需要锥管中的50 mL缓冲液；然后，将这些成分（5 mg溶菌酶、17.5 μL BME和50 μL PIC）添加到管中，而不是整缓冲瓶液。

TFAM Ni-NTA 缓冲液 A*

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	20毫米	20毫升
氯化钠 (3 M)	200毫米	66.65毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
咪唑	10毫米	0.681克
BME* (14.3 M)	5毫米	350微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	762.35毫升
全部的		1,000毫升

*该缓冲液与透明溶菌酶和 PIC 的 TFAM 容纳缓冲液相同。使用前添加 BME。

TFAM Ni-NTA 缓冲液 B

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	20毫米	20毫升
氯化钠 (3 M)	200毫米	66.65毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
咪唑	500毫米	34.04克
BME* (14.3 M)	5毫米	350微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	762.35毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加BME。

TFAM TEV 储物缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	20毫米	40毫升
氯化钠 (3 M)	300毫米	200毫升
甘油（100%）	15%体积比	300毫升
BME* (14.3 M)	5毫米	700微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	1,459 毫升
全部的		2,000毫升

*使用前添加BME。

TFAM 肝素缓冲液 A

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	20毫米	20毫升
氯化钠 (3 M)	200毫米	66.67毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
数码地面传输* (1 M)	1毫米	1,000 微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	762.33毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加DTT。

TFAM 肝素缓冲液 B

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	30毫米	30毫升
氯化钠 (3 M)	1500毫米	500毫升
甘油（100%）	15%体积比	150毫升
数码地面传输* (1 M)	1毫米	1,000 微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	319毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加DTT。

TFAM 瀑布 (2×)

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
Tris-HCl（1 M，pH 7.5）	80毫米	16毫升
氯化钠 (3 M)	200毫米	13.33毫升
数码地面传输* (1 M)	2毫米	400微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	170.27毫升
全部的		200毫升

*使用前添加DTT。

10× TFAM 结合缓冲液

500 mM Tris-HCl pH 8.0

1M氯化钾

50 mM 氯化镁₂

1 mM DTT（使用前添加）

TFAM EMSA 缓冲液

50 mM Tris-阿泰盐 pH 8.0

2.5毫米乙二胺四组合

第三部分：TFB2M 夹紧

注：所有缓冲液均用 HCl 或 KOH 调节至 pH 8.0，用 0.22 μm 过滤器灭菌，并储存在 4 °C 下。对 Lysis 和 HisTrap 缓冲液使用 BME，对 HiTrap 肝素柱和存储缓冲液使用 DTT准备冷的、过滤的 Milli-Q H ₂ O 和 20% EtOH，以在使用后清洗并储存 FPLC 柱。

TFB2M 安置缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	6毫升
氯化钾 (3 M)	1M	100毫升
甘油（100%）	5%体积比	15毫升
咪唑	10毫米	0.204克
BME* (14.3 M)	5毫米	看注释
溶菌酶*	1毫克/毫升	看注释
双胞胎混合物*（PIC，1,000×）	1×	看注释
Milli-Q H ₂ O	不适用	179毫升
全部的		300毫升

*使用前添加。我们只需要锥管中的50 mL缓冲液；然后，将这些成分（5 mg溶菌酶、17.5 μL BME和50 μL PIC）添加到管中，而不是整缓冲瓶液。

TFB2M Ni-NTA 缓冲液 A

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	20毫升
氯化钾 (3 M)	300毫米	100毫升
甘油（100%）	5%体积比	50毫升
咪唑	20毫米	1.36克
BME* (14.3 M)	5毫米	350微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	830毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加BME。

TFB2M Ni-NTA 缓冲液 B

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	10毫升
氯化钾 (3 M)	300毫米	50毫升
甘油（100%）	5%体积比	25毫升
咪唑	500毫米	17.02克
BME* (14.3 M)	5毫米	175微升
Milli-Q H ₂ O	不适用	415毫升
全部的		500毫升

*使用前添加BME。

TFB2M TEV 缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	40毫升
氯化钾 (3 M)	300毫米	200毫升
甘油（100%）	5%体积比	100毫升
BME (14.3 M) *	5毫米	699.3μL
Milli-Q H ₂ O	不适用	1,659.3 毫升
全部的		2,000毫升

*使用前添加BME。

TFB2M 无盐肝素缓冲液

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	4毫升
甘油（100%）	5%体积比	10毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	0.4毫升
数码地面电视 (1 M) *	1毫米	0.2毫升
Milli-Q H ₂ O	不适用	185.4毫升
全部的		200毫升

*使用前添加DTT。

TFB2M 肝素缓冲液A

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8）	20毫米	20毫升
氯化钾 (3 M)	200毫米	66.67毫升
甘油（100%）	5%体积比	50毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	2毫升
数码地面电视 (1 M) *	1毫米	1毫升
Milli-Q H ₂ O	不适用	860.33毫升
全部的		1,000毫升

*使用前添加DTT。

TFB2M 肝素缓冲液B

试剂（原液浓度）	最终浓度	数量
HEPES-KOH（1 M，pH 8.0）	20毫米	10毫升
氯化钾 (3 M)	1.5M	250毫升
甘油（100%）	5%体积比	25毫升
乙二胺四乙醚 (500 mM)	1毫米	1毫升
数码地面电视 (1 M) *	1毫米	0.5毫升
Milli-Q H ₂ O	不适用	213.5毫升
全部的		500毫升

*使用前添加DTT。

SDS-PAGE 样品配方

注意：这些配方每份制备 SDS-PAGE 样品 20 μL。运行前将样品在 95 °C 下煮沸 5 分钟，并每泳道上样 9–12 μL。所有 POLRMT 乳液处于 8%–10% SDS- PAGE上运行。对于TFAM和TFB2M，10%–12% SDS-PAGE比较合适。我们在1× Tris/甘酸/SDS缓冲液中运行凝胶，并用考马斯染色。

