材料与试剂

1.96孔黑色/透明底板（ Thermo Fisher Scientific， Nunc TM ，目录号：165305）
2.胶原蛋白 I，鼠尾（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号： A1048301 ）
3.Hoechst 33342（ Thermo Fisher Scientific， Invitrogen TM ，目录号： H3570）
4.HEPES（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号： 15630106 ）
5.牛血清白蛋白（BSA）（ BioShop ，目录号： ALB001 ）
6.重组人 EGF（ PeproTech ，目录号：AF-100-15）
7.人FGF酸性重组蛋白（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号： PHG0014 ）
8.来自猪肠粘膜的肝素钠盐（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
9.Trametinib（LC 实验室，目录号：T-8123）
10.PBS，pH 7.4 （ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：10010023）
11.细胞迁移补充剂（参见食谱）

细胞系

如所示使用 SAS 细胞系。细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素和链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中生长。

食谱

1.细胞迁移补充剂
20 毫米 HEPES
0.1%牛血清白蛋白
5 ng/mL EGF 或 25 ng/mL FGF1
10U肝素

设备

1.荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti）
2.200μL吸头或牙签代替）

软件

1.MATLAB （MathWorks， https ://www.mathworks.com/products/matlab.html ）与图像处理工具箱（访问日期，2017 年 8 月 1 日）
2.Nikon NIS-Elements Viewer（尼康图像采集软件）（访问日期，2017 年 9 月 21 日）
3.斐济，来自 Imag eJ（用于图像分析的开放资源软件）（访问日期，2017 年 8 月 1 日）
4.Excel (Microsoft) （访问日期，2017 年 8 月 1 日）

程序

平板包被和细胞接种

1.将 100 μL胶原蛋白 I（30 μg /mL，在 PBS 中稀释）添加到 96 孔黑/透明底板中，并将板放入 37°C、95% 湿度的培养箱中 30 – 40分钟。
2.μL PBS冲洗板并彻底吸干板中的液体。
3.之后，将 SAS 细胞铺到板上。（进行细胞迁移当天细胞数量应控制在90% – 100%汇合。）
4.（可选）细胞用慢病毒感染 24 小时，并用抗生素选择 24-48小时。

细胞核染色

用 1 μg /mL 的 Hoechst 33342 对细胞进行染色 1 小时。

抓挠（仅用于伤口愈合测定）

1.将介质更改为 100 μL预热的 PBS。
2.用刮刀刮擦细胞（来回移动刮刀两次）。此方法适用于完整的 96 孔板，如果仅使用部分 96 孔板，可以使用牙签或 200 μL吸头代替。
3.划伤后，用 100 μL PBS 清洗细胞两次，去除细胞碎片。

药物治疗

nM或 DMSO）的无血清 DMEM 培养基（用于 SAS 细胞）。

影像学

1.将 SAS 细胞的细胞放入 32°C 的丙烯酸培养箱中。亚克力培养箱是一个带有CO 2循环的室[温度低于正常培养（ 37°C ）以优化分析的迁移速度]。
2.使用尼康 Eclipse Ti 用于活细胞成像的显微镜。每 10 分钟拍摄一次图像，持续时间为 6-10 小时。我们的脚本是为 4 ×物镜拍摄的照片而设计的。

数据分析

我们通过 MATLAB 脚本处理图像数据。图 1 简要概括了这些图像的处理方式。

图 1. 使用 MATLAB 脚本进行数据处理的示意图

MATLAB 脚本和分析说明

1.定义核位置：Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift
该脚本定义了每个图像中的单元格位置。
a.打开 MATLAB，导入数据并准备脚本。
b.将图像导出到工作目录：DAPI 通道和延时需要单独的图像。
注意：文件名应以“well + 行号 + 列号”开头，以适合我们的脚本。如果没有，可以在第 13 行进行更改。所有图像都应导出为 tiff 文件（图 2）。

