材料与试剂

细胞培养

1.细胞
a.SAS 和 HSC-3 细胞 [来自 JS Chia 实验室（国立台湾大学，台北，台湾）的礼物]
b.HepG2 和 HEK-293T 细胞 [美国典型培养物保藏中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）]
c.HUVEC 细胞（Lonza，巴塞尔 Stücki，瑞士）
d.HaCaT细胞 [美国典型培养物保藏中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）]
2.培养基
a.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Gibco， Thermo Fisher Scientific，目录号：11965092 和HyClone ，目录号： 16750-074 ），适用于 SAS、HSC-3、HepG2 和 HEK-293T 细胞
b.的内皮细胞生长培养基 2（EGM2）（Lonza，目录号： CC-3162 ）
3.1% 青霉素/链霉素 (P/S)（Gibco，目录号： 15140122 ）
4.10% 胎牛血清（FBS）（ HyClone ，目录号： 12389802 ）
5.0.5% 胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：sc-363354）
6.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CM）

涂层和感染

1.96孔板（ Thermo Fisher Scientific， Nunc TM ，目录号： 165305）
2.涂层室载玻片[ Thermo Fisher Scientific，目录号： 155411（4 孔）或 Nunc Lab-TEK，目录号： 155383]
3.6孔板（ Jetbiofil ，目录号： TCP011006）
4.聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号： A3890401 ）
5.胶原蛋白（100 μg /mL；胶原蛋白 I，牛）（Gibco，目录号： A1048301 ）
6.对照慢病毒或 STK40 [shRNA 质粒，购自国家 RNAi 核心 (NRC；中央研究院，台北，台湾)； shSTK40质粒转染HEK-293T细胞产生慢病毒，对照慢病毒直接从NRC购买]
7.嘌呤霉素（2 μg /mL）（Sigma-Aldrich，目录号： A1113803 ）
8.Blasticidin （10 μg /mL）（Sigma-Aldrich，目录号： 1 5205 ）

免疫荧光染色前使用的试剂

1.20 mM HEPES（Gibco，目录号：15630080 ）
2.0.1% BSA（ BioShop ，目录号： ALB001 ）
3.25 ng/mL FGF1（Invitrogen，目录号： PHG0244 ）
4.10 U 肝素（Sigma，目录号： H3393）

药品

1.Trametinib 100 nM （LC 实验室，目录号： T-8123)
2.Y27632 5 μM （Sigma-Aldrich，目录号：688000）
3.布雷他汀5 μM （Sigma-Aldrich，目录号：203390）
4.维替泊芬 2.5 μM （ MedChemExpress ，目录号： HY-B0146)
5.瘦霉素 B 100 nM （Cayman Chemical Company，目录号：10004976）

免疫荧光染色

1.4% 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
2.0.25% Triton X-100（JT Baker，目录号： 10421871）
3.一抗：纯化的小鼠抗 PXN（BD Biosciences，目录号：610051 和 610052），溶于 1% BSA。 Paxillin 被选为 FA 的最佳代表，因为与其他抗体（如talin和 vinculin）相比，其可见度更清晰
4.5% BSA 用于封闭
5.4',6-二氨基-2-苯基吲哚 (D API); 10 μg /mL（Invitrogen，目录号：D1306）
6.二抗：山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（H + L）交叉吸附二抗和Alexa Fluor 488（Invitrogen，目录号： A11001）1:500；山羊抗小鼠 IgG (H + L) 交叉吸附二抗和 Alexa Fluor 594（Invitrogen，目录号： A11005）以 1:500 溶于 1% BSA

