材料与试剂

生物材料

果蝇 Canton-Special雌性，3-4 天龄

试剂

蔗糖（Fischer Scientific，目录号：15925）

酵母（Sigma-Aldrich，目录号：YSC2）

玉米粉（大道超市有限公司）

糖（大道超市有限公司）

D-葡萄糖（Qualigens，目录号：Q15405）

酵母提取物（Himedia，目录号：RM027）

丙酸（Qualigens，目录号：Q26955）

正磷酸（Qualigens，目录号：Q29245）

乙醇（Merck Millipore，目录号：100983）

琼脂（Qualigens，目录号：Q21185）

Tego-sept（Sigma-Aldrich，目录号：M1650000）

水（双蒸水）

解决方案

10% 蔗糖溶液（参见配方）

2% 蔗糖溶液（参见配方）

10% 酵母溶液（参见食谱）

玉米粉培养基（1 L）（参见食谱）

食谱

10%蔗糖（重量/体积）

试剂数量

蔗糖1克

水（高压灭菌双蒸水）10毫升

2%蔗糖（重量/体积）

试剂数量

蔗糖20毫克

水（高压灭菌双蒸水）1毫升

10% 酵母（重量/体积）

试剂数量

酵母500毫克

水（高压灭菌双蒸水）5毫升

玉米粉培养基（1 L）

试剂数量

玉米粉80克

D-葡萄糖20克

糖40克

以便8克

酵母抽提物15克

丙酸4毫升

正磷酸0.6毫升

自我七月1 g（溶于5 mL乙醇）

实验室用品

盖玻片 18 mm × 18 mm（Polar Industrial Corporation、Blue Star）

1 mL 注射器，附有尺寸为 0.30 mm × 8 mm 的针头，规格 30 G × 5/16（Hindustan Syringes and Medical Devices Ltd，型号：Dispovan U-40）

合成发刷（Camlin，目录号：2066774）

透明指甲油（Lakme Truewear，型号：CG012）

泡沫塑料盒（20厘米×14厘米×8.5厘米）

碎冰

聚苯乙烯泡沫塑料托盘（19厘米×16厘米×3厘米）

冷麻醉用玻璃瓶（8.5厘米高×2厘米直径）

金属（铝）板（直径10厘米）

计时器（West Bend，目录号：40005X）

1号滤纸（Indica，指示器，目录号：74039）

塑料盒尺寸 13 厘米 × 11 厘米 × 8 厘米

用于果蝇培养的塑料瓶，容量 250 mL（Bharat Plastic Manufacturing Company，目录号：FLBT-20）

脱脂棉（Prabhat Surgical Cotton Private Limited）

设备

体视显微镜放大倍数20×（10×目镜，2×物镜），数值孔径0.142（奥林巴斯，型号：SZ51）

显微操作器（Narishige Japan，型号：MM3）

具有受控温度 (21 °C) 和湿度 (60%) 的行为室或室

软件

GraphPad Prism v8.4.2

程序

飞行准备

在 250 mL 塑料瓶中，在 25 °C 温度、60% 相对湿度和 12:12 小时光/暗循环下，在含有 15-20 mL 介质的标准玉米粉介质中饲养苍蝇。每 2-3 天转移一次成蝇，以防止介质拥挤和浸湿。

将新鲜饲养的任何性别的苍蝇（可能是 3-4 天大）收集到新鲜培养基瓶中，使每个瓶子有 20-30 只苍蝇。在 25 °C、60% 湿度和 12:12 小时光/暗循环下，老化时间为 3-4 天。

注意：如果培养基干燥并开始与瓶壁分离或细菌或真菌生长水平较低，则不认为该培养基是新鲜的。

饥饿蝇在含有湿滤纸的空玻璃瓶中在 25°C、60% 湿度和 12:12 小时光/暗循环下放置 20-24 小时（图 1A）。

图 1. 用于长鼻延伸反射测定的果蝇的准备。(A) 用湿滤纸将苍蝇在小瓶中饥饿过夜。(B) 苍蝇在冰上麻醉不超过 1 分钟。(C) 小瓶中麻醉的苍蝇。(D) 将麻醉的苍蝇转移到冰上保存的金属板上。(E) 将金属板上的单只麻醉苍蝇背侧朝上，以便使用指甲油粘在盖玻片上。(F)、(G) 苍蝇腹侧朝上粘在盖玻片上。(H) 用于将苍蝇固定在盖玻片上的注射器上指甲油滴的大小。(I) 将苍蝇放在加湿室中 1-2 小时以恢复。(J) 含有 10% 蔗糖的注射器，用于适应，安装在显微操作器上。

