材料与试剂

苍蝇

本研究中使用的飞线： yw R （Eric Rulifson的礼物）； yw ; _ FASN旗帜（Miao 等人，2022）。果蝇维持在 25°C、60% 相对湿度和 12:12 小时光/暗周期。成虫和幼虫以标准玉米粉和酵母为基础的食物饲养。

试剂

1.Pierce TM IP 裂解缓冲液（ Thermo Scientific TM ，目录号：87787）
2.蛋白酶抑制剂混合物（PIC，100×）（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
3.PMSF 蛋白酶抑制剂（Fisher Scientific、 Thermo Scientific TM ，目录号：PI36978）
4.丁酸钠（VWR、 Thermo Scientific TM ，目录号：AAAA11079-06)
5.烟酰胺（NAM）（Sigma-Aldrich，目录号：72340）
6.Pierce TM BCA 蛋白检测试剂盒（ Thermo Scientific TM ，目录号：23225）
7.SureBeads TM Protein G 磁珠（B io -Rad，目录号：1614023）
8.2 × Laemmli样品缓冲液（ Bio-Rad ，目录号：1610737）
9.10 ×预混合电泳缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610732）
10.4%–20% Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白质凝胶（Bio-Rad，目录号：4561093）
11.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
12.Gibco TM HEPES (1 M)（Fisher Scientific，目录号：15-630-080）
13.氯化镁（MgCl 2 ）（Fisher Scientific， Thermo Scientific Chemicals，目录号：AC223210010）
14.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
15.UltraPure TM 0.5 M EDTA，pH 8.0（Fisher Scientific， Invitrogen TM ，目录号：15-575-020）
16.Pierce TM考马斯（布拉德福德）蛋白质检测试剂盒（ Thermo Scientific TM ，目录号：23200）
17.单克隆 ANTI-FLAG ® M2 抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804-50UG）

解决方案

1.100 mM PMSF
2.5M丁酸钠
3.1M 纳米
4.1M 蔗糖
5.1 M 氯化镁2
6.1M DTT
7.1 M 磷酸二钾 (K 2 HPO 4 )
8.1 M 磷酸二氢钾(KH 2 PO 4 )
9.24 毫米 NADPH
10.6.2 mM 乙酰辅酶A
11.5.8 mM 丙二酰辅酶A
12.用于免疫沉淀和电泳的蛋白质裂解缓冲液（裂解缓冲液 1）（参见配方）
13.用于蛋白质洗脱和电泳的蛋白质变性缓冲液（变性缓冲液）（参见配方）
14.电泳缓冲液（参见配方）
15.用于 FASN 活性测定的蛋白质裂解缓冲液（裂解缓冲液 2）（参见配方）
16.200 mM 磷酸钾缓冲液 (PPB)，pH 6.6 （参见配方）
17.FASN 反应缓冲液（参见配方）

食谱

1.用于免疫沉淀和电泳的蛋白质裂解缓冲液（裂解缓冲液 1）
6–7 mL 裂解缓冲液 1 将用于裂解和清洗步骤；根据样品数量计算总体积并新鲜配制缓冲液。
Pierce TM IP 裂解缓冲液配有 1 × PIC、1 mM PMSF、50 mM 丁酸钠和 50 mM NAM
2.用于蛋白质洗脱和电泳的蛋白质变性缓冲液（变性缓冲液）
注意：新鲜制作。
950 μL 2 × Laemmli样品缓冲液
50 μL BME
1 mL裂解缓冲液 1

3.电泳缓冲液
注意：可在室温下保存。
10 ×预混电泳缓冲液，用水稀释至 1 ×

4.用于 FASN 活性测定的蛋白质裂解缓冲液（裂解缓冲液 2）
300微升裂解缓冲液2将用于裂解步骤；根据样品数量计算总体积并新鲜配制缓冲液。
250 mM 蔗糖
20 mM HEPES 缓冲液，pH 7.2
2 毫米氯化镁2
1 毫摩尔 DTT
1 毫米乙二胺四乙酸
1 ×图片