未感应、感应、沉淀、透析液、PEI 沉淀、PEI 上清液、AS 沉淀、Ni-NTA 或 HisTrap 流穿样品和洗涤样品

1.5 μL 样品或刮微沉淀直接放入微量离心管中

13.5 µL Milli-Q 水

5 μL 4× Laemmli 缓冲液

Ni-NTA 精华液，AS 上清液

7.5 μL 样品或小块沉淀

7.5 µL Milli-Q 水

5 μL 4× Laemmli 缓冲液

TEV 复苏的样品、HisTrap 和肝素柱原油分

注意：加载尽可能多的样品（每泳道至少 12 μL）以可视化非常稀释的样品

10 μL 样品或小块沉淀

5 µL Milli-Q 水

5 μL 4× Laemmli 缓冲液

实验室用品

17 mm × 100 mm 培养管，14 mL（VWR，目录号：60818-689）
BD 一次性注射器，50 mL（Fisher Scientific，目录号：13-689-8）
Biotix 10 μL 吸头（Fisher Scientific，目录号：12-111-021）
Fernsbach 培养瓶，2.8 L（Fisher Scientific，目录号：09-552-39）
膜过滤器，孔径 0.22 μm，直径 47 mm（Fisher Scientific，目录号：09-719-2B）
培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
移液器吸头、微量离心管和低保留管（Genesee Scientific，目录号：24-282、23-150RL、23-165RL、28-103、22-281LR）
血清移液器，5、10 和 25 mL（VWR，目录号：75816-094、75816-100、75816-090）
注射式过滤器（孔径 0.22 μm，直径 25 mm）（VWR，目录号：76479-024）

设备

带密封盖的 1 L 离心瓶（Thermo Scientific，目录号：31411006）
4 L 容量离心机（Thermo Scientific，Sorvall LYNX 4000 Superspeed Centrifuge，目录号：75006580）
台式离心机（Eppendorf，5910 R，5425）
台式培养摇床（Eppendorf，型号：New Brunswick 台式培养摇床 I24）
基本生物光谱仪 (Eppendorf)
透析管，14,000 MWCO（Sigma-Aldrich，目录号：D9777-100FT）
快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（Bio-Rad，NGC Quest 10 色谱系统，目录号：7880001）
凝胶成像仪（Bio-Rad，型号：Gel Doc EZ Imager）
用于 Ni-NTA 树脂的玻璃柱（Bio-Rad，Econo-Column 色谱柱，目录号：7371512）
热板搅拌器（VWR，目录号：97042-674）
磁力搅拌棒（Fisher Scientific，目录号：14-513-51）
可重复使用的瓶顶过滤装置（Thermo Scientific，Nalgene，目录号：DS0320-2533）
SDS-PAGE 运行系统（Bio-Rad、Mini-PROTEAN Tetra 系统）
超声波仪（Qsonica，CL-18 超声波仪探头）

软件和数据集

Bio-Rad 图像实验室 ( https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z )
ImageJ 版本 1.53e ( https://imagej.net/ij/index.html )

程序

第一部分：POLRMT 纯化

重组 POLRMT 在大肠杆菌中的过表达
1. 将质粒转化为 BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 并在含有氨苄青霉素（或适当抗生素）的 LB 琼脂平板上进行平板培养。37°C 倒置孵育过夜。
  
  注意：此转换也可以使用 BL21-CodonPlus-RIL 完成。如果之前已经制备了携带 POLRMT 编码质粒的细胞甘油原液，则可以跳过此步骤。
2. 准备一个装有 50 mL 高压灭菌 LB 介质的高压烧瓶，并添加 50 μL Amp 库存（100 mg/mL，参见配方）。
3. 用无菌移液器吸头或棒从平板上挑取五个独立的菌落进行接种（或添加一小块甘油原液）。
4. 接种后，下午5点左右开始在28℃下培养物，并以200rpm摇动过夜（14-17小时）（有关细胞温度和过水度，请参见一般说明2）。
5. 在四个烧瓶（2.8 L Fernsbach培养烧瓶）中，各准备1 L高压灭菌的LB培养基，并每升培养基添加1 mL的Amp库存。
6. 每升含氨苄青霉素的LB培养基中添加10 mL注射物（有关如何制备甘油原液，请参见一般说明3）。
7. 将开始的烧瓶在37°C下进行，并以200 rpm的速度摇动。3-4小时后测量OD ₆₀₀来检查细胞密度，看看它是否在0.4和0.6之间。
8. 一旦达到上述OD范围，将摇床温度降低至18℃。将1mL样品（标记为“未感应”）放入微量离心管中，将其粘在烧瓶顶部，继续点火。
9. 将烧瓶冷却至 18°C 30 分钟至 1 小时，然后添加 IPTG（0.2 mM 最终浓度）以感应 POLRMT 表达式。为此，每 1 L LB 添加 200 µL 1 M IPTG 库存（请参阅配方）（请参阅冷却烧瓶的一般说明4）。
10. 在18°C、200 rpm下继续休眠（16-20小时）。
11. 在感应期（“感应”）结束时取出 1 mL 样品，并从烧瓶中取出“未感应”样品管（请参阅 SDS-PAGE 样品配方）。在 10% SDS-PAGE 文化和考马斯染色上样品运行，以可视化 POLRMT 过表达。
12. 在1 L离心瓶中于4°C下以2,991×g离心30分钟收获细胞。
13. 用10%漂白剂安全处理上清液，沉淀刮入50 mL锥形管中。将组合颗粒储存在-80°C（无需快速冷冻）或继续下一步。

通过超声心动 POLRMT 过表达沉淀

注意：除非有说明，以下所有步骤均应在 4 °C 或冰上进行。
1. 将管子放入自来水中解冻沉淀。用抹刀将细胞刮入金属烧杯中，并加入50 mL含有BME、溶菌酶和PIC的冷透析缓冲液。任选：在4°C下用搅拌棒搅拌搅拌基质1小时，让溶液菌酶分割细胞。
2. 将烧杯放入冰桶中，在4°C下对悬浮细胞液进行超声处理30分钟（开关30秒，60%振幅）。检查此时悬浮液的粘度是否已降低且颜色稍深。
3. 将悬浮液在4°C下以30,000× g离心1小时。
4. 将上清液（“物品”）放入冰上的冷烧杯中并记录体积。
5. 采样在 SDS-PAGE 流体上运行：沉淀和透析物（参见配方）。沉淀中的 POLRMT 比透析液中的 POLRMT 更多，但我们将使用透析液中的可溶性 POLRMT 进行夹紧（图 1B）。
  