为了麻醉饥饿的苍蝇，首先将空玻璃瓶放入装满冰的泡沫塑料盒中冷却。5 分钟后，将饥饿的果蝇转移到现已冷的小瓶中。要转移苍蝇，轻拍装有苍蝇的小瓶，使它们到达小瓶底部，然后快速将该小瓶翻转到冷的空小瓶上。将两个小瓶敲在一起，使所有苍蝇都转移到冷小瓶中。

轻轻拍打橡胶垫上的冷小瓶，将苍蝇带到小瓶底部，然后将小瓶放回冰中再放置一分钟，直到所有苍蝇都麻醉（图 1B、1C）。

将金属板放在装满冰的泡沫塑料托盘上，并用滤纸擦拭以除去冷凝水。轻轻地将麻醉的苍蝇转移到冰上的金属板上。在将苍蝇转移到板上之前或之后，每当板上有水凝结时，请反复擦拭板，以确保板干燥。只保留雌性苍蝇并丢弃所有雄性苍蝇。雄性和雌性果蝇是根据标准的性二态性特征来区分的，例如雄性腿部性梳、雄性生殖器和雌性腹部色素沉着。使用精细的合成毛刷，将苍蝇的背侧向上（图1D，1E）。值得注意的是，果蝇在冰上（包括在小瓶中和金属板上）的总时间不应超过 5 分钟，因为这会影响它们的反应。

使用 1 mL 注射器针头（图 1H）取少量透明指甲油 (~1 μL)，并将液滴放在盖玻片上。轻轻地将盖玻片放在飞行中，使指甲油接触头部的后部和胸部的前部。这样做是为了在执行 PER 时头部不会移动。同样重要的是在盖玻片上只使用一小滴指甲油，这样在固定苍蝇时它就不会到达长鼻或腿（图1F，1G）。指甲油中偶尔会出现小气泡，但这并不影响苍蝇在盖玻片上的固定。请注意，所有这些需要麻醉苍蝇的步骤都是在金属板上进行的。

将固定在盖玻片上的苍蝇（腹侧朝上方向，使长鼻和腿暴露在刺激下）放入盒子中 1-2 小时，以便在 25°C 下恢复。盒子内衬有湿滤纸，因为带有苍蝇的盖玻片位于底部，以保持内部湿度（图1I）。通过轻轻地将带有固定苍蝇的盖玻片放入盒中来手动转移苍蝇。放入盒子中的苍蝇数量取决于盒子的大小。当前研究中提到的尺寸的盒子最多可容纳 15-20 只苍蝇，这样可以避免拥挤和重叠。苍蝇的最小数量可以由用户确定。

蔗糖诱导的 PER 的适应

填充三个 1 mL 注射器：一个装有 2% 蔗糖溶液，一个装有 10% 蔗糖溶液，第三个装有双蒸水。将 1 mL 注射器与 10% 蔗糖溶液固定在提供的插槽中的显微操作器上（图 1I）。

轻轻地拿起带有固定苍蝇的盖玻片并将其放在立体镜下。使用装有双蒸水的注射器，用水接触苍蝇的喙或跗骨，如视频1所示。让苍蝇通过喙喝水，直到它停止并吃饱为止。给果蝇喂水 1-2 次后，果蝇就吃饱了。如果苍蝇对水没有反应，请考虑将苍蝇用于实验并测试对蔗糖的原始反应，如步骤 B3 中所述。

注意：偶尔的苍蝇即使被喂水 3 次或以上，也可能不会停止喝水；丢弃此类苍蝇。

视频1.水饱和度。最初，给苍蝇喂水。如果苍蝇伸出它的喙，就会给它提供水来满足它，直到它对水不再有反应。

给苍蝇喂水后，立即用含有 2% 蔗糖的注射器用蔗糖滴小心地触摸前腿跗节的远端，同时防止与长鼻发生任何接触。记录是否有长鼻响应。重复此步骤五次，每两次试验之间间隔 10 秒（视频 2）。

视频 2. 长鼻伸展反射 (PER) 对 2% 蔗糖的反应。实时视频显示前腿跗骨被 2% 蔗糖刺激五次，试验间隔 10 秒，以量化暴露于习惯性刺激之前和之后的 PER 反应。

