材料与试剂

生物材料

1.小鼠胚胎干细胞（源自 C57Bl/6J 囊胚）
2.中国科学院昆明动物研究所毛丙宇博士友情提供）

材料

1.35毫米细胞培养皿（Corning，目录号： 430165 ）
2.60 mm 细胞培养皿（NEST，目录号： 705001 ）
3.100毫米培养皿（NEST，目录号： 704001 ）
4.150毫米培养皿（Corning，目录号： 430599 ）
5.200 μL PCR管（ Axygen ，目录号： AXYPCR02LC ）
6.1.5 mL离心管（ Axygen ，目录号： AXYMCT150C ）
7.15 mL离心管（NEST，目录号： 601052 ）
8.50 mL离心管（NEST，目录号： 602002 ）
9.0.22μm过滤器（Millipore，目录号： SLGP033RB ）

试剂

1.5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（ EdU ）（Life Technology，目录号： A10044）
2.胸苷（Sigma-Aldrich，目录号： T1895）
3.37％（w/v）甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号： F1635）；注意：有毒
4.氯化钠（Na Cl ）（Sigma-Aldrich，目录号： S9888）
5.氯化钾（ KCl ）（Sigma-Aldrich，目录号： P3911 ）
6.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号： P5655）
7.磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号： S5136）
8.甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号： G7126）
9.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号： X100）
10.BSA（Sigma-Aldrich，目录号： V900933）
11.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号： D8418）
12.五水合硫酸铜 (II) (CuSO 4 · 5H 2 O)（Sigma-Aldrich，目录号： 209198）
13.(+) L-抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号： A4034）
14.生物素叠氮化物（Invitrogen，目录号： B10184）
15.SDS（生工生物科技，目录号： A600485）
16.Tris（生工生物科技，目录号： A610195）
17.甘油（ Sangon Biotech，目录号： A600232）
18.溴酚蓝（生工生物科技，目录号： A602230）
19.EDTA（Sigma-Aldrich，目录号： E9884）
20.琼脂糖（默克，目录号： A4718）
21.二硫苏糖醇（DTT）（Merck，目录号： D8255）
22.抑肽酶（默克，目录号： A6279）
23.亮肽素（默克，目录号： L2884）
24.链霉亲和素琼脂糖（ Novagen ，目录号： 69203-3）
25.RNase 抑制剂（ Thermo Fisher，目录号： EO0381）
26.焦碳酸二乙酯（ DEPC ）（Sigma-Aldrich，目录号： D5758）
27.蛋白酶K （ Thermo Fisher，目录号：4333793）
28.氯仿（ Sigma-Aldrich，目录号：366911 ）
29.异丙醇（ Sigma-Aldrich，目录号：W292912 ）
30.醋酸铵（ Sigma-Aldrich，目录号：A7262）
31.酒精（ Sigma-Aldrich，目录号：AX0442 ）
32.乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
33.TRIzol （赛默飞世尔，目录号：15596026）
34.羟基脲（HU）（Sigma-Aldrich，目录号：H8627）

解决方案

1.教育大学解决方案（参见食谱）
2.DEPC-H 2 O（参见配方）
3.胸苷溶液（参见食谱）
4.Chase 中型（参见食谱）
5.1× PBS 溶液（参见配方）
6.1% 甲醛溶液（参见配方）
7.1.25 M 甘氨酸溶液（参见配方）
8.透化缓冲液（参见配方）
9.洗涤缓冲液（参见配方）
10.生物素叠氮化物溶液（参见食谱）
11.100 mM CuSO 4溶液（参见配方）
12.L-抗坏血酸钠溶液（参见食谱）
13.裂解缓冲液 (pH 8.0)（参见配方）
14.盐洗缓冲液（参见配方）
15.2× SDS Laemmli样品缓冲液 (2× SB)（参见配方）
16.50× Tris醋酸盐-EDTA (TAE) 缓冲液（参见配方）