  图 1. 喷嘴 RNA 聚合酶 (POLRMT) 拉伸流程图以及聚乙烯亚胺 (PEI) 和硫酸铵 (AS) 沉淀。 (A) 包含 POLRMT 残基 43-1,230 的喷嘴序列 (Uniprot: O00411) 和(B) 对来自超声处理步骤、PEI 沉淀和 AS 沉淀步骤的样品进行 10% SDS-PAGE 分析。(C) POLRMT 吸附，包括超声处理、PEI 沉淀、AS沉淀、DEAE柱、HisTrap柱、HiTrap肝素柱和浓缩。
POLRMT PEI 沉淀
1. 将下部物放入冰上或4°C的冷玻璃烧杯中，加入搅拌棒并检查其在搅拌板上是否有轻微搅拌溶液。
2. 缓慢地冷的5% PEI（参见配方）滴加到氧气液中，达到0.3% PEI的最终浓度。要计算我们需要多少5% PEI，请找到氧气液体积的6%：
  
  添加 ______ mL 5% PEI = ______ mL 储物液 × 0.06
3. 用铝箔盖住烧杯顶部，并在4°C下继续轻轻搅拌30分钟。
4. 在4°C下以30,000× g离心10分钟。
5. 取出样品进行介质分析[PEI沉淀、PEI上清液（参见配方）]，并在10% SDS-PAGE介质上运行。POLRMT应位于上清液中（图1B）。

POLRMT AS 沉淀
1. 向上清液中缓慢添加AS粉末（持续30分钟）约55%渗透度。
  
  例如，100 mL 储物液的 55% 排水度需要 35.1 g AS。
  
  ______mL 位置液 × 3.51 g/mL = 添加 _______克 AS
2. 用铝箔盖住烧杯顶部，在4°C下轻轻搅拌1小时（或过夜）以溶解AS并沉淀蛋白质。
3. 在4°C下以30,000× g离心10分钟。POLRMT蛋白悬浮于悬浮中。
4. 取出样品进行重力分析：AS 沉淀、AS 上清液（参见配方）。在 SDS-PAGE 重力上，您应该在 AS 沉淀中看到 POLRMT (~140 kDa)，而不是在 AS 上清液中（图1B）。
5. 记录颗粒的重量（以克为单位）将其储存在-80°C。
  
  暂停点： AS沉淀可以保存几个月，然后再进行FPLC夹紧。

POLRMT DEAE 重力柱和过夜 HisTrap 柱

注意：HisTrap 柱 (Cytiva) 的一柱体积 (CV) 相当于 5 mL。DEAE重力柱可以与 HisTrap 柱串联的 HiTrap DEAE Fast Flow 柱 (Cytiva) 来替代。
1. 首先连接5 mL HisTrap柱放置POLRMT HisTrap缓冲液（参见配方）加载到FPLC上。
2. 清洗并平衡色谱柱（过滤Milli-Q水、HisTrap缓冲液B、HisTrap缓冲液A各5个CV，2 mL/min）。
3. 每克加入4 mL冷缓冲颗粒液，将AS颗粒重新悬浮于HisTrap缓冲液A中。轻轻搅拌溶液溶解。
  
  注意：只要所有缓冲液都是冷的并且样品保存在冰上，DEAE 柱的以下步骤可以在接下来完成。
4. 将 10 mL 的 DEAE 树脂悬浮液放入干净的重力柱中，准备 DEAE。树脂沉淀后，您应该得到大约 5 mL 的床树脂。
5. 用 5 倍柱床体积的冷过滤水和冷 HisTrap 缓冲液 A 清洗 DEAE。
  
  注意：此 DEAE 柱可以用水清洗并储存在 20% EtOH 中以供重复使用。
6. 关闭重力柱上的塞子，将溶解的 AS 沉淀倒入柱中，并用抹刀轻轻搅拌。可选：在 4 °C 下轻轻摇动孵育 15 分钟。
7. 洗脱到冰上的干净容器中，然后添加 10 mL HisTrap 缓冲液 A，以确保洗掉所有 POLRMT。
8. 用 0.22 μm 注射器过滤器过滤洗脱液，并准备将其加载到 FPLC 上的 HisTrap 柱上。使用这些设置进行 FPLC 运行，同时监测 280 nm (A ₂₈₀ ) 处的洗脱液吸光度，并收集所有流通液/洗脱液以供以后的 SDS-PAGE 分析（图 2B）：
  1. 样品应用：0.3 mL/min（用于运行过夜）。
  2. 用缓冲液 A 洗柱：0.5 mL/min（用于运行过夜）。清洗色谱柱，直至 A ₂₈₀迹线返回到基线（大约 5 个 CV 或 25 mL）。达到基线后，继续洗涤至少 20 mL。
  3. 蛋白质洗脱：1 mL/min，收集 5 mL 级分。
    
    洗脱程序：
    
    40 CV (200 mL) 的 0–50% 缓冲液 B 梯度。可选：用缓冲液 B 清洗色谱柱。无需从这些步骤中收集样品。
    
    用于五个 CV 的 70% 缓冲液 B (25 mL)
    
    用于五个 CV 的 100% 缓冲液 B (25 mL)
  4. 用 5 个 CV 的水和 5 个 CV 的 20% EtOH 清洗色谱柱（使用 1 mL/min 的较低流速）并储存色谱柱。
  注意：POLRMT 以小宽峰洗脱，并且非常稀。不要让馏分静置超过一天，因为 POLRMT 的浓度较高的馏分将开始沉淀（参见一般说明 5）。
  