使用显微操作器上附有的旋钮在 XY 和 Z 平面上移动注射器，调整固定在显微操作器上的含有 10% 蔗糖的注射器的角度和高度，使注射器上悬挂的蔗糖滴超出伸出范围。长鼻，仅接触前腿的远端（视频 3）。将注射器保持在这个位置，接触跗骨，持续 10 分钟，设置计时器。如果蔗糖滴的尺寸因蒸发而变小，请小心按压注射器的柱塞并重新调整尺寸。步骤 B3 后立即将果蝇暴露于 10% 蔗糖。

视频 3. 暴露于习惯性刺激。将果蝇的跗节暴露于 10% 蔗糖中 10 分钟，以适应 PER 反应。该视频具有代表性，显示 10 分钟曝光后的 12 秒。将含有 10% 蔗糖的注射器固定在显微操作器上，这样只有跗骨受到刺激，而长鼻无法到达刺激物。

10 分钟后，将 10% 蔗糖注射器移到一边，并在蔗糖暴露后立即用双蒸水清洗跗骨尖端（视频 4）。

视频 4. 接触 10% 蔗糖后清洗腿部。用双蒸水清洗跗骨，以清除可能粘在腿上的 10% 蔗糖。

洗腿后立即重复步骤 B3 以记录习惯反应。记录所有数据。在习惯的苍蝇中，响应 2% 蔗糖而伸出长鼻的次数应该减少（视频 5）。

视频 5。接触蔗糖后的反应。暴露于10%蔗糖10分钟后，用2%蔗糖刺激睑板不会导致PER反应，从而表现出习惯。

使用酵母进行去习惯化

使用 1 mL 注射器用 10% 酵母溶液接触习惯苍蝇的长鼻，并快速取出注射器，以防止或最大程度地减少酵母的潜在消耗（视频 6）。重复此过程 1 分钟，设置计时器，间隔约 10 秒，以便用酵母刺激长鼻 5-6 次。

视频 6. 10% 酵母诱导的去习惯/习惯覆盖。将 10% 酵母放入长鼻五次，以使苍蝇失去习惯。酵母被快速去除以防止摄入。

让苍蝇在没有任何刺激的情况下停留 1 分钟，以便它有时间自我梳理，以去除任何粘附的酵母。

如前所述，在酵母暴露的苍蝇中记录对 2% 蔗糖的长鼻延伸反应。果蝇应该表现出增强的（不习惯的）反应。

图 2 总结了诱导对蔗糖的适应及其使用 10% 酵母的替代的过程。

图 2. 表示协议的线图。该图显示了协议中的各个关键步骤，使果蝇习惯于蔗糖，并通过向长鼻提供 10% 酵母来覆盖它。该图还显示了有时限步骤的时间段。

数据分析

对于每只苍蝇，使用简单的公式计算响应五次跗骨刺激的长鼻延伸百分比 = [观察到的长鼻延伸总数/5] × 100。

总共需要 25-30 只果蝇才能达到统计显着性。因此，可能需要 2-3 个瓶子，每个瓶子装有 20-30 只苍蝇，才能获得 25-30 只雌性苍蝇，并在实验中进行测试。由于数据是配对的，因此所有条件都有相同数量的果蝇。考虑前五次跗骨刺激的 PER 反应。避免更多的刺激，以防止因习惯而导致反应减弱。使用 GraphPad Prism v8.4.2 将在不同条件下观察到的所有苍蝇中观察到的 PER 响应数据绘制为条形图，表示平均百分比 PER 与 SEM 误差条和覆盖在其上的单个苍蝇数据点。

注意：仅比较在初次、习惯和去习惯条件下观察到的 2% 蔗糖的 %PER 响应。数据分析时不考虑暴露于 10% 蔗糖 10 分钟期间的 PER 反应。

由于其离散性质，数据不是正态分布的，因此不需要正态性检验。弗里德曼检验是一种非参数检验，随后是邓恩的事后检验，用于评估幼稚、习惯和不习惯反应之间的差异。要在 GraphPad Prism 软件中执行 Friedman 测试，请执行以下步骤：

