材料与试剂

感兴趣的酵母菌株
圆底玻璃培养管（ Borosil ，目录号：9900006）
250 mL锥形瓶（Schott Duran，目录号：1006940）
酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）（ Himedia ，目录号：M1363）
酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂（YPDA）（ Himedia ，目录号：G038）
乙醇（100% 和 70%）（Fisher Chemical，目录号：2051537）
羟基脲（MP Biomedical，目录号：102023）
MMS（SRL，目录号：74384）
无菌1.5 mL微量离心管（ Axygen ，目录号：MCT150LC）
圆形U形底96孔板（ Thermo Fisher Scientific，目录号：165306）
无菌培养皿 100 mm × 15 mm（Falcon，目录号：351008）
玻璃培养皿 100 mm × 15 mm（ Borosil ，目录号：3165077）
无菌撒布器（ Tarson ，目录号：920081）
比色皿 200–1,600 nm（Eppendorf，目录号： 0030106300）
铝箔（罗利亚斯）
手套（蓝盾）

设备

层流气流（ Thermo Scientific生物安全柜，目录号：41346502）
无菌移液器套件（ Rainin ，目录号：E1338890T-SL1000、B637036181-SL200、B641141423-SL20）
实验室酒精灯或本生灯（VWR，目录号：17822-605）
分光光度计（Eppendorf，Bio Photometer Plus，目录号：6132）
48 针点样器（Sigma-Aldrich，目录号：R2383）
冷藏摇床培养箱（ Scigenic Biotech，目录号：LE-4676-AH）
冷藏培养箱（ Scigenic Biotech，目录号：C-1NC-100)
Chemidoc XRS 凝胶成像仪（Bio-Rad，目录号：1708370）
白色灯箱（Cole-Parmer：NC1851470）

软件

Bio-Rad 图像实验室（2017 年，版本号：6.0.1）
GraphPad棱镜v8.0

程序

这些步骤必须在无菌环境中进行，最好使用生物安全柜。开始实验前，用 70% 乙醇擦拭层流罩，将所有必要的设备（培养皿、96 孔板、酒精灯、点样器、移液器套件、无菌吸头盒、1.5 mL MCT 管）放入内部，然后打开紫外线30分钟。使用适当的个人防护配件，例如实验室夹克和手套，以防止污染并维护自身安全。

菌种接种

将甘油库存中的所有感兴趣的酵母菌株新鲜划线在无菌 YPD 琼脂板上，并在 30°C 下孵育 48 小时。
将每个菌株的单菌落接种到 5 mL 高压灭菌的 YPD 肉汤培养基中，并使其在 30°C 摇床培养箱中以 200 rpm 生长过夜（14-16 小时）。

YPD琼脂平板浇注

取新鲜高压灭菌的 YPD 琼脂培养基，轻轻旋转直至其冷却到足以处理。一旦您能够舒适地握住烧瓶几秒钟，请在每个板中倒入大约 25 mL 的介质（参见注释 1）。
要使用 HU 或 MMS（或任何其他试剂）准备 YPD 板，请取新鲜高压灭菌的 YPD 琼脂培养基并轻轻旋转，直至其冷却至易于操作的温度。此时，将所需体积的化学品储备溶液（例如，100 mM HU 或 99% MMS）添加到各个烧瓶中，以获得最终浓度。通过旋转充分混合，然后倒入。例如：对于我们的菌株，HU 和 MMS 的终浓度分别为 5、10 和 20 mM，以及 0.001%、0.002% 和 0.003%。每个试剂浓度总共需要四块板（一块用于点样，三块用于铺展）（参见注释 2）。
让板完全冷却 45-60 分钟；这对于有效发现和传播是必要的。然后，盖上板并将其保持倒置。关键：在向板中倒入任何试剂之前，请严格遵循每种有毒试剂的用户手册有关安全性、光敏感性、热稳定性和溶解度的规定。在用光敏试剂倒入板时，关闭层流罩灯并用铝箔覆盖板。 MMS 和其他诱变试剂必须小心处理；实验完成后，立即按照供应商的建议对受到 MMS 污染的烧瓶、平板等进行去毒。在倾倒板之前根据浓度对板进行标记。用不同的箭头标记来显示菌株和稀释的方向。暂停点：您可以用石蜡膜和铝箔包裹板，将其存放在 4 °C 下，以便第二天点样/铺展。不鼓励长期储存，因为板会变干并且药物的局部浓度会增加（参见附加说明 1）。