设备

1.显微镜（尼康 Eclipse Ti）
2.相机（尼康 DS-Qi2）
3.激发光源：X-cite 120（ Excelitas Technologies Corp.）
4.滤光片立方体（Chroma Technology Corporation）
a.DAPI滤光片组（激发波长：360 nm；二向色镜波长：400 nm；发射波长：460 nm）
b.异硫氰酸荧光素 (FITC) 滤光片组（激发波长：480 nm；二向色镜波长：505 nm；发射波长：535 nm）
c.德克萨斯红 (Tx-Red) 滤光片组（激发波长：560 nm；二向色镜波长：595 nm；发射波长：630 nm）
d.黄色荧光蛋白（YFP）滤光片组（用于过表达）（激发波长：500 nm；二向色镜波长：520 nm；发射波长：542 nm）
e.自荧光塑料载玻片（Chroma Technology Corporation，目录号： 92001）

软件

1.MATLAB（MathWorks，纳蒂克，马萨诸塞州，美国）
安装MATLAB 图像处理工具箱以运行脚本。
2.Microsoft Excel（美国华盛顿州雷德蒙德）
程序

A.免疫荧光固定的准备

1.将 SAS、 HaCaT 、HUVEC 或 HepG2 细胞接种到 6 孔板的培养基中。对于 SAS 和HaCaT细胞，种子 3 × 10 5 个细胞/孔。汇合度为 60% 的种子细胞。对于 SAS、 HaCaT和 HepG2 细胞，使用含有 1% 青霉素/链霉素、10% FBS 和 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 的 DMEM 作为培养基。对于 HUVEC 细胞，使用 EGM2 作为培养基。
2.第二天，将敲低或过表达 STK40 的慢病毒转导至接种的 SAS、 HaCaT 、HUVEC 或 HepG2 细胞中。慢病毒是通过将（1）从中央研究院购买的靶向STK40的shRNA质粒或（2）靶向STK40的过表达构建体的质粒转染到HEK-293T细胞中来产生的。对于我们的 STK40 过表达构建体，YFP 被标记在 STK40 的细胞质结构域上，以确保显微镜下的荧光可见度。
3.在 6 孔板中用抗生素（例如嘌呤霉素或杀稻瘟素）在 24-48 小时内选择细胞。
4.在选择抗生素的同一天，在新的 96 孔板或 4 或 8 孔室载玻片中进行胶原蛋白包被。在 PBS 中涂上聚-D-赖氨酸 100 μg /mL，在 37°C 下放置 5 分钟。用 PBS清洗 SAS、 HaCaT 、HUVEC 或 HepG2 细胞，然后用PBS 中的100 μg /mL 牛胶原蛋白包被细胞。胶原蛋白涂层可确保更好的细胞附着，以促进细胞迁移和随后观察粘着斑。将室载玻片或 96 孔板在 37°C 下孵育过夜。
5.第二天，将 6 孔板中的细胞重新接种到包被的 96 孔板或 4 或 8 孔室载玻片上。为了观察新生和突出的 FA，转导的细胞以不同的方式重新接种：
a.观察新生 FA：以更高密度、70%–80% 汇合度的种子细胞进行伤口刮擦。稍后将分析伤口第一排的 FA。对于 SAS 单元，种子 2–3 × 10 4 个细胞/96 孔板和 1.5 每 4 孔室载玻片× 10 5 个细胞。对于HaCaT细胞，种子 1 × 10每 96 孔板4 个细胞，5 个 × 10 4每 4 孔室载玻片。