食谱

1.教育大学解决方案
试剂（储存用）最终浓度数量
教育(50 毫克)10米米_25.2毫克
二甲基亚砜不适用10毫升
全部的不适用10毫升

试剂（用于细胞标记）最终浓度数量
教育(10 毫米)10μM _ _1μL _ _
胚胎干细胞中等（参见步骤 A1）不适用999μL _ _
全部的不适用1毫升

2.DEPC-H 2 O
试剂最终浓度数量
DEPC 不适用1毫升
水分子_不适用999 毫升
全部的不适用1,000 毫升

3.胸苷溶液
试剂（储存用）最终浓度数量
胸苷 (1 克)10毫米24.2毫克
DEPC-H 2 O不适用10毫升
全部的不适用10毫升

4.大通媒体
试剂（用于细胞标记）最终浓度数量
胸苷 ( 10 mM )10μM _ _1μL _ _
胚胎干细胞中等的不适用999μL _ _
全部的不适用1毫升

5.1× PBS 溶液
试剂最终浓度数量
氯化钠137毫米8克
氯化钾3毫米0.2克
Na 2 HPO 48毫米1.15克
KH 2 PO 42毫米0.24克
DEPC-H 2 O不适用1升
全部的不适用1升

6.1%甲醛溶液
试剂最终浓度数量
甲醛（37%）1%0.27毫升
DEPC-PBS不适用9.73毫升
全部的不适用10毫升

7.1.25 M 甘氨酸溶液
里根最终浓度数量
甘氨酸1.25米46.92克
DEPC-H 2 O不适用500毫升
全部的不适用500毫升

8.透化缓冲液
试剂最终浓度数量
海卫一 X-1000.25%2.5毫升
DEPC- PBS不适用997.5毫升
全部的不适用1升

9.洗涤缓冲液
试剂最终浓度数量
牛血清白蛋白0.5%0.5克
DEPC-PBS不适用100毫升
全部的不适用100毫升

10.生物素叠氮化物溶液
试剂最终浓度数量
生物素叠氮化物1毫米1毫克
二甲基亚砜不适用1.624毫升
全部的不适用1.624毫升

11.100 mM CuSO 4溶液
试剂最终浓度数量
CuSO 4 · 5H 2 O100毫米1.248克
DEPC-H 2 O不适用50毫升
全部的不适用50毫升

12.L-抗坏血酸钠溶液
试剂最终浓度数量
(+) L-抗坏血酸钠100毫米20毫克
DEPC-H 2 O不适用1毫升
全部的不适用1毫升

13.裂解缓冲液 (pH 8.0)
里根最终浓度数量
特里斯10毫米1.21克
安全数据表7毫米2克
DEPC-H 2 O不适用200毫升
核糖核酸酶抑制剂10U/ μL200微克_
蛋白质蛋白1微克/毫升200微克_
亮肽素1微克/毫升200微克_
全部的不适用200毫升

14.盐洗缓冲液
试剂最终浓度数量
氯化钠1M14.625克
DEPC-H 2 O不适用不适用
全部的不适用250毫升

15.2× SDS Laemmli样品缓冲液 (2× SB)
试剂最终浓度数量
安全数据表123毫米0.4克
溴酚蓝1毫米0.01克
甘油18%2毫升
1 M Tris (pH 6.8)
1M数码电视1毫米
1 毫米1.25毫升
1.25毫升
水分子_不适用8毫升
全部的不适用12.5毫升

16.50× Tris醋酸盐-EDTA (TAE) 缓冲液
试剂最终浓度数量
特里斯2M242克
乙酸_不适用57.1毫升
乙二胺四乙酸0.1M37.2克
水分子_不适用942.9 毫升
全部的不适用1,000 毫升

设备

1.Thermo Forma 系列 II 水套 CO 2培养箱（ Thermo Scientific，型号：3111）
2.尼康日食Ti倒置显微镜（尼康，型号： Ti ）
3.超声波细胞破碎仪（ Diagenode 、 Bioruptor Plus）
4.90 µm 尼龙网（Small Parts Inc.，目录号： B000FN0PGQ）
5.用于孵化的滚动摇床（ Thermo Scientific，型号：PHMT ）
6.实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，型号：CFX96Touch）
7.涡旋器（VWR 模拟涡旋混合器，目录号：10153-838）
8.4℃冰箱（海尔，型号： HYC-1090 ）
9.-20℃冷冻柜（海尔，型号： DWL262 ）
10.NanoDrop （赛默科技，ND2000 ）
11.- 8 0 °C 冷冻柜（ Thermo Scientific ，型号：TSX60086VRAKLB）