  图 2. 线粒体 RNA 聚合酶 (POLRMT) HisTrap 色谱法。(A) 在 FPLC 上运行的 HisTrap 柱洗脱相的色谱图和 (B) 对收集的级分进行 8% SDS-PAGE 分析。
9. 取出 HisTrap 级分样品，并在 10% SDS-PAGE 凝胶上与蛋白质梯度一起运行。POLRMT 在 SDS-PAGE 凝胶上出现在 140 kDa 左右，并且大致集中在分数 #4-22 周围（图 2B）。（为了节省时间，请在凝胶运行时开始准备过滤器并浓缩；请参阅下面的步骤。）
10. 在 4,000× g和 4 °C下平衡两个 50K MWCO Amicon 过滤器。
11. 通过在 1,900× g下离心 Amicon 过滤装置来浓缩 POLRMT 。每 5-10 分钟轻轻移液一次，以避免沉淀。当总体积小于 25 mL 时停止（请参阅有关此浓缩步骤的一般说明 6）。
12. 向浓缩液中添加等体积的无盐肝素缓冲液，使最终 NaCl 浓度达到 150 mM（参见一般说明 7）。

POLRMT 隔夜 HiTrap 肝素柱
1. 在FPLC上的缓冲液A中清洗并平衡5 mL HiTrap肝素柱（过滤Milli-Q水、肝素缓冲液B，然后肝素缓冲液A各5个CV，2 mL/min）。
2. 加载用无盐肝素缓冲液已补充的蛋白质样品。
3. 运行以下FPLC程序：
  1. 样品涂抹：0.3 mL/min（用于运行睡眠）。
  2. 使用缓冲液A洗柱：0.5 mL/min（用于运行睡眠）。清洗色谱柱，溶液A ₂₈₀迹线返回至基线（大约5个CV或25 mL）。达到基线后，继续洗涤至少20 mL。
  3. 蛋白质洗脱：2 mL/min，收集3 mL级分。
    
    20 CV (100 mL) 的 0–50% 缓冲液 B 梯度。
    
    55%缓冲液B适用于5个CV或25 mL（POLRMT此处梯度！）。
    
    70%缓冲液B用于5个CV或25 mL。
    
    5个CV或25 mL的100%缓冲液B。
  4. 使用5个CV的水和5个CV的20% EtOH清洗色谱柱（使用1 mL/min的下游流速）进行色谱储存柱。

POLRMT 的浓缩和存储
1. 运行分数的 10% SDS-PAGE 水分（参见配方）份额与 POLRMT 汇总在一起（图 3B）。
  
  图 3. 线粒体 RNA 聚合酶 (POLRMT) HiTrap 肝素色谱。 (A) 在 FPLC 上运行的 HiTrap 肝素柱洗脱相的色谱图和 (B) 对收集的级分进行 10% SDS-PAGE 分析。
2. 通过在离心机中旋转5分钟，用150 mM NaCl 肝素缓冲液平衡50K MWCO Amicon过滤装置的膜。将合并的POLRMT分数添加到装置中。
3. 在4°C下以2,500× g开始离心，并逐渐降低速度至1,300× g，从膜底部轻轻移液并经常检查浓度，溶液至少7μM。POLRMT很容易沉淀，因此如果您发现沉淀形成或溶液中的浓度没有增加，请停止浓缩（参见一般说明8）。
4. 通过Protparam工具（https://web.expasy.org/protparam/）使用这些参数测量和计算蛋白质浓度：
  
  6x-His-POLRMT：137.7 kDa 或 137,700 毫克/摩尔
  
  摩尔消光系数：143,700 L (cm*M) ^-1（假设所有半胱氨酸都减少）
  
  Abs 0.1% = 1.043（假设所有半胱氨酸均减少）
5. 测定甘油的最终浓度为25%的甘油。
6. 将10 μL等分到低保留管中，在液氮中快速冷冻，并储存在-80 °C。

第二部分：TFAM 压缩

在大肠杆菌中的过表达中重组TFAM
1. 使用约200 ng ProEX_Htb_TFAM 细胞试剂转化BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL ，并在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行平板培养。37°C 倒置过夜过夜。
2. 补充有氨苄青霉素的LB中培养5×5 mL开始培养物休眠，每管一个菌落。
3. 早上，将5 mL开始培养物以2,782× g离心6分钟，然后倒出介质。小心将细胞重新悬浮在总共1 mL的LB中，转移1 mL以重新悬浮5试管中的所有细胞。
4. 将氨苄青霉素添加至LB培养基中（每1 L LB加入1 mL 100 mg/mL氨苄青霉素原液）。将1 mL细胞悬浮液均匀分装于1 L LB烧瓶之间。
5. 在37°C、200 rpm下。4-5小时后检查OD ₆₀₀，看其是否在0.4 和 0.6 之间。
6. 一旦达到上述OD范围，将1 mL样品（“未感应”）放入微量离心管中，将管粘在烧瓶侧面，将摇床温度降低至16 °C。
7. 在使用IPTG诱导之前冷却烧瓶（0.2 mM最终浓度；每1 L LB 200 μL 1 M IPTG 库存）。
8. 继续在16 °C（约16–20小时）、200 rpm下摇动睡眠。
9. 在感应期（“感应”）结束时取出样品，将其与“未感应”样品（参见配方）一起在 SDS-PAGE 电流上运行，以可视化蛋白质表达。
10. 在4°C下以2,991×g离心15分钟收获细胞。
11. 废弃去上清液沉淀刮入50 mL锥形管中。将组合沉淀储存在-80°C或继续细胞储藏室。

细胞凋亡：溶菌酶处理和超声处理

注意：除非有说明，以下所有步骤均应在 4 °C 或冰上进行。
1. 如果冷冻则解冻细胞。将40 mL的TFAM缓冲液（含溶菌酶、BME和PIC；另见配方）添加到沉淀（每升表达培养物 10 mL 缓冲液）中，然后重新均匀悬浮沉淀溶液。
2. 4°C 1 小时。
3. 在4°C下对细胞悬浮液进行声波处理20分钟（开启和关闭20秒，60%振幅）。
4. 在4°C下以30,000× g离心1小时。
5. 保存约 10 μL 的“细胞沉淀”和“内部物”样品（参见配方）用于 SDS-PAGE 凝胶分析。