b.为了观察显着的 FA：以较低密度、40% 汇合度的种子细胞。细胞将进行随机迁移，其所有重要的 FA 将在稍后进行分析。对于 SAS 细胞，每个 96 孔板接种 6,000 个细胞，并在每个孔板中接种 3 个细胞 × 10 4 个细胞/4 孔室载玻片。对于HaCaT细胞，每 96 孔板接种 5,000 个细胞，并接种 2.5 个细胞 × 10 4 个细胞/4 孔室载玻片。 HaCaT细胞的突出 FA在本协议中显示为演示。
6.根据细胞组，在添加或不添加药物的补充培养基中于 37°C 孵育细胞。补充培养基含有 20 mM HEPES、0.1% BSA、25 ng/mL FGF1 和 10 U 肝素。实验组包括未治疗组和药物治疗组。
a.未治疗组。
b.药物治疗组：
我。 Blebbistatin (5 μM )：抑制肌球蛋白 II。
二. Y27632 (5 μM )：抑制 ROCK（Rho 激酶）。添加Blebbistin或 Y27632 来抑制力介导的 FA。 FA是STK40共同抑制的结果，而力产生的FA告诉我们STK40对FA的影响是否是由于力介导的FA强化所致。
三. Trametinib (100 nM )：抑制 MAPK 激酶。 FA是STK40共同抑制的结果，MAPK激酶告诉我们MAPK是否参与了STK40对FA的影响。
四. Leptomycin (100 nM )：抑制输出蛋白以阻止核输出。瘦霉素对核输出的阻断导致我们的另一个靶蛋白 YAP（Yes 相关蛋白）在细胞核中积累。 STK40和exportin共同抑制的FA结果为我们探讨YAP的空间分布是否参与STK40对FA的影响提供了部分线索。
v. 维替泊芬 (2.5 μM )：抑制 YAP 活性。 FA是STK40共同抑制的结果，YAP告诉我们YAP是否参与了STK40对FA的影响。此外，FA 对 STK40、YAP 和 MAPK 的抑制结果支持了我们发表的论文中 STK40-YAP-MAPK 系统对 FA 的影响（Yu 等人，2021）。
为了观察新生的和突出的 FA，药物治疗的持续时间是不同的。
a.为了观察新生的 FA，请按如下方式用药物处理细胞：
我。 5μM _ blebbistatin 、5 μM Y27632 或 100 nM曲美替尼：过夜
二. 100 nM细霉素 B：1 小时
三. 2.5 μM维替泊芬：6 小时。
转到本节中的步骤 7-10 以创建伤口划痕。
b.为了观察显着的 FA，请按如下方式使用药物处理细胞：
我。 5μM _ blebbistatin 、5 μM Y27632 或 100 nM曲美替尼：过夜
二. 100 nM细霉素 B：3 小时
三. 2.5 μM维替泊芬：8 小时。
直接进入B部分进行固定。
7.孵育后，将介质转移到新的 96 孔板或室载玻片上以保留介质。用 PBS 清洗细胞。
8.使用用于腔室载玻片的尖端和用于浸入 PBS 中的 96 孔板的划痕器来创建伤口。对于 96 孔板，在孔的中间形成水平伤口。要为室载玻片造成伤口，请画十字以在每个孔中造成两个伤口。
9.受伤后，将培养基放回细胞上。
10.将细胞在 37°C 下再孵育 2 小时。在此期间，细胞向伤口迁移，如视频1所示。该视频演示了SAS细胞伤口愈合迁移10小时。 2 小时迁移的目的是确保细胞向伤口迁移以形成新生 FA（Olson 和Nechiporuk ，2021）。向伤口迁移的细胞的片状伪足被拉伸。在这种情况下新生的 FA 是可见的。

