材料与试剂

1.马铃薯葡萄糖肉汤（ Difco ，目录号：254920）
2.琼脂粉（ Duksan ，目录号：601）
3.AccuPower ® Taq PCR 预混料（ Bioneer ，目录号：20-K-2602）
4.无核酸酶水（Sigma-Aldrich，目录号：7732-18-5）
5.底漆：
ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′
EF1T: 5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′
EF2T: 5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′
6.SeaKem ® LE 琼脂糖（Lonza，目录号：50004）
7.RedSafe核酸染色溶液（ iNtRON ，目录号：21141）
8.Tris 超纯 ( Duchefa Biochemie ，目录号：T1501.1000）
9.乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：E5134-50G）
10.冰醋酸（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1748）
11.6× 加载缓冲器（Takara，目录号：9156）
12.100 bp Plus DNA 梯子（ Bioneer ，目录号：D-1035）
13.乙醇 EMSURE ACS、ISO、 Reag 。 PH Eur （1 L）（Merck Millipore，目录号：1.0098.1011）

解决方案

1.培养基 (PDA)（参见食谱）
2.50× TAE 缓冲液 (1 L)（参见配方）
食谱

1.培养基(PDA)
试剂最终浓度数量
马铃薯葡萄糖肉汤24克/升24 G
琼脂粉末10克/升10 G
水分子_不适用上_ 到 1 L

2.50 × TAE 缓冲液（1 L ）
*注：添加特里斯将超纯和 EDTA 二钠盐二水合物溶解到约 700 mL H 2 O中并搅拌直到溶解。小心添加醋酸酸并将体积调整至 1 L。
试剂最终浓度数量
Tris超纯2M _第242章 G
冰川期醋酸酸1 中号57.1 毫升
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物50 毫米18.61 G
水分子_不适用上_ 到 1 L

实验室用品

1.移液器吸头（1,000、200、10 μL ），不含 DNase、RNase、DNA 和内毒素（Neptune）
2.佩特里盘子（ 90毫米×15毫米）（声压级，目录数字 10090)
3.1 .5 mL 微管（ Axygen ，目录号：MCT-15-C）
4.MEGAquick-spin TM Plus 总片段 DNA 纯化试剂盒（ iNtRON 、目录数字： 17290)

设备

1.移液器（0.5 – 10 µL , 2 – 20 µL , 20 – 200 µL , 100 – 1,000 μL ）（Eppendorf，型号：Research Plus® ）
2.微型微量离心机（ Labogene ，目录号：LZ-1312）
3.Vortex Genie 2（Scientific Industries，目录号： SI-0256 )
4.MiniAmp TM热循环仪（Applied Biosystem s ，目录号：A37834 ）
5.凝胶托盘 L （宝，目录数字：公元210年）
6.PowerPac TM基本电源（Bio- R ad、目录数字： 1645050)
7.凝胶成像系统MaXidoc G2（DAIHAN Scientific，目录号：DH.WGD00300）
8.N anoDrop 2000（ Thermo Scientific，目录号：ND-2000）

程序

A.真菌培养物的制备

1.将含有真菌菌丝体的琼脂塞转移到 PDA 板上。
2.将琼脂板在 25°C 下孵育五天。

B.直接PCR扩增

1.对于 20 μL反应体积，将 0.5 μL每种引物 (20 μM ) 添加到AccuPower ® Taq PCR Premix 管中。
2.为了溶解真空干燥的预混合物，将 19 μL无核酸酶水添加到 PCR 管中。
3.使用移液器尖端轻轻刮擦真菌培养物以收集少量菌丝体（图1）。

图 1. 用于直接 PCR 的菌丝体收集。使用移液器和 10 μL移液器吸头收集禾谷镰刀菌的气生菌丝。为了清晰起见，放大了移液器尖端的远端部分。比例尺 = 500 μm 。