TFAM Ni-NTA 树脂#1

注：这是在 4 °C 下通过离心法得到的 Ni-NTA。
1. 根据生产商的说明，在50 mL锥形管中准备5 mL Ni-NTA树脂床，并用Ni-NTA缓冲液A洗涤3次，将树脂重新悬浮于缓冲液中，在4℃ 363×g下旋转3次分钟。°C，小心倒出缓冲液，并重复该过程。
2. 添加上清液并在4°C下轻轻搅拌过夜。
3. 旋转树脂，将上清液作为“样品应用”收集到锥形管中，然后通过向树脂中添加5 mL Ni-NTA缓冲液A开始树脂清洗步骤，轻微混合，并以1,932× g、4的静止旋转样品。°C。
4. 收集上清液作为“洗涤 1”并重复洗涤以洗涤 #10。
5. 从第10次清洗开始，检查乳液在280 nm处的吸光度，并继续清洗溶液吸光度接近0。
6. 通过添加 5 mL Ni-NTA 缓冲液 B 并像以前一样旋转来洗脱蛋白。收集样品作为“洗脱 1”并重复 3-5 次，保持“洗脱”上清液分离。
7. 使用从细胞中、上样、洗涤和洗脱中收集的样品运行 10% 或 12% SDS-PAGE 凝胶（参见配方）。大约 25 kDa 的 TFAM 带应该很明显，但仍然存在一些中部（图4B）。
  
  图 4. 酪蛋白 A、线粒体 (TFAM) 收缩流程图、Ni-NTA 和 HiTrap 肝素色谱以及 TFAM DNA 压实测试。 (A) TFAM 收缩，包括 Ni-NTA 树脂收缩、TEV 紫色、第二个(B) Ni-NTA #1 结果的 12% SDS-PAGE 分析，包括洗涤 (W) 和洗脱步骤 (E)。( C) TEV 肥皂切割 TFAM 和(D) 在FPLC上运行的 HiTrap 肝素柱色谱相的色谱图以及收集的级分的 SDS-PAGE 分析。(E) 瞬时迁移率振幅测定 ( EMSA)，用于测试TFAM压缩DNA的能力。

TFAM 上他的标签是尼龙和 TEV 切割
1. 将 2 L 冰冷的 TFAM TEV 缓冲液添加到大烧杯中。
2. 将具有显着着 TFAM 含量的洗脱液真空度管中，并以 1:30 TEV:TFAM 蛋白质摩尔比添加 TEV 氨基酸。（使用合并洗脱样品在 280 nm 处的吸光度提示 TFAM 含量。有关蛋白质质量和消光系数，请参见步骤G。）
3. 让水分在缓冲液中保温，并在4°C下轻轻搅拌过夜过夜。
4. 通过比较前后保存的样品，检查 12% SDS-PAGE 导电上 TEV 工件是否成功。如果切割完成，则继续下一步。如果没有，添加更多 TEV 并继续复位（图 4C）。
  
  注意：我们实验室使用的 TEV 布鲁克版本大小约为 26 kDa。这意味着它在 SDS-PAGE 上看起来很像未切割的 TFAM。

TFAM Ni-NTA 树脂#2
1. 如前所述准备 5 mL Ni-NTA 树脂床（参见步骤 C1）。
2. 将美容后的乳液添加到树脂中，并像之前一样在4°C下过夜，同时轻轻搅拌。
3. 像以前一样的旋转树脂（1,932× g，4°C）并收集上清液[“样品应用”（这将带有 TEV 通道，现在未标记的 TFAM）]。
4. 将 5 mL Ni-NTA 缓冲液 B 添加到树脂中，混合并旋转以收集“洗脱液 1”。您需要收集此数据以确保 TEV 环氧树脂与 Ni 树脂结合。
5. 重复2-3次。
6. 运行 10% 或 12% SDS-PAGE 凝胶以确保 TFAM 位于“样品应用”中（图 2C）。

TFAM 浓度和 HiTrap 肝素柱

注意：第一个浓缩步骤的替代方法是通过添加任何盐的Ni-NTA缓冲液A版本来调整盐浓度。将盐调整至<200 mM，以便在HiTrap肝素柱上使用。
1. 使用 5 个 CV 的肝素缓冲液 B 和缓冲液 A 清洗并平衡 FPLC 上的 5 mL HiTrap 肝素柱 (Cytiva)。
2. 将Ni-NTA树脂#2的梯度分数添加至50mL锥形管中，并开始缓冲液交换样品，方法是将其以15mL体积添加至3K MWCO Amicon过滤器中，并在4℃下以3,434× g旋转。当缓冲液交换液减至2 mL时停止浓缩。
3. 添加全部蛋白质样品并旋转至约2 mL后，用肝素缓冲液A填充3K MWCO Amicon过滤器并继续旋转。继续添加肝素缓冲液A并旋转，溶液约30 mL流过过滤器，底部下2– 3 mL。这将盐浓度从300 mM降低至200 mM，以确保与HiTrap肝素柱结合。
4. 将缓冲液交换的蛋白质样品加载到准备好的HiTrap肝素柱上。
5. 使用这些设置运行：
  1. 样品施加：1.0 mL/min。
  2. 洗柱：1.0 mL/min，溶液A ₂₈₀达到~0。
  3. 梯度：2.5 mL/min，2 mL级分。
    
    0–100% 缓冲液 B 梯度超过 10 CV (50 mL)。
  4. 用5个CV的水和5个CV的20% EtOH (1 mL/min)清洗色谱柱保存。

TFAM的浓缩和存储
1. 对组分运行 10% 或 12% SDS-PAGE 凝胶，将组分与 TFAM 聚集在一起（图 4D）
2. 像以前一样使用新的3K MWCO Amicon过滤器进行浓缩。
3. 当所有合并的级分都浓缩至小体积（0.5–1 mL）时，添加2×缓冲液以填充过滤器并继续离心。重复此过程，使两整卷缓冲液通过过滤器以交换缓冲当2×存储缓冲液第二次完全达到约2 mL时停止，并开始测量280 nm处的吸光度以了解TFAM浓度，同时继续离心。
4. 通过Protparam工具（https://web.expasy.org/protparam/）使用蛋白质序列中的这些参数测量和计算蛋白质浓度：
  