软件_

1.Microsoft Excel（微软， https://products.office.com/en-us/excel ）（Office Excel 2016， 9月22日， 2015）
2.GraphPad Prism（GraphPad， https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）（GraphPad Prism 8.3.0，2019 年 10 月 29 日）

程序

A.EdU标记细胞

1.用于制备mESC培养基和 mESCs和NIH3T3的培养和扩增，请参阅我们的出版物（张等人， 202 3）。在EdU标记之前，将细胞与 37 °C预热的新鲜mESC一起孵育培养基培养 2 小时，每个直径 15 cm 的培养皿含有 25 mL 培养基，其中含有 ~1.5 × 10 7 个细胞。
2.要进行EdU标记，请将培养皿放入生物安全柜，将 25 μL EdU库存(10 mM) 添加到每个培养皿的 25 mL 预先存在的培养基中，并轻轻混匀，以确保EdU的最终浓度为10μM 。 _ _根据S 期mESC的百分比（超过 60%），我们计算出每个培养皿中至少有 9 × 10 9 个细胞被EdU标记。
3.快速将培养皿放回培养箱并标记 10 分钟。
注意：通常，叉相关 RNA 成分表现出低剂量方式。为了提高生产力，使用具有高比例 S 期细胞的细胞系对于确保 RNA 输出至关重要。在我们的研究中，我们使用了mESC ，因为它们始终使 60% 以上的细胞处于 S 期。如果您需要评估复制应激动态，请将基因毒性药物（例如 4 mM 羟基脲 (HU)）添加到培养皿中并孵育 2 小时。
4.为了获得复制后染色质样品，除去EdU阳性培养基，用每次 5 mL 的预热追随培养基小心洗涤细胞 3 次。 Chase培养基，含有10 μM t hymidine ，用于与EdU竞争追逐DNA复制。孵育 1 小时后， EdU标记的 DNA 已构建成成熟的染色质。因此，该组用作染色质对照。然后，添加 25 mL 预热的追逐介质并孵育 1 小时。

B.甲醛交联和收获细胞

1.完成EdU标记、胸苷追踪或药物处理后，快速除去培养基，并向每个培养皿中添加10 mL 含有 1% 甲醛的冰冷 PBS ，室温固定细胞 20 分钟。
注意：甲醛对人体健康有毒。
重要：固定前不要用 PBS 缓冲液清洗细胞，因为 PBS 清洗可能会导致 RNA 降解。
2.在每个培养皿中添加 1 mL 1.25 M 甘氨酸以淬灭甲醛。
3.刮取细胞并将收获物放入 50 mL 无 RNase离心机中管.记录固定体积。
关键：始终将管子放在冰上。
4.× g旋转5 分钟。
5.除去上清液。
6.含有10 U/ μL RNase 抑制剂的冰冷 1 × PBS缓冲液洗涤沉淀物 3 次，体积与步骤 B3 中的固定体积相同。
暂停点：样品可以快速浸入液氮中，并在-80 °C下保存至少四个星期。

C.细胞透化

1.含有 10 U/ μL RNase 抑制剂的冰冷透化缓冲液中。将细胞密度调整为 1 × 10 7个细胞/ mL。充分涡旋并在摇床上 (40 rpm) 室温孵育 30 分钟。
2.× g离心5 分钟。
3.除去上清液。
4.10 U/ μL RNase 抑制剂的冰冷 1× PBS 洗涤细胞；使用的体积等于步骤 C1 中的透化缓冲液。
5.× g离心5 分钟，去除上清液。
6.重复步骤C4和C5一次。将样品置于冰上进行点击反应。

D.点击反应

1.准备表 1 中列出的点击反应混合物。

表 1.点击反应混合物（ 1 × 10 8 个细胞5 mL ）
试剂库存集中度_工作浓度控制反应体积( mL )实验反应体积( mL )
1× 公共广播公司4.2254.225
生物素叠氮化物1毫米10μM _0.05
硫酸铜4100毫米2毫米0.10.1
(+) L-抗坏血酸钠100毫米10毫米0.50.5
二甲基亚砜0.05
核糖核酸酶抑制剂40U / μL1U / μL0.1250.125
总容积5.05.0