在结果部分中，选择新分析。

在“列分析”部分下，选择单向方差分析（非参数或混合）并勾选需要分析的列。

将打开一个新窗口。在“实验设计”下的选项卡中，选择“每行代表匹配或重复的测量、数据”。

在“假设残差的高斯分布”选项下选择“否”，使用非参数检验。

在“多重比较”选项卡下，选择将每列的平均值与其他列进行比较。在比较进食果蝇和饥饿果蝇之间（图 3A1）以及蔗糖和水之间（图 3A2）之间的 PER 响应时，使用曼惠特尼 U 检验。按照 3a 到 3d 的步骤进行操作，但在Column Analysis下，您应选择t 检验（和非参数检验）选项。

如果在测试幼稚反应时，苍蝇将长鼻伸到 2% 蔗糖的位置少于五分之三，则丢弃苍蝇。

表 1 显示了对 2% 蔗糖的初始 PER 反应、接触 10% 蔗糖 10 分钟后的习惯反应、以及在 30 只Canton S果蝇中测试的 10% 酵母溶液后的 PER 反应的原始数据。图 3B 显示了具有各个数据点的代表性数据条形图。该协议之前已被证明可以调解和克服习惯（Trisal 等人，2022 年的图 2B）。对喂食和饥饿、年龄和密度匹配的 CS 果蝇对 2% 蔗糖的 PER 反应进行分析表明，PER 是由蔗糖特异性诱导的（图 3A1）。此外，水饱的果蝇对水没有反应，而用蔗糖刺激时观察到 PER，进一步证实 PER 是蔗糖所特有的（图 3A2）。

图 3. 使用新型酵母刺激物来克服习惯。(A1) 对照实验显示喂食和饥饿果蝇的长鼻伸展反射 (PER) 反应。PER 反应特定于 2% 蔗糖，因为与饥饿的果蝇相比，喂食的果蝇表现出明显较低的反应（Mann Whitney U stat = 159，***p < 0.0001）。(A2) 饱水果蝇对蔗糖和水的 PER 反应的比较。果蝇将其喙伸至 2% 蔗糖，当进一步提供水时未观察到这种情况，证实 PER 是蔗糖所特有的（Mann Whitney U stat = 194.5，***p < 0.0001。（B）提供 2% 蔗糖溶液对Canton S果蝇的跗骨毛产生长鼻延伸反应。PER 反应显示在暴露于 10% 蔗糖 10 分钟后显着降低，在提供 10% 酵母溶液后可显着覆盖（弗里德曼统计 = 42.70，** *p < 0.0001，**p = 0.0072，Dunn 的多重比较事后检验）。三角形代表单个数据点，而条形代表平均值±SEM（误差条）。

表 1. 根据五次刺激计算得出 30 只幼稚果蝇、习惯果蝇或去习惯果蝇个体果蝇的平均 %PER 至 2% 蔗糖

幼稚反应（% PER）习惯反应（% PER）酵母暴露后的反应（% PER）

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协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：

特里萨尔等人。（2022）。果蝇的习惯覆盖电路。神经科学杂志（图 2，B 组）。

一般注意事项和故障排除

安装的果蝇必须健康、未受损且具有强大的 PER 能力，然后才能用于实验。因此，在协议部分 B，步骤 3 中，我们丢弃对 2% 蔗糖五次连续跗骨刺激反应少于三倍的任何苍蝇。如果批次中大部分果蝇对 2% 蔗糖没有反应或无法适应，请确保果蝇饥饿 20-24 小时，不拥挤，并且在冰上放置的时间不超过 5 分钟。当按照协议部分 C 步骤 1 使用 10% 酵母使苍蝇失去习惯时，请确保苍蝇不会消耗大量酵母。在协议部分 B 第 2 步中，丢弃不停止饮水的苍蝇，因为此类苍蝇可能会受到某种程度的损坏。

致谢

我们感谢 Marcia Aranha、Camilla Roselli、Ankita Chodankar 以及 Ramaswami 和 VijayRaghavan 实验室的成员提供的建议、支持和有用的讨论，特别是 Pushkar Paranjpe 在建立 PER 测定时提供的早期帮助。我们感谢 Spraha Bhandari 自愿测试并确认该协议足以让新研究人员成功观察和记录 PER、其对蔗糖的习惯以及酵母诱导的覆盖。Paranjpe 等人先前描述了该协议。(2012) 和 Trisal 等人。（2022）。这项工作得到了 Wellcome Trust 调查员奖和爱尔兰科学基金会调查员计划对 MR 的资助，国家生物科学研究中心（塔塔基础研究所）对 KVR 的核心支持，以及 CSIR 研究生奖学金和 Biocon-圣三一奖学金。

利益争夺

作者声明不存在竞争的经济利益。

参考

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