  TEV 穿越后的 TFAM：24.4 kDa 或 24,400 毫克/摩尔。
  
  摩尔消光系数：35,410 L (cm*M) ^-1（假设所有半胱氨酸都减少）。
  
  Abs 0.1% = 1.45（假设所有半胱氨酸均减少）。
5. 当达到所需浓度(100–200 mM)时，将样品从Amicon过滤器移至锥形管中，并添加等体积过滤后的50%甘油，使最终浓度为25%甘油。
6. 每管等分20 mL，快速冷冻，并储存于-80 °C。

使用恐航幅度振幅分析 (EMSA) 测试 TFAM DNA 压实活性

注意：要了解封闭的 TFAM 是否具有活性，最好进行瞬时迁移速率测定。TFAM 可以非电位结合 DNA，因此可以使用任何补充 DNA。如果条带在检测中向上移动，则 TFAM 有活动状态且可用于转录检测。在我们的测定中，我们使用 Puc19 标注。
1. 使用 TFAM EMSA 凝胶缓冲液制备 1% 琼脂糖 EMSA
2. 使用 1× TFAM 结合缓冲液制备反应，加入约 200 ng 的 DNA，然后从中逐渐加入 TFAM。这些反应的总体积通常为 20–30 mL。
3. 将样品在37°C下30分钟。
4. 在样品中添加过滤后的甘油至10%，并与1 kb DNA梯子一起加载到EMSA上。
5. 在 TFAM EMSA 运行缓冲液中，接下来将 EMSA 电压以 70 V 运行 65 分钟。
6. 在前期下使用溴化乙锭轻轻搅拌30分钟，对高分子进行染色，并在Bio-Rad Gel Doc EZ理论仪系统或同等系统上使用布鲁克进行理论（图4E）。

第三部分：TFB2M 夹紧

TFB2M的表达
1. 将含有 TFB2M (图 5) 的溶液转化为 BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL 并铺在含有 Kan (25 μg/mL，参见食谱) 的平板上。37°C 倒置烘烤过夜。
  
  注意：如果之前已经制备了甘油储备，则可以跳过转化步骤。大肠杆菌菌株ArcticExpress (DE3)也可用于转化。
  
  图 5. 坏死因子 B2、线粒体 (TFB2M) 收缩流程图。 (A) 包含 TFB2M 核苷酸序列的表达构建体，对应于残基 21-396（Uniprot：Q9H5Q4）。该线粒体具有 N 断裂 6x-His标签的麦芽糖结合蛋白(MBP)可溶性标签，通过TEV切割位点连接到TFB2M。(B) TFB2M 夹紧箭头，包括蛋白质表达、Ni-NTA #1 树脂密封、TEV 箭头切割、Ni-NTA #2 树脂步骤、HiTrap 肝素柱和浓缩。
2. 将5个菌落或1块冷冻甘油原液加入到5–10 mL含有Kan (25 μg/mL)的LB培养物中。在28–37 °C下摇动培养物避免；让起始培养物生长过渠（参见 POLRMT 夹紧的一般说明 2）。
3. 早上，将原代培养物 (2.5–5 mL) 添加到 1 L LB 培养物中。
4. 在37 °C、200 rpm下生长，溶液OD ₆₀₀达到0.7–0.8（大约3–5小时）。
5. 一旦达到 OD 范围，将摇床冷却至 14 °C 并取出 1 mL 样品（“未感应”），然后用 0.2 mM 最终 IPTG 诱导后续培养物（请参阅配方）。14°C 下继续摇动 16-20小时。
6. 在感应期结束时取1 mL样品（“感应”）在SDS-PAGE上进行疏水。
7. 在4°C下以2,991×g离心15分钟收获细胞。
8. 将细胞沉淀储存在-80°C。

超声处理

注意：除非有说明，以下所有步骤均应在 4 °C 或冰上进行。
1. 将 40 mL 的盐水缓冲液（溶菌酶、BME 和 PIC，请参见配方）添加到 4 L 的细胞沉淀物中（每升表达培养物含有 10 mL 的盐水缓冲液），并在 4 °C 下搅拌沉淀物1小时。
2. 在冷室中，以60%振幅超声处理20分钟，断断续续30秒。
3. 在4°C下以30,000×g离心1小时即可取出细胞碎片。

Ni-NTA 树脂#1
1. 将重力柱夹在支架上，然后将10 mL Ni-NTA 树脂溶液移入柱中，除去5 mL 床体积。
2. 用过滤后的冷Milli-Q水清洗树脂3次，然后清洗一次以与Ni缓冲液A平衡。
  
  注意：每次洗涤的体积应为树脂床体积的五倍。
3. 将细胞空隙液中吸附Ni-NTA树脂，并用金属刮刀轻轻搅拌，以促进其蛋白标记的结合。立即关闭柱/小瓶并在4°C下轻轻摇动1。
4. 再次将柱色谱夹在支架上并收集样品应用流通液。将样品标记为“Ni flowthrough”以进行SDS-PAGE。
5. 准备以下缓冲液A和B的混合物以执行洗涤和洗脱步骤：
  
  1个CV = 5 mL床树脂。洗涤1、2和3：0% B，5个CV：准备三管，每管含50 mL缓冲液A。
  
  洗涤4：5% B，五个CV：剩下管含有47.5 mL缓冲液A和2.5 mL缓冲液B。
  
  梯度1：40% B，两个CV：一根纱线管含有6 mL Buffer A 和 4 mL Buffer B。
  
  梯度2：50% B，两个CV：一支管含有5 mL Buffer A 和 5 mL Buffer B。
  
  梯度3：100% B，两个CV：纱线10 mL缓冲液B的管。
  
  使用前将其置于冰上或4°C下。
  
  注意：如果所有缓冲液都是冷的并且乳液保存在冰上，则洗涤和洗脱可以在之前进行。避免树脂变干。
6. 使用清洗1清洗树脂。收集删除物并将其标记为“W1”。
7. 重复洗涤 2 和洗涤 3。
8. 使用洗涤4（缓冲液A中含有5% v/v的缓冲液B）洗涤最后一次。将流通液保存为“W4”。
9. 使用洗脱液 1 洗脱 TFB2M。收集洗脱液并将其标记为“E1”。
10. 重复2和3。
11. 将硫酸液1、2和3合并在一起，并用分光光度计列出蛋白质浓度：
  