系列稀释

在 1.5 mL 微量离心管中用 YPD 肉汤将过夜生长的培养物稀释至 1:10 的比例，并在分光光度计中测量光密度 (OD) 以确定培养物密度。关键：未稀释培养物的 600 nm OD 如果超过 3，则为错误；因此，建议用 YPD 稀释培养物，使 OD 保持在 1 左右。
不同细胞毒性化学物质的浓度需要根据菌株进行标准化，当敏感性测试中包含更多菌株时，不同实验的浓度可能会有所不同。基于已发表文献的先前信息将会有所帮助。
通过将分光光度计中 OD 1.0 维持在 600 nm 处，使所有菌株的细胞数量相等。仔细检查 OD 以避免细胞数量的变化。
200 μL添加到 96 孔板的第一排（S1–S12）；一组样本用于点样，另一组用于传播 CFU 测定。
180 μL YPD 肉汤填充柱中的五个连续下游孔（B1、C1、D1、E1 和 F1 等）以进行连续稀释。
通过将 20 μL培养物从主培养物 (A1) 移至下游孔并继续至第六孔 (F1)（10 -5稀释）来进行第一组样品的连续稀释。通过这样做，A1 中的 6 × 10 6 个细胞被稀释为 F1 中的 60 个细胞。对其余菌株进行相同的稀释（见注3）。关键：在移出 20 μL之前，将其均匀混合，以获得均匀的细胞密度和高效的连续稀释。

稀释点样

将点针浸入玻璃培养皿中的 100% 乙醇中，然后短暂燃烧 3 次，对点样器进行消毒。让点样器冷却（5-10 分钟）（参见注释 4）。注意：使酒精灯或本生灯远离层流罩内的垂直气流。将灯放置得太靠近气流可能会因引入空气而导致过度燃烧，从而可能导致层流罩爆炸。将酒精灯和装有 100% 乙醇的培养皿放在层流罩的两个单独的角落中。燃烧后立即盖上酒精灯的盖子。
一旦点样器完全冷却，将点样器浸入含有连续稀释培养物的 96 孔板中，并在含有或不含细胞毒性剂的琼脂板上轻轻点样。垂直取出点样器，不要干扰板（参见注 5）。必须对每个板单独进行点样。
点样后，将板静置 10-15 分钟，以确保点样培养物完全吸收；将板保持在 30°C 24-48 小时，具体取决于板上的生长情况。关键：如果添加剂试剂对光敏感，请通过关闭层流罩灯进行点样，并在孵育过程中用铝箔覆盖。 24小时后，定期监测平板以避免斑点过度生长。

用于估计 CFU 的稀释度分布

从第五排孔（E1-E12）中吸取 10 -4 稀释样品 100 μL，转移至 1.5 mL 微量离心管中，并用YPD肉汤补足体积至600 μL 。关键：根据铺展所需的板数，选择稀释度相应地从96孔板（10 -3或10 -4 ）中在1 mL微量离心管中进一步稀释。如果板数> 6，则可以选择较低的稀释度并继续。
通过用 1 mL 移液器移液或涡旋几秒钟，在 1.5 mL 微量离心管中彻底混合培养物。将 100 μL所得样品涂在含有或不含试剂的板上。将使用三块含有相同浓度 HU 的板和一块 YPD 琼脂对照板进行铺展以获得统计显着性。
根据平板上分离菌落的生长情况，将所有平板在 30°C 下孵育 24-48 小时（参见附加说明 2）。批判的：平板上的菌落太少或太多可能会给出错误的估计；因此，必须以这样的方式选择稀释度，即大约 50-80 个分离的菌落将出现在盘子上。暂停点：在对菌落进行成像/计数之前，可以通过用封口膜和铝箔包裹平板将其保持在 4°C（图 S1）。
将板放在灯箱上并手动计数菌落。立即记下每个板的信息（附加注释 3）。

板成像

将来自斑点和 CFU 分析的 YPD 板垂直放置在 Bio-Rad 凝胶文档的白色板上，并取下板盖以防止反射。打开图像实验室软件，选择印迹部分中的无染色印迹，并获取图像。为了获得最佳成像效果，请一次放置两个板（参见注释 6）。
将 600 dpi 图像导出为 . tif格式和 .tif 格式的原始图像文件。 .scn格式。使用任何通用软件（例如，PowerPoint），将斑点板与对照板按浓度递增的顺序排列，并比较灵敏度。

数据分析

600nm的酵母培养物大约含有 3 × 10 7个细胞；从中取出 200 μL ，您将获得 6 × 10 6个细胞。进行高达 10 -4 倍的连续稀释将导致 100 μL中含有 300 个细胞。
用 YPD 肉汤将 100 μL 进一步稀释至 600 μL，并铺展 100 μL，每板将产生50个细胞。
计算所有平板中出现的菌落并记下它们（表 1 和表 S1）。将 YPD 对照平板（不含任何有毒化学物质）上出现的菌落数视为 100% 存活率，并据此确定治疗组的存活率：