5.200 mM 磷酸钾缓冲液 (PPB)，pH 6.6
注：4°C 下可稳定保存两个月。
0.76 mL 1 MK 2 HPO 4
1.24 mL 1 M KH 2 PO 4
用蒸馏水定容至 10 mL

6.FASN 反应缓冲液
200微升反应缓冲液将添加到每个样品/标准品中；根据标准品和样品的数量计算体积并新鲜配制缓冲液。
200 mM PPB，pH 6.6
1 毫摩尔 DTT
1 毫米乙二胺四乙酸
0.24 毫米 NADPH
0.031 mM 乙酰辅酶A

实验室用品

1.Pellet Pestle TM无绳电机（Fisher Scientific，目录号：12-141-361）
2.磁珠架（ Bio-Rad ，目录号： 1614916）
3.1.7 mL低结合微量离心管（ Fisher Scientific，目录号：07-200-184）

设备

1.Sonifier （必能信，型号：SFX150）
2.微量离心机（ Sorvall TM 传奇™微21)
3.数字干浴/块式加热器（Fisher Scientific ，目录号： 88860103）
4.微孔板分光光度计（ BioTek Epoch 2）
5.ChemiDoc MP 成像系统 (Bio-Rad)

程序

第一部分：通过质谱法鉴定乙酰化位点

A.蛋白质提取

1.FASN Flag果蝇的三龄幼虫 (L3)，并在微量离心管中的 FASN 基因座上进行 Flag 敲入。样品可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
2.在蛋白质提取前配制裂解缓冲液 1。
3.将 300 μL裂解缓冲液 1添加到每个管中。用杵枪在冰上将幼虫均质化，直到幼虫被粉碎。
4.以 10-20 振幅超声处理 10 秒。
5.用裂解缓冲液将体积调至 800 μL 1 。将样品在冰上孵育 20 分钟。
6.×旋转 g ，4°C 30 分钟。
7.将上清液转移至新管中。重复离心步骤两次或直至上清液澄清。
8.将 5 μL裂解液移至新管中。用裂解缓冲液 1稀释十倍。每个样品的蛋白质浓度由Pierce TM BCA Protein Assay根据制造商的方案测定。
9.Pierce TM BCA 蛋白质测定法将蛋白质稀释至等量。 FASN Pull Down 测定的最佳总蛋白量约为 1 mg。用裂解缓冲液 1将体积调至 1 mL 。
10.暂停步骤：蛋白质可以在液氮中速冻并储存在-80°C。

B.免疫沉淀

1.将 25 μL SureBeads TM Protein G 磁珠添加到干净的微量离心管中。
2.用200洗珠子3次 µL裂解缓冲液 1 ：涡旋 5 秒以重悬珠子并以 10,000 ×离心 g 1 分钟。使用磁珠架收集珠子，并通过移液除去缓冲液。
3.添加步骤中的蛋白质裂解物直接到了珠子上。在 4°C 下在转子上孵育 30 分钟以去除非特异性结合。
4.短暂离心珠裂解物混合物。使用磁珠架收集珠子并将裂解物转移至新鲜的微量离心管中。
5.添加 10 µL ANTI-FLAG ® M2 抗体（抗 FLAG）加入 1 mL 蛋白质裂解液中（1:100 稀释）。
6.将抗体-裂解物混合物在转子上于 4 °C 孵育过夜。
7.添加 100 µL SureBeads TM Protein G 磁珠至干净的微量离心管中。用500洗珠子3次 µL裂解缓冲液1 ，如上所述。
8.将抗体-裂解物混合物添加到珠子中。短暂涡旋以重新悬浮珠子。
9.将抗体-裂解物-珠混合物在转子上于 4°C 孵育 3 小时。
10.使用磁珠架收集珠子，并通过移液丢弃液体。
11.L裂解缓冲液清洗珠子 3 次1。每次清洗之间在 4 °C 下旋转 10 分钟。
12.使用磁珠架收集珠子并小心地除去所有液体。添加 30 μL变性缓冲液。轻轻敲击管子，重新悬浮珠子。
13.将样品在 95°C 下加热 5 分钟，从珠子中洗脱蛋白质，在中间点轻轻敲击管子。
14.短暂旋转样品并将管放入磁珠架中。将洗脱液转移至新的微量离心管中。
15.暂停步骤：洗脱和变性的蛋白质可以储存在-20 °C 或更低的温度下。

