材料与试剂

生物材料

斑马鱼（斑马鱼）

试剂

TRIzol TM试剂（Invitrogen，目录号：15596026）

氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）

异丙醇（2-丙醇）（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）

无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：1.07017）

来自Trametes versicolor的 β-葡聚糖肽（Invivogen，目录号：tlrl-bgp）

全葡聚糖颗粒（可溶性，β-葡聚糖对照）（Invivogen，目录号：tlrl-wgps）

甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M0512）

酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P3532）

三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：A5040）

磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Gibco，目录号：10010023）

超纯水（Invitrogen，目录号：10977015）

米利Q水

矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）

1-苯基-2-硫脲（PTU）（Sigma-Aldrich，目录号：P7629）

iScript TM cDNA 合成试剂盒（Bio-Rad，目录号：1708891）

PerfeCTa SYBR Green FastMix 与 ROX（Quanta Biosciences，目录号：95055-500）

1 M Tris (pH 9)（Thermo Scientific，目录号：J62085-K2）

KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）

CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）

MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：208094）

氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）

RT qPCR 引物 — 用超纯水 (IDT) 稀释 10 μM（表 1）

表 1. RT qPCR 引物序列

基因向前 (5′ – 3′) 反向 (5′ – 3′)

解决方案

E3（胚胎培养基）（参见食谱）

三卡因（参见食谱）

75% 乙醇（参见配方）

β-葡聚糖原液（参见食谱）

β-葡聚糖对照原料（参见食谱）

β-葡聚糖注射混合物（参见配方）

0.5% 酚红（参见配方）

3% 甲基纤维素（参见配方）

iScript 反应混合物（参见配方）

PerfeCTa SYBR Green FastMix 与 ROX 混合物（参见配方）

食谱

E3（胚胎培养基）（1×）

试剂最终浓度数量

氯化钙2 0.33毫米 36.6毫克

硫酸镁4 0.33毫米 39.7毫克

氯化钾 0.17毫米 12.7毫克

氯化钠 5毫米 292.2毫克

米利Q水不适用最多 1 升

全部的不适用 1升

三卡因

试剂最终浓度数量

三卡因不适用 400毫克

1 M Tris (pH 9) 20毫米 2毫升

米利Q水不适用 98毫升

全部的不适用 100毫升

注意：通过适当添加酸或碱调节至中性 pH，直至溶液 pH 为 7。在胚胎培养基中稀释至 4.2% (v/v)。

75%乙醇

试剂最终浓度数量

乙醇（绝对） 75% 37.5毫升

超纯水不适用 12.5毫升

全部的不适用 50毫升

β-葡聚糖肽原液

试剂最终浓度数量

β-葡聚糖肽 5毫克/毫升 5毫克

公共广播公司不适用 1毫升

全部的不适用 1毫升

β-葡聚糖对照原料

试剂最终浓度数量

对照 β-葡聚糖（全葡聚糖肽，可溶） 5毫克/毫升 5毫克

公共广播公司不适用 1毫升

全部的不适用 1毫升

β-葡聚糖注射液（一项实验）

试剂最终浓度数量

5 mg/mL β-葡聚糖肽（或对照） 4毫克/毫升 8微升

0.5%酚红 0.1% 2微升

全部的不适用 10微升

注意：在每个实验日保持新鲜的注射混合物。丢弃未使用的混合物。

0.5%酚红

试剂最终浓度数量

酚红 0.5% 0.5克

公共广播公司不适用 100毫升

全部的不适用 100毫升

