材料与试剂

飞股票

野生型CantonS果蝇（BL#64349，训练时 7 天大）

材料

八个圆形荧光灯管（飞利浦，L 40 W，640C 圆形冷白光）
灯座和连接器 G10Q（ Vossloh ，目录号：101528）
两个电气变压器（Osram Quicktronic QT-M 1×26–42）
八根带开关的电源线（ Tibelec ，目录号：163910）
扩散纸（康颂，半透明纸 180 g/m 2 ）
十块黑纸（31毫米×31毫米）
滤纸（Whatman，目录号：1001-110）
油漆刷（尺寸 1； Boesner ，型号：Da Vinci Nova Serie 1570，目录号：D15701））
空瓶（聚苯乙烯； Dutscher ，目录号：789001B）
隐形胶带（Scotch Magic 3M，目录号：7100027389）
裁缝尺
铅笔

试剂

蒸馏水
矿泉水（依云）
葡萄糖 1.5 M（Sigma-Aldrich，目录号：G8270），用依云水制备
70% 乙醇（VWR，目录号： 83801）
琼脂（Genesee Scientific，目录号：66-103）
玉米粉（Genesee Scientific，目录号：62-100）
酵母（Genesee Scientific，目录号：62-106）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：68270）
糖蜜（Genesee Scientific，目录号：62-117）
乙醇（VWR，目录号： 83801）
尼泊金（ Thermo Fisher Scientific，目录号： A14289 ）
丙酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5561）
果蝇标准玉米粉/琼脂食物（参见食谱）

食谱

果蝇标准玉米粉/琼脂食品
8 克琼脂
60 克玉米粉
50 克酵母
20克葡萄糖
50 克糖蜜
19 毫升 70% 乙醇
尼泊金 1.9 克
10 mL 丙酸
用蒸馏水将最终体积定容至 1 L

设备

剪刀（Vannas 弹簧剪刀，3 毫米刀片；精细科学工具，目录号：15000-00）
CO 2垫（ Dutscher ，目录号：789183）
CO 2手枪（ Dutscher ，目录号：789096）
两个Buridan范例：包括带有平台和腔室的底板、丙烯酸圆柱体以及用于固定灯的柱子（ Peira Scientific Instruments， https://www.peira.be/ ）
两个网络摄像头（Logitech HD Pro c920 网络摄像头全高清）
两台电脑
蝇培养箱（Panasonic，MIR-554-PE；荧光灯：Panasonic FL15D 15W）
显微镜（徕卡，M80）

软件

Buritrack ( http://buridansourceforge.net )
R 核心团队 ( https://www.R-project.org/ )
RStudio ( https://support--rstudio-com.netlify.app/products/rstudio/ )

程序

准备苍蝇进行行为记录

在 12:12 小时光/暗循环、60% 湿度和 25°C 下饲养苍蝇。
如果孵出的苍蝇的年龄不受控制（包括那些暂时粘在食物或墙壁上的苍蝇），则将其处理掉。
将所有新孵化的苍蝇收集到一个新的实验瓶中（每瓶不超过 20 只苍蝇）。苍蝇应该是 0-1 天大的。
通过敲击收集 5 天大的苍蝇（至少 60 只苍蝇：对照组 30 只，训练组 30 只）并将其转移到装有新鲜食物的新小瓶中。
通过将小瓶倒置并插入 CO 2手枪来麻醉苍蝇。填充 CO 2几秒钟，直到苍蝇睡着（苍蝇不再移动并落入瓶盖中）。
将苍蝇转移到 CO 2分配多孔垫上。
在显微镜下用剪刀剪掉两个翅膀。机翼需要缩短至至少原始长度的 1/3，并且必须笔直至两个机翼的交叉线。苍蝇麻醉时间不得超过 5 分钟；因此，对苍蝇进行分配是有用的。
将每只苍蝇保存在单独的小瓶中，并在 25 °C 下保存食物（满 1 厘米）。将它们分开并存放在两个不同的架子上，一个用于对照组 (CT)，另一个用于训练组 (TR)。
实验使用 7 天大的果蝇。在进行实验前 21 小时，将每只苍蝇放入装有一张用依云水浇灌的滤纸的饥饿小瓶中。将它们储存在 25°C 直至进行实验。