C.电泳和考马斯蓝染色

1.程序中加载 30 µL 蛋白质样品 B在4%–20% Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白凝胶上进行电泳。
2.根据制造商的方案将考马斯蓝染色到蛋白质凝胶上以可视化蛋白质。
3.分子量约为 250 kDa的蛋白质条带；凝胶切片可暂时储存在装有 4 °C蒸馏水的微量离心管中（图 1）。

图 1. 蛋白质电泳凝胶显示考马斯蓝染色后免疫沉淀的脂肪酸合酶 (FASN) 蛋白质。切割大约 250 kDa的蛋白质条带用于进一步分析。

4.样品被运送到质谱设备进行凝胶内消化、脱盐、冻干和 MS 分析以检测乙酰化位点。

D.通过质谱和数据验证鉴定乙酰化位点

1.鉴定乙酰化赖氨酸残基的蛋白质组学分析通常由质谱设备进行。如果需要进一步分析，还可以通过蛋白质组数据分析平台（例如MaxQuant ）获取和处理原始数据。 MaxQuant的使用之前已经得到了很好的总结（ Tyanova等人，2016）。
2.基于 MS 的分析已鉴定出 FASN 的 8 个乙酰化赖氨酸残基，这些残基是从 L3 期幼虫中免疫沉淀的，并将结果与先前鉴定的 FASN 乙酰化位点进行比较，这些位点可以从开放访问数据库中获取，例如蛋白质赖氨酸修饰数据库 (PLMD) ）（Xu 等人，2017 年）和PhosphoSitePlus ® PTM 资源（Hornbeck 等人，2014 年）（表 1）。

表 1. 质谱鉴定的果蝇 FASN 的 8 个乙酰化赖氨酸残基列表
本研究中鉴定出的 Ac-赖氨酸Ac-赖氨酸位于先前确定的相同位置肽序列
K193没有任何德里克· K· DSDLENF
K333没有任何加格利尔K PTMSLQF
K407没有任何GITYPIG K MQNRLIR
K813K813（果蝇，来自不同的苍蝇研究）NAEGVFA K VNSSGY
K673（智人）RKEGVFA K VRTGGM
K673（小家鼠）KQEGVFA K VRTGGL
K673（褐家鼠）KQEGVFA K VRTGGL
K926K926（果蝇，来自不同的苍蝇研究）ATNLSLV K GHENNV
K786（智人）CTIIPLM K DHRDNL
K786（小家鼠）CTIIPLM K DHKDNL
K786（褐家鼠）CTIIPLM K DHKDNL
K1535没有任何林斯维尔·K·恩格特
K1800K1771（智人）格莱格· K ·DLSQNH
K1764（小家鼠）格莱格· K ·DLSNNH
K1765（褐家鼠）格莱格· K ·DLSNNH
K2466K2426（智人）阿尔斯菲· K ·拉埃基
K2419（小家鼠）AAVSFYH K拉德奇

3.使用 Ac-K813 特异性抗体进一步验证赖氨酸残基 K813 的乙酰化。
a.为了验证从 MS 中鉴定出的 K813 残基的乙酰化，我们首先生成了针对具有乙酰化 K813 的合成肽的兔多克隆抗体（ Yenzym抗体，CA，美国）。肽序列是NAEGVFA- acK -AVNSSG。它涵盖了果蝇 FASN 蛋白 MAT 结构域的氨基酸 806-819。
b.然后，我们使用大肠杆菌BL21 (DE3) 表达系统表达 FASN 蛋白的重组 KS-MAT 双结构域，用于乙酰化验证实验。
c.为了验证KS-MAT重组蛋白K813的乙酰化，我们将重组蛋白与不同量的乙酰辅酶A一起孵育1小时，并通过蛋白质印迹分析和Ac-K813抗体检查K813的乙酰化。有趣的是，K813 被乙酰辅酶 A 以剂量依赖性方式快速乙酰化（图 2 ）。