4.将收集的菌丝体转移到反应混合物中。剧烈涡旋 PCR 管，然后短暂离心以沉淀内容物。
5.对于热休克反应，将 PCR 管放入热循环仪中并设置程序（95°C 3 分钟，然后冷却至 25°C）。
6.程序结束后，立即将 PCR 管转移至冰浴中 1 分钟。
7.将样品剧烈涡旋 15 秒，然后在冰上再冷却 15 秒。
8.重复步骤 B7 两次。
9.短暂离心反应混合物以收集底部的所有内容物，然后将 PCR 管放回热循环仪。
10.使用以下程序设置热循环仪：
a.95°C 初始变性 1 分钟。
b.95°C 变性 30 秒。
c.56°C（根据底漆规格调整温度）退火1分钟。
d.72°C 延伸（根据预期扩增子大小调整时间）1 分钟。
e.重复步骤 b–d 40 个周期（根据我们的结果，40 个周期比 30 个周期更优化）。
f.最后在 72 °C 下延伸 3 分钟。
g.在 4°C 下保持 5 分钟。

C.凝胶电泳

1.凝胶制备：
a.称取 2.25 克琼脂糖粉末。
b.微波炉（避免过度沸腾）将琼脂糖粉末完全溶解在 150 mL 的 1× TAE 缓冲液（参见配方）中，制成 1.5% 琼脂糖凝胶（w/v）。
c.添加7.5 µL RedSafe核酸染色液并充分混匀。
d.用梳子将溶解的琼脂糖溶液倒入凝胶托盘中。
e.让倒入的凝胶在室温下完全固化 20 – 30 分钟。
2.加载样本并运行：
a.向每个 PCR 产物添加 6× 上样缓冲液。
b.将固化的琼脂糖凝胶放入电泳装置中，并将其完全浸入 1× TAE 缓冲液中。
c.小心地将样品和 100 bp Plus DNAladder 装入凝胶孔中。
d.将PowerPac TM基本电源在 100 – 120 V 下运行 30 – 40 分钟（根据凝胶浓度和 PCR 产物大小调整电压和运行时间）。
e.凝胶运行后，小心地从装置中取出凝胶，并将其置于紫外光装置下以可视化 DNA 片段。

D.纯化和测序

1.要纯化 DNA 样品，请使用MEGAquick-spin TM Plus 总片段 DNA 纯化试剂盒，并按照试剂盒提供的方案进行操作。
2.将50 μL PCR 产物转移至 1.5 mL 微量离心管中，并添加 2 50 μL琼脂糖凝胶裂解缓冲液（包含在 DNA 纯化试剂盒中）。涡旋混合均匀。
3.将旋转柱插入收集管中。
4.将样品混合物转移至旋转柱并以 11,000 ×离心 g 30 秒。
5.D丢弃流出液。
6.将750 μL添加乙醇的洗涤缓冲液（包含在试剂盒中）加入旋转柱中，然后以 11,000× g离心30 s。
7.D丢弃流出液。
8.C再次13,500 ×离心 g 3 分钟以干燥柱基质。
9.将旋转柱放入新的 1.5 mL 微量离心管中。
10.将 20 – 40 μL洗脱缓冲液（包含在试剂盒中）添加到旋转柱的膜中心，并等待 3 分钟。
11.C 13,500 ×离心 g 1 分钟以洗脱 DNA。
12.NanoDrop 2000测量 DNA 浓度并将样品提交给测序服务中心。

数据分析

DNA 序列用于对 NCBI GenBank 数据库进行 BLAST 搜索以进行物种鉴定。

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•全杰恩等人。（2023）[4]。应用直接 PCR 对从水稻种子中分离的Fujikuroi镰刀菌复合体进行系统发育分析。植物科学前沿（图 1、2 和 3）。

一般注意事项和故障排除

1.添加的菌丝体量会对 PCR 结果产生显着影响。始终确保仅将少量菌丝体添加到 PCR 混合物中。引入过多的菌丝体可能会导致反应阻塞和潜在的失败（图 2）。

图 2. 菌丝体数量对直接 PCR 效率的影响。使用直接 PCR 方法对禾谷镰刀菌菌株 Z-3639 的TEF-1α区域进行扩增。不同菌丝体数量对PCR效率的影响如下：PC：阳性对照（使用提取的基因组DNA），NC：阴性对照（无模板对照），S：少量菌丝体（如图1所示），M：中等量(S的2倍)、L：大量(M的2倍)。