为学习实验准备行为舞台

将并行准备两个设置，以同时运行对照组 (CT) 和训练组 (TR)。切换设置非常重要，以便两组在两个测定中都运行。对于实验中的一半动物，丙烯酸圆柱体必须旋转 180°，以排除周围其他刺激的任何不受控制和系统性影响。
将视觉扩散纸放在丙烯酸圆柱体的内部。
用透明胶带将黑色方块粘贴起来：在¬圆柱体的一侧，将三个方块放置在距离底部 40 毫米处，它们之间的距离为 22 毫米。使用相同的距离将剩余的两个方块粘贴在圆柱体的另一侧（相距 180°）。重要的是这些集合必须良好对齐。组的中心必须为 180° 分开（图1）。
打开Buritrack软件，并将视觉集放置在网络摄像头捕获的图像的顶部和底部部分（图 1B）。可能需要调整相机的对比度和亮度，以便竞技场可见。
将蒸馏水添加到Buridan室中。
使房间变暗：关闭百叶窗和窗帘并关闭房间的灯。
打开Buridan荧光灯。
用 70% 乙醇清洁平台。
将圆形滤纸放在平台上。
在Buridan计划运行训练组中，在要调节的视觉刺激（例如，2 个方格组）旁边添加两滴（~100 μL ）葡萄糖溶液，在另一个方格中添加两滴（~100 μL ）依云水视觉刺激（例如，3 个方块组）。对于对照组，在另一个Buridan中，在每个刺激旁边放置两滴水（图 1B）。

图 1. 行为装置和行走记录。 A.布里丹范式的外部观点。 B. 测定的顶视图，其中将滤纸（灰色虚线）放置在平台中，以在视觉刺激（红色虚线）旁边添加水或糖。 C. 苍蝇在测试过程中表演的图片。 D、E.用于设置实验参数的Buritrack软件图像。

运行培训课程

将平台温度设置为 25 °C。
“新跟踪”按钮并调整“跟踪”对话框中的所有参数（图 1D）。生成一个名为“Training”的文件夹来保存您的录音。打开Buritrack并设置录音参数。浏览 Training 文件夹，选择文件名（例如 TR_f01 表示 TR 组女性 #1 的情况；CT_m01 表示 CT 组男性 #1 的情况）和苍蝇组（例如 TR_f ，表示女性 TR苍蝇； CT_m （CT 雄性果蝇），以及记录时间（以秒为单位）。
设置竞技场的大小。设置平台位置时，左键单击平台边缘的三个点。检查所画的圆与平台是否吻合；如果没有，您可以右键单击删除一个点（每次单击一个点）（图 1D 中的黄线）。
轻轻地将苍蝇放在平台上。您可能需要再次调整相机的亮度。
激活跟踪 Buritrack记录步行行为（图 1D）。
如果苍蝇从平台上跳下来，跟踪器就会停止并播放声音警告实验者。使用刷子将苍蝇放回平台上，然后再次单击“激活跟踪”以继续实验。
3 分钟后，会议结束。轻轻地将苍蝇从平台上移开，然后将其放回饥饿的小瓶中。
用 70% 乙醇清洁平台，用蔗糖和水准备下一次飞行的新滤纸，并在Buritrack中设置新文件名。完成后，放置以下苍蝇并通过单击“新跟踪”按钮开始新的记录。
继续单独运行每只苍蝇，在苍蝇之间用 70% 乙醇清洁平台，并每次使用新的干净滤纸。一半的动物将使用一种刺激方向（例如Buritrack软件中图像顶部的三个方块）进行训练和测试，另一半动物将使用视觉集的相反方向进行训练和测试（例如，图像底部的三个方块）。

运行测试会话

训练结束后，立即用大量水和 70% 乙醇清洁平台，以去除任何葡萄糖痕迹。
训练结束两小时后，将干净的滤纸放在平台上。
放置苍蝇来记录测试过程。
生成一个名为“Testing”的文件夹来保存您的录音。打开Buritrak并设置录音参数。浏览测试文件夹并选择文件名称、飞行组和录制时间（300 秒）。重要的是使用与训练会话中相同的名称（例如， TR_f01、CT_m01），以便分析同一只果蝇在训练和测试会话期间的行为。
设置竞技场的大小。
Buritrack中激活跟踪以记录步行行为。
运行记录后，取出滤纸，用 70% 乙醇清洁平台，并放置新的圆形滤纸以测试下一次苍蝇。

数据分析

实验完成后（每组至少 30 只动物），通过汇集每个设置中收集的数据，将训练和测试会话的数据存储在不同的文件夹中。
打开 RStudio。
使用change_orientation_xy.R文件（ https://github.com/HassanLab/Bengochea_etal_2023/blob/main/change_orientation_xy.R ）反转一半动物的 xy 位置（以视觉刺激的反转配置运行）。
Analysis.R代码 ( https://github.com/HassanLab/Bengochea_etal_2023/blob/main/Analysis_Learning.R )来分析训练和测试会话。
检查所有苍蝇（来自训练组和对照组）是否到达了糖和水。没有访问蔗糖或水的苍蝇必须被丢弃。
运行Analysis.R代码后，您将发现以下输出文件：
单独的轨迹：在单个 PDF 中，您将找到每只苍蝇的轨迹。路径的颜色和大小会根据平台中每个位置所花费的时间而变化。
单独的转换图：转换图按照之前的描述完成（Colomb et al., 2012）。简而言之，平台被划分为 60 × 60 个六边形，苍蝇的位置使竞技场中每个六边形的计数增加 1。刻度从 0（蓝色）开始，一直上升到由计数分布的 95% 分位数计算得出的值（红色）。
Y位置密度图：按组划分的人口 Y 位置密度图（图 2）。
按群体/群体和性别划分的转变图：人口转变图取决于感兴趣的群体。
PI 比较：用于比较每组表现的最终箱线图。每个点表示每只测试的苍蝇的 PI。为了计算偏好指数，竞技场被分为三个区域。我们对靠近视觉刺激的区域内六边形的通过密度进行了求和，而没有分析竞技场的中心部分。值表示平均值±SD。偏好指数计算如下：