批判的：生物素叠氮化物对光敏感。反应混合物应避光保存。
批判的： Cu II在水中不稳定。反应混合物应新鲜配制。

2.将细胞重悬至点击反应混合物中。调整反应体积使密度达到1 × 每 5 mL 10 8 个细胞。
3.涡旋并在室温下在摇床上 (40 rpm) 孵育 2 小时。
关键：将反应管保持在黑暗中。
4.900 × g离心5 分钟，去除上清液。
5.10 U/ μL RNase 抑制剂的冰冷 1× PBS 缓冲液洗涤细胞。使用的 PBS 体积等于步骤 C1 中的透化缓冲液。
6.× g离心5 分钟，去除上清液。
7.重复步骤 D 5和 D 6一次。

E.细胞裂解和超声处理

1.将裂解缓冲液置于冰上。使用前添加亮抑酶肽、抑肽酶和RNase 抑制剂。
2.7个细胞添加 100 μL裂解缓冲液并重新悬浮。将细胞悬液转移至 1.5 mL 无 RNase离心机中管。
3.超声仪对细胞进行超声处理，设置如下：脉冲，20 s； 40秒暂停； 15个周期；功率：13 – 16 瓦。
关键：超声处理过程中应将管子浸入冰冷的水浴中，以防止过热。
注意：超声处理后，上清液应澄清，但不混浊。
4.以 12 , 000 × g离心 15分钟。
5.上清液通过90 µm 尼龙网转移并收集至新的1.5 mL 无 RNase 离心管中；然后，将样品放在冰上。
注意：要检查此步骤中的 DNA 片段大小，请吸取 5 μL上清液以提取 DNA。使用1% 琼脂糖凝胶在 120 V 下进行电泳 30 分钟以检测 DNA 片段（图 1）。

图 1.超声处理后的 DNA 片段。 DNA片段的大小主要集中在200-1000个碱基对范围内。

6.DNA提取。
a.取步骤 E5 上清液 5 μL ，加入蛋白酶 K 至终浓度 50 – 100 μg /mL，混匀， 50 ℃孵育 3 h。
b.加入等体积的氯仿/异丙醇（体积比：24:1），混匀，10,000 × g离心10 min，将上清液转移至新的离心管中。
c.添加 10% 体积的 10 M 醋酸铵并轻轻混合。
d.添加两倍体积的异丙醇并轻轻混合。
e.10,000 × g离心10 分钟，弃去上清液。
f.加入等体积的75%乙醇混匀，10,000 × g离心5 min，弃上清。
g.风干沉淀 5 分钟，用 10 μL双蒸水溶解进行电泳。
7.用等体积的冰冷 PBS 稀释样品，以提高后续生物素捕获的效率。确保添加1 μg /mL亮肽素、 1 μg /mL抑肽酶和10 U/ μL RNase 抑制剂。
8.样品吸取 15 μL ，与 15 μL 2× SB充分混合，95 °C 煮沸 10 分钟。这些样品可用作针对复制叉蛋白（例如 PCNA）的免疫印迹的输入。
关键：此步骤至关重要，因为 PCNA 的免疫印迹可用于确认下拉效率和特异性。
9.样品吸取 15 μL ，与 500 μL TRIzol充分混匀，-80 °C 保存以供 RNA纯化。
Critical：这一步很关键；样品将用于计算后续 qPCR 确认中的富集倍数变化。

F.链霉亲和素捕获

1.涡旋链霉亲和素琼脂糖珠。
2.计算每个样品的琼脂糖珠体积。通常，每 1 × 10 8 个细胞使用100 μL链霉亲和素琼脂糖珠。
3.使用前用裂解缓冲液清洗链霉亲和素琼脂糖珠两次，用 PBS 清洗一次，每次清洗 1 mL。
4.将珠子添加到每个样品中并在 4 °C 下孵育 16 小时在旋转器上（40 rpm）。
关键：将旋转器保持在黑暗中。
5.以 1,800 × g离心 1 分钟并除去上清液。
6.用冰冷的裂解缓冲液清洗珠子 3 次，并用 1 mL 盐清洗缓冲液清洗一次。每次洗涤时，样品应在离心前旋转 5 分钟。
G.蛋白质和 RNA 的洗脱