注意：适当添加酸或碱调节至中性 pH，直至溶液 pH 为 7。

3%甲基纤维素

试剂最终浓度数量

甲基纤维素 3% 30克

E3 不适用最多 1 升

全部的不适用 1升

注意：在室温下在定轨摇床上摇动长达一周以溶解。

iScript cDNA 合成反应混合物（1 个反应）

试剂最终浓度数量

核糖核酸不适用 500 纳克（1–15 微升）

iScript 5× 反应缓冲液 1× 4微升

iScript 逆转录酶不适用 1微升

超纯水不适用至 20 μL

全部的不适用 20微升

PerfeCTa SYBR Green FastMix 与 ROX 混合物（一种反应）

试剂最终浓度数量

cDNA（1:5稀释）不适用 1微升

正向引物 (10 μM) 300纳米 0.3微升

反向引物 (10 μM) 300纳米 0.3微升

2× FastMix 解决方案 1× 5微升

超纯水不适用 2.4微升

全部的不适用 10微升

实验室用品

薄壁硼硅酸盐毛细管（Warner Instruments，目录号：64-0778）

小培养皿（60毫米×15毫米）（康宁，目录号：430166）

培养皿（150 mm × 25 mm）（Corning，目录号：430599）

1.5 mL 管（Axygen，目录号：MCT-175-C）

0.2 mL PCR 管（Axygen，目录号：PCR-0208-CP-C）

Dumont #55 镊子（精细科学工具，目录号：11295-51）

3 mL 移液管（Biologix，目录号：30-0138）

384孔板（Applied Biosystems，目录号：4309849）

Microloader 移液器吸头（0.5–20 μL）（Eppendorf，目录号：EP5242956003）

1 mL Luer-Lok 注射器（BD Biosciences，目录号：309628）

27 G 针（0.5 英寸）（BD Biosciences，目录号：301801）

设备

离心机，2 mL 管转子（Eppendorf，目录号：EPP2232000060）

培养箱（设置为 28 °C）（Sanyo，目录号：MIR-162）

显微镜载物台千分尺（0.01 mm）（ProSciTech，目录号：S81K）

体视显微镜（尼康，型号：SMZ1500）

微量移液器拉拔器（Sutter Instruments Co.，火焰/棕色拉拔器设置为：热 680、拉力 75、速度 40、时间 55、压力 530，以产生锥形针）

显微操作器（World Precision Instruments，目录号：M3301R）

Quantstudio 6 Flex 实时 PCR 系统 (Thermo Fisher Scientific)

Mastercycler Nexus 热循环仪 Eco (Eppendorf)

Nanodrop（Thermo Scientific，目录号：13-400-518）

软件和数据集

Excel（微软）

Prism v9 (GraphPad)

程序

斑马鱼幼虫的显微注射

获得适当阶段的斑马鱼。

通过 3-5 对斑马鱼自然产卵收集卵。将不同繁殖对的窝分开，以便从生物复制中收集数据。每对繁殖对收集 30-50 个蛋。

将新鲜产下的鸡蛋放入装有 E3 培养基的干净的 150 mm × 25 mm 培养皿中。

在立体显微镜下观察新鲜受精卵。从培养皿中取出死卵（绒毛膜内的黑色凝固物质）和任何其他碎片（鱼排泄物、鱼鳞）。

将鸡蛋放入 28°C 培养箱中并放置过夜。在整个研究过程中，斑马鱼都是在黑暗的培养箱中饲养的。

受精后 24 小时 (hpf)，在立体显微镜下观察胚胎并去除死亡或发育不良的胚胎。参考斑马鱼发育图来评估发育阶段，例如 Kimmel 等人。（1995）。如果需要透明度，请补充 0.003% PTU 的胚胎培养基。

将胚胎放入 28°C 培养箱中并培养直至其达到 2.25 dpf/54 hpf。

如果未孵化，请去除绒毛膜。使用锋利的镊子刺破并剖开绒毛膜并取出胚胎。

将 β-葡聚糖输送到胚胎中。

注意：该方案描述了一种“双注射”方法，其中胚胎/幼虫用 β-葡聚糖注射两次，一次在 2.25 dpf (54 hpf)，另一次在 3 dpf (72 hpf)，因为两次注射比一次注射产生更强的反应。单次注射，如 Darroch 等人所述。（2022）。

通过在胚胎培养基中添加 4.2% (v/v) 三卡因，以 2.25 dpf (54 hpf) 的速度麻醉 15-20 个胚胎。等待 20-30 秒。

用移液管轻轻接触胚胎。如果它们不抽搐或游走，则表明它们已被充分麻醉。

将少量（大约 1 mL）3% 甲基纤维素倒入 60 mm × 15 mm 培养皿中。使用总长度缩短至 2 厘米的微装载移液器吸头，在培养皿周围移动甲基纤维素，直到它以薄而均匀的层覆盖培养皿。