  6x-His-MBP-TFB2M：87.7 kDa 或 87,691 毫克/摩尔。
  
  摩尔消光系数：117,230 L (cm·M) ^-1（假设所有半胱氨酸都减少）。
  
  Abs 0.1% = 0.00134（假设所有cys均减少）。

过夜 TEV 安置
1. 使用合并梯度样品在 280 nm 处的吸光度提示 TFB2M 的量：
  
  TFB2M 概览（光谱仪读数）=_____mg/mL
  
  总体积 = ____ 毫升
  
  蛋白质概览=____mg（假设都是TFB2M）
  
  我们需要 1:25 TEV:TFB2M 的摩尔比
  
  TEV 的添加量 =_____mg
  
  TEV 预计原液的浓度 = _____mg/mL
  
  添加的TEV体积= _____mL。
2. 将 2 L 冰冷的 TEV 保温缓冲液添加到带标签的大棒搅拌的大烧杯中。
3. 将 TEV 添加到与镍树脂梯度的 TFB2M 的相同管中，轻微混合，然后转移到不锈钢管中（参见一般说明 9）。
4. 让水分在TEV内部缓冲液中在4°C下无菌19-20小时休眠，同时轻轻搅拌。
5. 通过比较初始化前 (~88 kDa) 和初始化后 (~43 kDa) 的 TFB2M 带大小，检查 10% 或 12% SDS-PAGE 存储器上 TFB2M TEV 接通的完成情况。如果切割完成，则继续下一步。如果没有，添加更多 TEV 并继续宿舍（图 6）。
  
  注意：MBP 标签 (42 kDa) 的大小与 TFB2M 相似，并且条带可能更强烈。我们实验室使用的密封 TEV 屏幕版本大小约为 26 kDa。
  
  图 6. 转录因子 B2，线粒体 (TFB2M) Ni-NTA 色谱。 (A) Ni-NTA #1、TEV 局部和 Ni-NTA #2 步骤的流程图。(B) TFB2M 表达的 SDS-PAGE、第一个 Ni-NTA 闭合步骤、TEV 过程以及 Ni-NTA #2 洗涤液中 TFB2M 的存在。

Ni-NTA 树脂 #2

注意：这是为了从切割的 TFB2M 中去除他的标记 TEV 胭脂和其他鳄鱼，该 TFB2M 现在缺少他的标记。TFB2M 将出现在流通液中，而不是上游液中（图 6A）。
1. 使用与上一相同的Ni-NTA柱，用5倍柱床体积的缓冲液B洗涤柱以除去所有结合的蛋白质，然后用缓冲液A洗涤以平衡柱。
2. 在将切片的TFB2M溶液应用到Ni-NTA树脂上之前，将缓冲液B添加到TFB2M溶液中，使咪唑浓度达到20 mM（与缓冲液A中的浓度相匹配）：
  
  （需要 20 mM 咪唑）（____ mL 内部的 TFB2M 样品）=（缓冲液 B 中含有 500 mM 咪唑）（需要 x mL 缓冲液 B）
  
  注意：引入少量（20 mM）咪唑可确保大部分 TFB2M 不会与树脂结合。其他蛋白质结合曼哈顿例如 His-MBP 标签和 His 标签的 TEV 氨基酸）将继续与 Ni-NTA 结合。
3. 将样品添加到Ni树脂中，并在4°C下轻轻摇动30分钟。
4. 收集含有TFB2M的流通液（或“洗涤液”），并运行10%或12% SDS-PAGE介质，以确保流通液中存在TFB2M（图6B）。
  
  注意：仍然与柱结合的是 His-MBP 标签和 His 标签的 TEV 箭头。请注意，His-MBP 标签的大小与未标记的 TFB2M（约 42 kDa）相似，并且其条带在文化上通常更强烈。

隔夜肝素栏
1. 在 FPLC 上清洗并平衡 5 mL HiTrap 肝素柱 (Cytiva)。
2. 用无盐肝素缓冲液稀释 TFB2M 样品（当前在 300 mM KCl 缓冲液中），相当于 75 至 150 mM KCl 之间的最终盐浓度。
  
  注意：盐越低，TFB2M与肝素柱的结合越多。在将TFB2M装载到柱上之前，请勿对其进行浓缩，否则会沉淀出来。
3. 使用这些设置运行：
  
  注意：HiTrap 肝素柱 (Cytiva) 的一根毛发柱体积 (CV) 为 5 mL。
  1. 样品施加：1 mL/min。
  2. 洗柱：0.5 mL/min（用于运行过夜）五个CV。
  3. 蛋白质洗脱：0.5 mL/min，收集2 mL级分。洗脱程序：
    
    10 CV 的 0–70% 梯度（总共 50 mL）
    
    一份简历 100%
  4. 用5个CV的水和5个CV的20% EtOH (1 mL/min)清洗色谱柱保存。
4. 收集馏分并在10%–12% SDS-PAGE上运行样品，增加哪些馏分含有TFB2M（图7B）。
  
  图 7. 凝血因子 B2，线粒体 (TFB2M) HiTrap 肝素色谱。 (A) 在 FPLC 上运行的 HiTrap 肝素柱洗脱相的色谱图，以及 (B) 对收集的级分进行 12% SDS-PAGE 分析。

TFB2M浓度
1. 将含有 TFB2M 分数的汇总在一起。
2. 使用素肝缓冲液A在离心机中平衡10K MWCO Amicon膜5分钟。
3. 开始以 2,500× g离心 TFB2M 样品，如果沉淀开始形成，则逐渐将速度降低至 1,300× g 。每 10 分钟停止离心机，用移液器轻轻上下移液 TFB2M 溶液以混合。如果您发现形成沉淀或溶液中的浓度没有增加，请停止浓缩。
4. 通过Protparam工具（https://web.expasy.org/protparam/）使用蛋白质序列中的这些参数测量并计算蛋白质浓度：
  