PI=(totaldensity(largersetarea)-totaldensity(smallersetarea))/(totaldensity(largersetarea)+totaldensity(smallersetarea) )

对于统计分析，您应该使用 Shapiro-Wilk 正态性检验检查正态数据分布。然后，我们选择适当的参数或非参数测试。我们使用非参数 Wilcoxon 秩和检验对各组进行统计比较（图 2）。

图 2. 果蝇进行 2 对 2训练3 个方块对比表明在测试过程中对两个方块的偏好。左侧的核密度图表示每个组和会话中果蝇沿 y 轴的位置持久性。右侧的箱线图显示了人口偏好指数中位数。训练有素的果蝇明显更喜欢较小的正方形集 [n = 45，PI = -0.20 ± 0.34，t(44) = -3.93，p = 2.9e-04，一个样本 t 检验]，与显示的对照组相反偏好三个方格集 [n = 42，PI = 0.39 ± 0.36，t(41) = 7.19，p = 8.87e-09，一个样本t检验；组间比较：t(84) = 7.9，p = 7.94e-12，韦尔奇两样本t检验]。方框限制：上四分位数 (75) 和下四分位数 (25)，以及晶须，1.5× 四分位数范围。每个点对应于一次飞行表现。灰点表示异常值。

视频 1. 两种不同果蝇的轨迹：一种属于对照组（红色轨迹），另一种属于训练和测试期间的训练组（蓝色轨迹）。这种视觉表示表明，与未经训练的果蝇对照组相比，经过训练的果蝇倾向于在两个方块附近花费更多的时间。

局限性

由于苍蝇被放置在平台上自由探索竞技场，该协议的一个重要限制是我们无法控制每只苍蝇与糖或水接触的时间。此外，我们无法控制哪种刺激首先到达果蝇。

讨论和结论

研究动物的认知能力和学习过程对于了解它们在各自生态位中的行为和适应至关重要。尤其是视觉学习，在动物的生存和决策能力中起着至关重要的作用。
果蝇个体建立了一种新的视觉经典条件反射行为范式。我们的方案通过 3 分钟的单次训练试验，生成持续至少 2 小时的视觉记忆，从而可以研究短期视觉记忆。然而，果蝇是否可以通过应用较长的训练方案形成长期视觉记忆仍有待分析。该研究果蝇视觉学习的协议对研究领域具有重大影响。由于可以呈现的视觉对象的灵活性，该协议可以适用于研究视觉学习的其他特性，并将允许更深入地研究昆虫视觉学习背后的复杂机制。
该协议采用了标准化良好的方法来研究自由行走的苍蝇的定向行为，使其他研究人员能够轻松复制实验。这有助于积累该领域的知识，并促进不同实验室的研究结果的验证。
研究无脊椎动物的学习不仅可以深入了解这些动物的认知能力，还有助于我们了解不同物种的进化和学习机制。通过揭开无脊椎动物学习的复杂性，我们可以获得有关学习和认知基本原理的宝贵知识。

一般注意事项和故障排除

在最佳条件下，不同日期、不同季节、不同实验者进行的实验结果是可重复的。然而，室温和湿度的波动会影响行为表现。因此，保持室内条件稳定至关重要。剪断翅膀时，务必小心处理苍蝇，以免造成伤害。建议剪掉比实验所需的更多的苍蝇，以防因剪掉或饥饿而造成任何损失。剩余翼长不应超过原长的1/3，防止从平台上跳下过多。严格的时间安排对于培训和测试课程都至关重要，并且并行分组可能具有挑战性。有效地从平台上放置和移除苍蝇对于确保所有苍蝇的会话持续时间一致至关重要。建议在开始实验之前进行事先培训和练习。

致谢

该协议最初发表在 Bengochea 等人的研究手稿中。（2023）。这项工作得到了Investissements的支持 d'Avenir计划 (ANR-10-IAIHU-06)、巴黎脑研究所-ICM 核心资助、Allen 杰出研究者奖 (12202)、Roger De Spoelberch 奖、NIH 脑计划 RO1 拨款 (1R01NS121874-01) 和ANR拨款QuantSocInd (ANR-19-CE16-000)（至 BAH）和巴黎大脑研究所的大脑理论计划（BBT.3400.COUNTINGFLIES，至 BH）。我们感谢 ICM RnD部门及其工作人员为建设布里丹体育场提供的帮助。

利益争夺

作者没有需要声明的利益冲突。

参考

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