通过旋转板将胚胎汇集到培养皿的中间。使用移液管拾取胚胎。垂直握住移液管，等待胚胎沉淀在尖端。将一或两滴胚胎放在甲基纤维素包被的培养皿的一侧。

使用缩短的微型装载机尖端，将胚胎在培养皿内逐个排列成一条直线。将胚胎横向排列，后脑朝右（图 1A、1B 和 1D）。

图 1. 将 β-葡聚糖显微注射到斑马鱼胚胎的循环中。(A) 显示注射设置的照片。(B) 照片显示胚胎排列在培养皿中，显微注射针就位。(C) 0.01 毫米显微镜载物台载玻片千分尺的图像。黑色圆圈表示将输送 1 nL 溶液的注射推注量。(D) 排列在 3% 甲基纤维素中的 2.25 dpf (54 hpf) 胚胎的图像。装载的显微注射针从右侧接近，依次注射胚胎。(E) 图像显示带有用于显微注射的针的单个胚胎。白色箭头表示胚胎中正确注射位置的针尖。黑色虚线框是放大视图。在放大视图中，黑色星号表示针头在注射部位之前进入卵黄囊的位置。白色箭头表示可以看到针压在心包壁上的位置，这意味着针的深度足以注射到循环中。(E') 图像显示 (E) 中的相同胚胎在显微注射后立即进行。白色箭头表示胚胎中的针尖。黑色星号突出显示酚红染料的红色，表示注射成功。黑色虚线框是放大视图。(D) 中比例尺为 500 μm，(E, E') 中比例尺为 50 μm，(E, E' 放大视图) 中比例尺为 40 μm。

要注射 β-葡聚糖，请将 3 μL 4 mg/mL β-葡聚糖肽溶液装入显微注射针（以下简称针）。如果注射对照品，则在针上装入 3 μL 4 mg/mL β-葡聚糖对照溶液。

在立体显微镜下，用锋利的镊子切割针尖。切割后，注射混合物将移动到针尖。

将注射量校准至 1 nL。将一滴矿物油添加到 0.01 毫米显微镜载物台载玻片千分尺中，然后在立体显微镜下将焦点放在尺子上。调整注射盒的压力和脉冲持续时间，直到注射量达到 1.2 单位（图 1C）。这是 1 nL。

将 1 nL （4 ng）的 β-葡聚糖注入胚胎循环中（图 1D 和 1E）。从右侧接近，刺穿每个胚胎的卵黄囊，并将针移向心包腔，直到看到针接触心包壁。一旦到位，注射。注射混合物中的红色染料表明注射成功，因为染料随着心脏跳动而进入循环（图 1E'）。

注意：不要刺穿表皮壁。

请参阅故障排除。

将足够的 E3 培养基倒入注射培养皿中，以完全覆盖胚胎。使用移液管，在胚胎上反复吸取和喷射 E3，直到它们从甲基纤维素中脱落。用移液管轻轻拿起注射的胚胎，放入装有新鲜 E3 培养基的新 150 mm × 25 mm 培养皿中。

将培养皿放入 28°C 培养箱中并放置过夜。

在 3 dpf（72 hpf）时，重复步骤 2a-2k，将第二剂 β-葡聚糖注入幼虫中。第二次剂量为 8 ng，因此通过快速连续注射两次 1 nL，将 2 nL 注射到幼虫中。

注射后基因表达分析

从注射的幼虫中提取总 RNA。

在注射后所需的时间，通过在胚胎培养基中补充 4.2% (v/v) 三卡因来麻醉每个生物复制 15-20 只幼虫的池。我们研究了注射后 1、4 和 11 天 (dpi) 的基因表达，每个时间点进行 3 个生物学重复（图 2A）。

将合并的幼虫转移到 1.5 mL 微量离心管中。

使用移液管除去尽可能多的 E3。少量 (< 100 μL) 的残留 E3 不会扰乱下游过程。

将 1 mL TRIzol 试剂移入 1.5 mL 管中。

注意： TRIzol 具有危险性，应在通风橱中处理。

将 27 号针头连接到无菌 1 mL 注射器。小心地将幼虫吸入注射器中，然后分配回 1.5 mL 管中。重复直到幼虫组织均质化。

室温孵育 5 分钟。

暂停点：将样品储存在-80°C 或立即继续。

添加 200 μL 氯仿并涡旋两次 5 秒。

室温孵育 3 分钟。

在 4°C 下以 12,000× g离心15 分钟。

观察样品如何分裂成三层，上层为透明相（相），中间为白色中间相，下层为粉红色相。在不接触白色或粉红色相的情况下，小心地除去上层水相并转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。

添加 500 μL 100% 异丙醇并涡旋 1 分钟。

室温孵育 10 分钟。

在 4°C 下以 12,000× g离心10 分钟。

倾倒除去上清液并观察白色沉淀。

将 1 mL 75% 乙醇添加到沉淀上。

在 4°C 下以 7,500× g旋转5 分钟。

通过移液除去所有乙醇，并让沉淀在室温下风干 5 分钟。

将沉淀重悬于 30 μL 超纯水中。保持在冰上。

通过 nanodrop 量化 RNA 浓度。

暂停点：将 RNA 储存于 -80 °C 或立即继续。

感兴趣基因的实时定量 PCR (RT qPCR) 表达分析。

使用 iScript cDNA 合成试剂盒逆转录 cDNA。在 0.2 mL 管中，准备 iScript cDNA 合成反应混合物（配方 9）。

将样品放入 Eppendorf Mastercycler Nexus 热循环仪 Eco 中并运行以下方案：25 °C 5 分钟，46 °C 20 分钟，95 °C 1 分钟。