2.虽然可以使用各种 PCR 酶进行直接 PCR，但我们强烈建议使用 Taq PCR Premix。该预混物包含反应所需的所有成分（包括聚合酶、dNTP、反应缓冲液和上样染料），模板 DNA 和引物除外。我们的观察表明，与其他 PCR 酶相比，Taq PCR Premix 的成功率明显更高。此外，Taq PCR 预混液中上样染料的存在改善了添加菌丝体的可视化，从而更容易验证菌丝体数量。
3.毛霉菌门）的样品测试了 ITS 区域的直接 PCR 扩增。我们的方法显示出高达 92% 的 PCR 成功率（37 种真菌中的 34 种）。尽管如此，直接 PCR仍未扩增毛霉、黑曲霉和巴西曲霉这三个物种的 ITS 区域。值得注意的是，这些真菌表现出高度疏水性的菌丝体和孢子，这可能抑制 PCR 混合物内的细胞裂解。
4.除了 ITS 之外，还使用直接 PCR 方法成功扩增了 TEF-1α 区域和其他基因型标记，以鉴定Fujikuroi镰刀菌复合体中的菌株。
5.如果 PCR 效率较低，请考虑增加热激步骤后涡旋的持续时间。
6.建议在每个实验中加入含有分离基因组 DNA 的反应作为阳性对照。另外，始终有一个无模板控件。当需要进行故障排除时，这种方法可以提供有价值的见解。

致谢

这项工作得到了韩国国家研究基金会 (2022R1I1A1A01065138) 和韩国农业、食品和农村事务部 (MAFRA) 资助的农业和食品微生物组战略倡议以及农作物病毒和害虫反应产业技术开发计划的支持（编号321101-03）。图形概述中的卡通是使用 BioRender.com 创建的。该协议改编自 Jeon 等人之前的研究。（2023）[4]。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1.Saiki, RK、Scharf, S.、Faloona, F.、Mullis, KB、Horn, GT、Erlich, HA 和 Arnheim, N. (1985)。 β-珠蛋白基因组序列的酶促扩增和限制性位点分析用于诊断镰状细胞性贫血。科学230（4732）：1350–1354。 doi：10.1126/science.2999980
2.Saiki, RK、Gelfand, DH、Stoffel, S.、Scharf, SJ、Higuchi, R.、Horn, GT、Mullis, KB 和 Erlich, HA (1988)。使用热稳定性 DNA 聚合酶进行引物引导的 DNA 酶扩增。科学239（4839）：487-491。 doi：10.1126/science.2448875
3.Schoch, CL、Seifert, KA、 Huhndorf , S.、Robert, V.、Spouge, JL、Levesque, CA、Chen, W.、 Bolchacova , E.、Voigt, K.、Crous, PW 等。（2012）。核核糖体内部转录间隔区 (ITS) 区域作为真菌的通用 DNA 条形码标记。过程。国家。阿卡德。科学。美国109(16)：6241–6246。 DOI：10.1073/pnas.1117018109
4.Jeon, H.、Kim, JE、Yang, JW、Son, H. 和 Min, K. (2023)。应用直接 PCR 对从水稻种子中分离的Fujikuroi镰刀菌复合体进行系统发育分析。正面。植物科学。 13：e1093688。 DOI：10.3389/fpls.2022.1093688
5.鲍曼，SM 和弗里，SJ (2006)。真菌细胞壁的结构和合成。生物论文 28（8）：799-808。 doi：10.1002/bies.20441
6.Gow, NAR、 Latge , JP 和 Munro, CA (2017)。真菌细胞壁：结构、生物合成和功能。微生物。频谱5(3)：efunk-0035-2016。 doi：10.1128/microbiolspec.funk-0035-2016
7.Leslie, JF 和 Summerell, BA镰刀菌实验室手册。艾姆斯，IW，美国：布莱克威尔出版社。号码：10.1002/9780470278376
8.Ling, M.、Merante, F. 和 Robinson, BH (1995)。一种快速可靠的 DNA 制备方法，用于通过聚合酶链式反应筛选大量酵母克隆。核酸研究。 23（23）：4924-4925。 doi：10.1093/nar/23.23.4924
9.AlShahni , MM、Makimura, K.、Yamada, T.、Satoh, K.、Ishihara, Y.、 Takatori , K. 和 Sawada, T. (2009)。使用Ampdirect ® Plus对几种医学上重要的真菌进行直接菌落 PCR 。日本。 J.感染。迪斯。 62（2）：164-167。 doi：10.7883/yoken.jjid.2009.164
10.Walch, G.、Knapp, M.、Rainer, G. 和 Peintner, U. (2016)。菌落 PCR 是一种快速扩增丝菌 DNA 的方法。真菌杂志2(2): 12. doi: 10.3390/jof2020012
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