  TEV 穿越后的 TFB2M：43.405 kDa 或 43,405 毫克/摩尔。
  
  摩尔消光系数：49,390 L (cm*M) ^-1（假设所有半胱氨酸都减少）。
  
  Abs 0.1% = 1.138（假设所有cys均减少）。
5. 添加甘油甘油25%的最终浓度，将15 μL等分至低保留管中，在液氮中快速冷冻，并储存于-80 °C下（有关估计TFB2M样品中的盐浓度，请参见一般说明10）。

数据分析

为了评估蛋白质的强度，请在 SDS-PAGE 上蛋白质条带强度（参见下图 8A）。可以使用 Bio-Rad Image Lab 和 ImageJ 软件分析蛋白质条带强度。

图 8. POLRMT、TFAM 和 TFB2M 密封的验证。 (A) 密封的 POLRMT、TFAM 和 TFB2M 的 SDS-PAGE 分析。(B) 验证链条支架上的 POLRMT 活性。^{通过 POLRMT 催化活性进入 [α- 32} P] NTP来增加弱标记RNA的大小，产生15 nt RNA。(C) TFB2M活性在启动子(LSP)启动的精确测定中得到验证。随着3'-dCTP的大约进入，反应在19 nt处停止。游泳道是加载量不断增加的相同样品。

为了评估蛋白质的表达，可以使用抗His抗体进行蛋白质印迹。POLRMT可以在收缩后通过这种方式进行识别，因为它仍然保留其His标签。对于收缩后缺乏组氨酸标签的TFAM和TFB2M，执行上述TFAM功能测定并执行外部校正测定将确认蛋白质的活性。

协议验证

该协议用于用于初始初始测定的 POLRMT、TFAM 和 TFB2M，如图 5D 所示（Reardon 和 Mishanina，2022）。
POLRMT 活性通过在 Schwinghammer 等人于 2013 年设计的链接支架上进行极化调节（图 8B）来验证（论文中的补充图 1）。该测定表明 POLRMT 能够将添加的标记添加到起始 RNA 中中。
TFB2M 活性通过按照 Ramachandran 等人 2017 提出的方案（论文中的图 1）进行初始化调整启动测定（图 8C）来验证。该模板包含 mtDNA 的轻链启动子 (LSP) 序列，该序列需要 TFB2M和 TFAM 才能监测。

一般注意事项及故障排除

该描述了如何使用探针仪短缺细胞，但也可以使用法压壶。同样，可以使用蠕动泵代替FPLC来生成缓冲液梯度方案。
对于 POLRMT 表达：目标是防止细胞过灌溉。温度越低，菌落过夜生长的时间对应长，因此 25 °C 到 37 °C 之间的任何温度都可以。如果集落过度灌溉，生长将极其缓慢，很可能是因为 POLRMT 的渗漏表达对大肠杆菌细胞有毒。
同时还可以通过将 1 mL 记录物储存在 -80 °C 的 25% 甘油中来制备室温保存液。我们通常在冷冻前将 500 μL 记录物与 500 μL 50% 甘油酯涡旋。
较低的温度会减慢平移速度并促进蛋白质的正确折叠。为了冷却烧瓶，我们将烧瓶放在培养箱中摇动，同时冷却或将烧瓶放入大冰桶中。可以检查OD ₆₀₀，但在0.6-1.0范围内感应效果很好。
我们尝试改变方法，以更少的产量分获得更精炼的 POLRMT，但 POLRMT 最终很快沉淀出来，因此不建议这样做。
我们将 Amicon 过滤器中的 HisTrap 洗脱液浓缩至 25 mL（我们的步骤 10），因为 50 mL 是一个方便的体积，可以通过样品泵将其负载到 Bio-Rad NGC FPLC 上。如果您的系统可以处理您更大的上样体积，可以添加等体积的无盐肝素缓冲液并跳过浓缩步骤。
由于HisTrap缓冲液B含有300 mM NaCl，因此需要我们将盐浓度降低至与肝素缓冲液A中的盐浓度相同，从而POLRMT与肝素柱结合。肝素柱不会大幅度提高浓度，但会从蛋白质中取出内源结合的线索。
之前尝试进行缓冲液交换会导致 POLRMT 沉淀增加，因此不建议这么做。在蛋白质开始沉淀之前，我们通常将 POLRMT 浓缩至 6 或 7 μM。
透析的目的是从缓冲液中去除咪唑，咪唑会抑制TEV的染色活性。将盐浓度保持在300 mM KCl以上也很重要，以防止TEV染色。TEV缓冲液中溶解了EDTA，EDTA会抑制TEV。活性。
对于盐浓度可能成为问题的聚合下游实验任选：我们可以通过FPLC迹线TFB2M漂流时的％缓冲液B线导管封闭TFB2M的盐浓度，并根据缓冲液A的已知盐浓度进行计算和乙：

缓冲液 B 的百分比：_____

缓冲液 A %：100% - 缓冲液 B % = ____

收集的级分体积：____mL

缓冲液 B 的体积：分数体积 * % 缓冲液 B = _____mL

缓冲液 A 的体积：分数体积 * % 缓冲液 A = _____mL

B 的摩尔数 = 缓冲液 B 体积 (1.5 mol)/(1,000 mL)=x mol KCl

A 的摩尔数 = 缓冲液 A 体积 (0.200 mol)/(1,00 0mL)= x mol KCl

级分的盐浓度 = (A 摩尔数 + B 摩尔数)/(收集的级分体积 (mL)) × (1,000 mL)/(1 L) = x M 盐浓度

致谢

我们非常感谢 Smita Patel 博士（罗格斯大学）和她的实验室成员提供 POLRMT 和 TFAM 的表达以及本工作中使用的协议。我们要感谢 Miguel Garcia-Diaz 博士（石溪大学）提供 TFB2M 的表达这项工作得到了 UCSD 校长机构支持、王一南纪念转让的初级教员奖学金、TVM 的 R35GM142785、SSP 的 R35GM118086 的支持；NIH分子生物物理学培训补助金 (T32 GM008326) 给 AHH 和 JHM-C.；NIH 向 SDR 提供的生物结构和功能多学科分析培训补助金 (T32 EB009380) 该协议改编自之前的作品并在之前的作品中得到验证（Ramachandran 等人，2017 年；Reardon 和 Mishanina，2022 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争优势。

参考

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