从热循环仪中取出并置于冰上。

暂停点：将 cDNA 储存于 -80 °C 或立即继续。

将 80 μL 超纯水添加到 20 μL cDNA 反应液中，以 1:5 稀释 cDNA。

对于 qPCR 反应，使用 ROX 混合物准备 PerfeCTa SYBR Green FastMix（配方 10）。

将每个样本的每个基因移入 384 孔板，进行 3 次技术重复。

将反应放入 Quantstudio 6 Flex 实时 PCR 系统中，并运行以下循环参数：初始变性 95°C 2 分钟，然后在 95°C 15 秒、60°C 30 秒进行 40 个循环。

记录每个基因的 Ct 值并进行数据分析（图 2B）。

图 2. 注射 β-葡聚糖后的基因表达分析。(A) 示意图说明了注射方案以及后续 RT qPCR 的样品采集时间点。(B) 注射 β-葡聚糖后 1、4 和 11 天 (dpi) 时相关免疫基因相对于对照的倍数变化。显示的数据来自三个生物重复的平均 ΔCt 值，每个生物重复 n = 15 只幼虫。内源对照基因是ef1a。

数据分析

以ef1a为内源对照（参考）基因，使用Microsoft Excel对数据进行分析。简而言之，ΔCt 值的计算方法是从感兴趣基因的平均 Ct 值中减去参考基因的平均 Ct 值（Ct平均感兴趣基因 – Ct平均ef1a）（Livak 和 Schmittgen，2001）。通过从实验样品（即注射的β-葡聚糖）的平均ΔCt中减去对照样品的平均ΔCt的ΔCt值来计算ΔΔCt值（ΔCt平均注射β-葡聚糖-ΔCt平均对照）。基因表达倍数变化通过 2 -ΔΔCT方法测定（Livak 和 Schmittgen，2001）。使用 GraphPad Prism 版本 8 可视化数据。

协议验证

先前的研究表明，NF-kB 通路参与对 β-葡聚糖的反应，刺激后特定炎症细胞因子（如il1b、tnfa、cxcl8 和il10 ）的表达上调（Rogers 等，2005；Inoue 和Shinohara，2014；Megías 等人，2016）。本研究中提供的 RT qPCR 数据表明，与对照相比，注射 β-葡聚糖后两个预测的感兴趣基因上调，并且该分析在最近的出版物中得到了进一步表征（Darroch 等人，2022）。达罗克等人。(2022)利用这种方法刺激斑马鱼幼虫的类似训练的表型，保护幼虫免受随后的细菌攻击，并增加中性粒细胞的感染招募。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

斑马鱼幼体提供了一个独特的机会来研究完全在体内训练的先天反应。在整个动物规模上，如 Darroch 等人所证明的，可以在活体感染后评估训练后表型，例如幼虫存活和病原体清除。（2022）。通过使用荧光病原体可以增强此类分析，可以使用荧光显微镜在透明幼虫中观察到荧光病原体。训练后可以使用多种病原体或无菌攻击来挑战幼虫，以评估先天免疫功能的变化（Linnerz 和 Hall，2020）。此外，还有许多带有荧光标记的先天免疫细胞的转基因报告系，可以以单细胞分辨率直接实时观察（Astin 等人，2017；Linnerz 和 Hall，2020）。可以在训练后评估吞噬细胞功能的分析，例如细菌杀灭能力、感染/炎症的募集或抗微生物分子的产生（例如，通过荧光探针检测到的反应性中间物种）（Astin 等人，2017，Darroch）等人，2022）。

故障排除

堵针：由于β-葡聚糖不溶，会堵塞针头。如果针头被堵塞，请增加注射器的气压，将注射器模式更改为连续气流，并尝试将 β-葡聚糖团块从针头中冲出。如果这不起作用，您可以将针头剪得稍大一些，然后尝试再次冲洗。你不应该无限期地把针变大；当针的孔径达到损害幼虫的尺寸时，您将需要装入并切割新的针。

致谢

这项工作得到了马斯登基金会、新西兰皇家学会（拨款# 3706135）和新西兰健康研究委员会（拨款# 17/294）向CJH 的资助。该协议最初由 Darroch 等人描述和验证。（2022）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

道德考虑

所有斑马鱼研究均得到奥克兰大学动物伦理委员会的批准（批准号 AEC001911 和 AEC22563）。

参考

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