图2.Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift 用户界面的屏幕截图。下划线部分是导出的tiff文件的路径。请注意，文件夹中的图像文件名应遵循以下规则： well + 行号 + 列号 + 其他详细信息，例如 WellA01_ChannelDAPI _Seq0000_ Z01_C1.tif (L12)。

c.打开Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift.m 。
d.（可选）更改第 4 行中的细胞核大小。应根据您的细胞系更改细胞核大小（在本例中，我们使用 4 进行 SAS 以便最好地区分每个细胞）。
e.更改第 3 行中的文件路径，并根据第 6 行和第 8 行中的实验设置填写行号和列号。（在本例中，我们选择行 B–G，列 1–12，因此我们填写 2:7行和列分别为 1:12。）（图 3）

Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift中的行号和列号对应的 96 孔板设置示例

该脚本基于修改后的阈值选择方法定义核。通过测量荧光信号（DAPI；通道1）来定义每个细胞核的质心，我们可以从所有采集的图像中获取每个细胞的位置信息。这使得用户可以获得小区位置的所有信息。
我们首先检索每个细胞的质心以进一步计算细胞运动。估计距离内 DAPI 通道中的最高信号将被视为细胞质心，我们将这些信号标记为图像中的红点（图 4，左图）。为了确认细胞核定义的正确性，我们检查代表性图中红点和绿点（细胞核掩模）的重叠（图 4，右图）。原始的 Hoechst 信号标记为红色，我们的核掩模标记为绿色。细胞核掩模基于 Hoechst 信号，对尺寸和形状有额外的限制，以消除我们分析中的噪音（例如细胞碎片）。红点和绿点重叠比例越高，识别细胞的精度越高。然后，我们比较质心和核掩模之间的图像，以仔细检查我们的质心是否位于正确的位置。

图4. 运行 Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift 后捕获细胞核的示例。 (A)红点是与作为我们质心的周围信号相比最高的 Hoechst 信号；这个标记的质心区域在 (C) 中被放大。 (B) 面板中的图像与处理后的 Hoechst 信号和原始 Hoechst 信号（红色）生成的核掩模（绿色）重叠，该信号在 (D) 中放大。 (A)和(B)中的白色箭头表示细胞迁移的方向，白色方块是选择用于放大的细胞。

2.监测细胞运动：Z2_trace 细胞核
该脚本计算每个时间范围之间单元格位置的变化。
a.打开Z2_trace nuclei.m 。
b.更改第 3 行中的文件路径，并根据第 7 行和第 9 行中的实验设置填写行号和列号（图 5）。
c.（可选）更改核大小（第 4 行）。细胞核大小应根据您的细胞系进行更改（在本例中，我们使用 SAS 的 4 来最好地区分每个细胞）。
d.单击运行。

图 5. Z2_trace nuclei用户界面的屏幕截图。下划线和圆圈区域需要在每次实验中进行调整。

3.获取细胞信息：Z3_getcellparameters062945
使用 MATLAB 分析速度、协调性和方向性等参数。
a.打开Z3_getcellparameters062945.m 。
b.更改第 3 行中的文件路径，并根据第 7 行和第 9 行中的实验设置填充行号和列号（图 6A）。
c.（可选）更改第 4 行中的细胞核大小。应根据您的细胞系更改细胞核大小（在本例中，我们使用 4 进行 SAS 以便最好地区分每个细胞）。
d.单击运行。

定义分析细胞的数量：
a.在第 16 行填写您想要分析的细胞编号（图 6A）。选定的单元格应标记为红色。下面是分析 1,000 和 10,000 个细胞的示例（图 6B）。请注意，对于随机迁移，我们选择框架中的所有单元格。