1.将每个样品的磁珠均等地分成两部分，分别洗脱蛋白质和RNA成分。
2.将 2 μL 2× SB 添加到一份中，充分混合，并将样品在 95 °C 下煮沸25分钟以洗脱蛋白质。这些已准备好用于免疫印迹。
3.为了洗脱 RNA，将 500 μL TRIzol添加到每个样品的另一部分中，并充分混合。
4.每管中加入 100 μL氯仿，涡旋 30 s，冰上放置 5 min。
5.× g离心 4°C 下 10 分钟。
2.将每个样品的上清液转移到新的无 RNase 管中并记录体积。
3.添加等体积的异丙醇并在冰上放置 10 分钟。
4.× g离心 4°C 下 10 分钟。除去上清液。
5.用 75% 酒精清洗沉淀。
6.× g离心 4°C 下 10 分钟。除去上清液并风干 1 分钟。
7.添加 40 μL无 RNase的双蒸水以溶解沉淀。
8.NanoDrop测量 RNA 浓度。从 1 × 10 8个细胞中可提取大约 200 – 400 ng RNA 。
注意：RNA纯化至关重要；光密度（OD）260/230值应在1.5至2.4之间，OD260/280值必须在1.8至2.4之间。

数据分析

1.免疫印迹可用于确认叉 DNA 片段的下拉规范。 PCNA 和组蛋白 H3 可以分别用作叉结合蛋白标记和成熟染色质标记。请参阅我们出版物中的补充图 1A（ Zhang et al. , 202 3 ）。
2.RNA 样品可用于 qPCR 分析或 RNA 测序（图 2 和 3）。请参阅我们出版物中的图 1B、C 和 D ( Zhang et al. , 2023 )。

协议验证

图 2.在小鼠胚胎干细胞 ( mESC )和NIH3T3 细胞中基于新生 DNA ( iROND ) 的LncRNA筛选中分离 RNA 的设计（ Zhang等人， 202 3 ）。我们设置了以下实验项目：1）无点击组：细胞用EdU脉冲标记，但省略点击反应，作为非特异性结合对照。 2）Click-正常组：细胞在正常条件下培养，并进行标准iROND ，作为稳态样品。 3）Click-HU组：细胞经EdU脉冲标记，并用4 mM羟基脲（HU）处理诱导复制应激，作为基因毒性样品。 4）Click-Protease组：所有程序与第3组相同，额外用100μg/mL蛋白酶K处理30min以降解蛋白质成分。 5）点击追踪组：用胸苷追踪标记细胞以获得成熟的染色质对照。

图 3. RNA 测序和生物信息学比较在指定条件下从小鼠胚胎干细胞 ( mESC ) 和 NIH3T3 细胞的新生 DNA ( iROND ) 样品中分离 RNA （ Zhang等人， 202 3 ）。每组进行两次生物学重复。值得注意的是， mESC Click-HU 组中一组LncRNA显着富集。

一般注意事项和故障排除

1.与已发表的研究LncRNA基因组动力学或稳定性的方法相比， iROND对于纯化叉相关的 LncRNA 亚群更具特异性（ Gylling）等等人， 2020 年；王等等人， 2021 ）。一个限制是iROND每次检测都需要数十亿个细胞。 S 期细胞越多，检测就越容易进行。在我们的研究中，我们使用了mESC和 NIH3T3 细胞；两者增殖速度都非常快。这对于iROND 的成功至关重要。我们假设如果使用低增殖细胞系可能会很困难。或者，在EdU标记之前同步到 S 阶段可能是一个合理的选择。
2.EdU标记和胸苷追踪步骤中，预热培养基对于在很短的时间内最大限度地减少对细胞的干扰非常重要。
3.为了尽可能具体地标记复制叉， EdU标记必须在 10 分钟内完成。一个人在很短的时间内处理这么多文化菜肴是相当困难的。因此，建议两到三人合作。

致谢

该工作得到了国家自然科学基金（31930027至PZ和32000422至WZ）、国家重点研发计划（2021YFA1102002）、云南省基础研究项目（202001AT070140和2019FB049）的支持。该协议源自Zhang等人描述的测定系统。（202 3 ）。

利益竞争

作者没有竞争利益。

参考

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