图 2. 乙酰辅酶A（ AcCoA ）处理后，检测到重组脂肪酸合酶（ FASN）蛋白（KS-MAT结构域）的K813残基的乙酰化。乙酰基-K813 抗体用于蛋白质印迹分析。

第二部分：FASN 活性测定

A.蛋白质提取

1.在微量离心管中收集 20–30 mg yw R蝇的 L3 幼虫。样品可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
2.向每个管中添加 300 μL裂解缓冲液2 。用杵枪在冰上将幼虫均质化，直到幼虫被粉碎。
3.以 10-20 振幅超声处理 10 秒。
4.3,500 ×离心 g在 4°C 下保持 10 分钟。
5.将裂解液转移至新管并再次以 21,000 ×离心 g ，4°C 20 分钟。重复两次。
6.将 5 μL裂解液移至新管中。用裂解缓冲液2稀释十倍。每个样品的蛋白质浓度 (mg/mL) 根据制造商的方案通过 Pierce Coomassie Bradford 测定法测定。
7.暂停步骤：蛋白质可以暂时储存在-80°C。

B.FASN活性测定

1.为了生成 NADPH 标准曲线，测量 NADPH 不同稀释度的吸光度：用蒸馏水稀释 24 mM NADPH 库存溶液，制备 12、6、3、1.5和 0.75 mM标准溶液。将 200 μL蒸馏水添加到 96 孔板的孔中，并添加 2 μL不同稀释度的 NADPH，以生成 0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 和 0.0075 mM/孔标准品。在酶标仪上以 A 340 nm读取。
2.在同一 96 孔板中，添加 20 μL果蝇蛋白提取物和 200 μL新鲜制备的 FASN 反应缓冲液。
3.340nm处读取板3 分钟（间隔 1 分钟）以测量背景 NADPH 氧化。
4.添加 2 µL 5.8 mM丙二酰辅酶A（终浓度：58 μ M ) 到每个孔。
5.在 A 340nm处读取15 分钟（间隔 1 分钟）以确定 NADPH 的 FASN 依赖性氧化。

C.计算

1.使用从适当的 NADPH 标准获得的值绘制标准曲线。
2.340nm变化的速率针对 NADPH 氧化的背景速率进行校正。 FASN 活性根据蛋白量标准化，并以 nmol NADPH 氧化 min -1 mg 蛋白-1计算。
a.计算 15 分钟内 OD 读数的平均减少量：速率 1 = (OD_0 分钟 - OD_15 分钟)/15。计算 3 分钟内背景读数 OD 变化率：比率 2 = (OD_0 min - OD_3 min)/3。校正340nm变化的速率：速率 = 速率 1 - 速率 2。
b.根据标准曲线( C )将校正后的OD减少率(Rate)转换为每分钟NADPH浓度的变化(mM)。计算200μL反应中每分钟NADPH的减少量： C × 200（纳摩尔/分钟）。
c.计算每孔加入的蛋白量（mg）：蛋白浓度（mg/mL） × 0.02 mL。
d.将 NADPH 的减少量与蛋白质量（nmol/min/mg 蛋白质）标准化。
e.FASN K813R ）的果蝇幼虫中的FASN活性降低，其中813位的赖氨酸残基突变为精氨酸。

FASN K813R 、 FASN K926R ）的脂肪酸合酶 (FASN) 酶活性。 FASN 活性通过每分钟每毫克蛋白质的氧化 NADPH 来测定。呈现了 FASN 活性的倍数变化。数据以平均值±标准差表示。单因素方差分析； ***p 值 < 0.001； ns。不重要。

致谢

我们感谢哈佛医学院 Taplin 质谱设备的 Ross Tomaino进行质谱分析。我们感谢 Justin Walley 博士就用于鉴定乙酰化位点的样品制备提供的建议。图形概述是使用 BioRender.com 创建的。这项工作得到了 NSF CAREER 2046984 和 NIH R01AG058741 到 HB 的支持

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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