图 6. 用于迁移分析的细胞数量的不同参数设置示例。 (A) Z3_getcellparameters062945 的用户界面。圆圈区域定义了跟踪中分析的细胞数量。 (B) 左图显示 1,000 个细胞的分析，右图显示 10,000 个细胞的分析。黑点代表整个图像中的细胞，红点代表要分析的细胞。我们还显示从 0 到 1,600 的 XY 轴，以便更好地从图形和导出的数据中找到单元格的准确位置。

b.cell data的文件下。文件名：井名+ bestsp 。
c.参数将保存到多个电子表格中（图7和图8，表1）；每个电子表格都是迁移行为的一个参数。导出数据的示例如图 8 所示。请注意，角度数据 ( wellang ) 需要通过公式进一步计算：π/2 - θ。 θ 是电子表格上显示的原始值。

图 7.运行此脚本后工作区中Z3_getcellparameters062945的屏幕截图。运行Z3_getcellparameters062945后已生成MATLAB文件，将圈出的文件导出至Excel以供进一步分析。

图 8. 细胞迁移分析中使用的变量的示意图。方向性是细胞运动相对于伤口方向的角度。取自 Yu 等人。（2021）。

表格1。移民统计
多变的计算描述
威朗π /2-α孔中细胞运动相对于伤口方向的平均角度
威尔科科斯余弦θ孔中的平均细胞间协调
韦尔登每帧中的细胞总数该帧的单元号。请注意，细胞迁移速度可能会受到细胞密度的影响，因此每个孔之间的数据必须非常一致
韦尔斯皮德距离/时间孔中的平均细胞迁移速度。单位为μm /h。
韦尔珀位移/距离孔中细胞运动方向性的平均一致性

为了使定义更加清晰，图 7 解释了所使用的变量。
尽管我们的脚本生成所有变量，但我们使用不同的参数来分析不同的细胞迁移。对于伤口愈合测定，我们分析了细胞迁移的速度、角度、协调性和持久性。然而，我们不分析随机迁移的细胞角度，因为我们将细胞角度定义为细胞偏离伤口方向的方式。在这里，我们提供了用于分析伤口愈合测定结果的数据示例（图 9）。

图 9. 细胞数据群示例。每个数据点对应于每个孔的平均值。这些数据来自96 孔板的B–G 行、2 – 9 列。

这些数据可以绘制成条形图以进行可视化（图 10）。

图 10. 细胞迁移分析的条形图示例。取自 Yu 等人。（2021）。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•于等人。（2021）。合成运动障碍筛选揭示了驱动细胞迁移的集成 STK40-YAP-MAPK 系统。科学。副词。 7(31)：eabg2106 （图 1，图 C 和 G，图 2，图 B 和 C）。

致谢

资助：这项工作得到了台湾科学技术部（MOST 107-2320 -B-002-038-MY3和 MOST 108-2926-I-002-002-MY4）、国立台湾大学医院（ NTUH 106-T02、NTUH 107-T13、NTUH 108-T13 和 VN 109-14）以及台湾肝脏疾病预防和治疗研究基金会。该协议改编自 Yu等人。（2021）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。
参考

Friedl, P. 和 Gilmour, D. (2009)。形态发生、再生和癌症中的集体细胞迁移。纳特。莫尔牧师。细胞生物学。 10（7）：445-457。
Jin, W.、Shah, ET、Penington, CJ、McCue, SW、Chopin, LK 和 Simpson, MJ (2016)。划痕测定的重现性受到初始融合程度的影响：实验、建模和模型选择。 J.理论。生物。 390：136–145。
Luster, AD、Alon, R. 和 von Andrian, UH (2005)。炎症中的免疫细胞迁移：当前和未来的治疗目标。纳特。免疫学。 6（12）：1182-1190。
魏杰，CJ（2009）。发育中的集体细胞迁移。 J.细胞科学。 122（18）：3215-3223。
Yu, LY, Tseng, TJ, Lin, HC, Hsu, CL, Lu, TX, Tsai, CJ, Lin, YC, Chu, I., Peng, CT, Chen, HJ, 等。（2021）。合成运动障碍筛选揭示了驱动细胞迁移的集成 STK40-YAP-MAPK 系统。科学。副词。 7(31)：eabg2106。

补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.Z1_calcnuclei_adjustedPlateShift.m
2.Z2_trace核.m
3.Z3_getcellparameters062945.m