Survival Percentage=(Total number of colonies in treated plate)/(Total number of colonies in the control plate)×100

准备一张表格，其中包含菌株名称、试剂浓度、菌落数和百分比。通过组合生物三重复项和技术重复项的所有数据，在 GraphPad Prism v8.0 中使用XY 系列图的平均连通图绘制单个重复项。统计显着性将通过使用双向方差分析和 Tukey 的多重比较检验（列内，比较行）来确定。

表 1.所用羟基脲 (HU)浓度的表示、平板上出现的菌落数量以及菌落形成单位 (CFU) 分析期间获得的菌株的相应百分比
白色念珠菌WT白色念珠菌 pol32 ΔΔ
浓度（胡）细胞计数平均百分比 (%) ± SDP值细胞计数平均百分比 (%) ± SDP值

代表 1代表 2代表 3平均代表 1代表 2代表 3平均
0毫米75757575100不适用75757575100不适用
5毫米7575747599 ± 0.940.997073727295 ± 2.050.59
10毫米7073737296 ± 1.880.596558566079 ± 4.78< 0.001
20毫米6572716992 ± 4.40.132940333445 ± 6.12< 0.0001
酿酒酵母WT酿酒酵母 pol32 ΔΔ
浓度（胡）细胞计数平均百分比 (%) ± SDP值细胞计数平均百分比 (%) ± SDP值
代表 1代表 2代表 3平均代表 1代表 2代表 3平均
0毫米75757510074757575100
5毫米63686688 ± 2.940.00743138361446 ± 5.09< 0.001
10毫米53515671 ± 2.94< 0.0001917 号1596 ± 5.09< 0.001
20毫米20323850 ± 5.35< 0.001123292 ± 1.24< 0.0001

笔记

尽快倒入新鲜高压灭菌的 YPD 琼脂培养基，以避免琼脂聚集和结块。
在向板中倒入化学试剂时，要充分混合，以确保试剂在介质中混合均匀，同时避免起泡。必须将适当浓度的试剂主液添加到 100 mL 的 YPD 琼脂中，才能在板上获得所需的浓度。例如，将 20 L 100 mM HU 添加到 100 mL 培养基中以获得 20 mM。 HU (100 mM) 储备液可通过将 7.6 mg 添加到 1 mL 双蒸水中并过滤除菌来制备。供应商可以随时以液体形式提供大约 99% 的 MMS。
在连续稀释过程中，小心地将培养物从一个孔转移到下一个孔，以防止溢出，从而可能导致与相邻菌株的交叉污染。
使用含有 100% 乙醇的玻璃培养皿 (100 mm × 15 mm)，而不是塑料培养皿，在燃烧前浸入点样针。
点样时，手应保持静止，避免颤抖，并将点样器轻轻放在板表面，以免损坏固化介质。
Chemidoc XRS 凝胶成像仪中采集图像时，小心打开板盖并避免接触斑点。

补充笔记

可以使用抗真菌药物和任何外源化合物代替基因毒性剂来进行敏感性测试。
对于温度敏感性测定，不含任何有毒试剂的点样板将在不同温度下孵育，例如 16、30、37 和 42 °C。
可以在显微镜下测定点样或铺展集落的细胞形态，以评估特定应力对形态的影响，并排除铺板过程中的任何污染。

致谢

该协议是根据作者之前发表的结果开发的（Manohar 等人，2018 和 2022；Kumari 等人，2023；Patel 等人，2023）。这项工作得到了 DBT 和 SERB 向 NA 提供的赠款的部分支持

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Khandagale , P.、 Peroumal , D.、Manohar, K. 和 Acharya, N. (2019)。人类 DNA 聚合酶 delta 是一种具有二聚体 p12 亚基的五聚体全酶。生命科学。联盟2(2)：e201900323。
Kumari, P.、Sundaram, R.、Manohar, K.、Vasudevan, D. 和 Acharya, N. (2021)。域间连接环和J环结构决定了PCNA的跨物种兼容性。 J.Biol。化学。 297（1）：100911。
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Patel, SK、Sahu, SR、 Utkalaja , BG、Bose, S. 和 Acharya, N. (2023)。 Pol32 是 DNA 聚合酶 δ 的辅助亚基，在白色念珠菌的基因组稳定性和发病机制中发挥着重要作用。肠道微生物15(1)：e2163840。

补充资料

在此处下载以下支持信息：
图S1。在 30 °C孵育 24 小时后，对带有菌落的 YPD 板进行成像，然后进行 CFU 分析计数。
表 S1。所用 MMS 浓度的表示、平板上出现的菌落数以及 CFU 分析过程中获得的菌株的相应百分比。