视频 1. SAS 细胞的伤口愈合迁移 10 小时

B.免疫荧光固定和染色

1.用含 4% 多聚甲醛的 PBS 在室温下固定细胞 15 分钟。
2.在室温下用 0.25% Triton X-100 渗透细胞 10 分钟。
3.室温下用 5% BSA 封闭细胞 1 小时。
4.将细胞与一抗（含 1% BSA 的 PBS）在 4 °C 下孵育过夜。抗 PXN 用作 FA 染色的一抗。
5.用二抗和PBS 中 1% BSA 中的10 μg /mL DAPI (10 μg /mL) 染色细胞。
6.使用 Nikon Eclipse Ti 进行 FA 成像。专注于固定细胞的 FA 并拍摄 z 堆栈图像。拍摄步长为 1 μm的 FA 图像。我们拍摄了 7 张总范围为 5 μm的 z 堆栈图像进行分析（图 1A）。

图 1. 突出的 Z 堆栈图像 HaCaT细胞的粘着斑 (FA) 。我们拍摄了 7 幅 FA 的 Z 堆栈图像，步长为 1 μm 。 (A) 原始荧光图像。图像从左到右按顺序列出。它们的文件名是： adj_xy04c1z02.tif、adj_xy04c1z03.tif、adj_xy04c1z04.tif、adj_xy04c1z05.tif、adj_xy04c1z06.tif、adj_xy04c1z07.tif 和 adj_xy04c1z08.tif。 (B) 减去背景的 FA 图像。它们的文件名是：adj_bs_xy04c1z02.tif、adj_bs_xy04c1z03.tif、adj_bs_xy04c1z04.tif、adj_bs_xy04c1z05.tif、adj_bs_xy04c1z06.tif、adj_bs_xy04c1z07.tif 和 adj_ bs_xy04c1z08.tif。比例尺：50 μm 。

数据分析

1.FA的免疫荧光图像： FA1_save_floref_cor_img.m、FA2_FA_background_20200313.m 和FA3_FA_identification_FAclearer_20200316chiao.m 。数据分析的整体流程如图 2 所示。我们利用HaCaT细胞系作为 FA 分析的演示。我们同样调整了细胞和 FA 对比度以获得更好的可视化效果。包括所有七个 Z堆栈图像（adj_xy04c1z02.tif、adj_xy04c1z03.tif、adj_xy04c1z04.tif、adj_xy04c1z05.tif、adj_xy04c1z06.tif、adj_xy04c1z07.tif 和 adj_xy04c1z08.tif）在我们的数据分析中。这些图像位于 zip 文件夹“Adjusted_xy04.zip”中。这七个图像如图 1A 所示。

图 2. 数据分析流程。粘着斑（FA）的整体分析过程。脚本 1 引用“FA1_save_floref_cor_img.m”，脚本 2 引用“FA2_FA_background_20200313.m”，脚本 3 引用“FA3_FA_identification_FAclearer_20200316chiao.m”。

2.荧光校准
FA 的校准荧光图像（我们演示中的 FA 的 FITC）是通过使用参考图像校正原始荧光图像来获得的。参考图像是在自发荧光塑料载玻片下打开和关闭荧光灯时拍摄的（图 3 和图 4）。由于共焦显微镜下LED激发光的照度变化，需要对荧光进行校准。出现不一致和不均匀现象，从而减少样本图像边缘的荧光。此校准步骤可确保我们分析中的荧光最接近样品的实际 FA 荧光。
要校准图像的荧光，请加载原始 FA 图像和参考图像。然后，运行第一个脚本（“ FA1_save_floref_cor_img.m”）来裁剪 FA 图像的边缘以进行分析。

图 3.自发荧光塑料载玻片的代表性图像。 (A) 载玻片存储盒中的所有载玻片。 (B)（从左到右，从上到下）：YFP、FITC、TX-Red 和 DAPI 幻灯片。透明幻灯片用于在幻灯片存储盒中创建隔间。

图 4. 用于荧光校准的参考图像。 (A) 关闭：关闭灯时拍摄的参考图像。 (B) DAPI：在 DAPI 自体荧光塑料板和 DAPI 灯打开下拍摄的参考图像。 (C) FITC：在 FITC自发荧光塑料板和 FITC 灯打开下拍摄的参考图像。有关这些图像的tif文件，请参阅 zip 文件“reference_images.zip”。文件的名称为： off.tif 、 dapi.tif和fitc.tif 。

3.FA背景扣除
FA2_FA_background_20200313.m”）减去 FA 的背景信号。进行背景扣除的目的是消除图像的背景噪声，将细胞的FA与背景进行对比，以确保更好的辨别。为了进行背景扣除，我们首先确定每个像素的背景信号。每个像素的每个信号分别由其周围1.46μm半径内像素的中值确定。然后，我们通过运行脚本将背景信号减去原始信号，完成背景扣除。图像adj_bs_xy04c1z02.tif、adj_bs_xy04c1z03.tif、adj_bs_xy04c1z04.tif、adj_bs_xy04c1z05.tif、adj_bs_xy04c1z06.tif、adj_bs_xy04c1z07.tif 和 adj_bs_运行脚本后会生成 xy04c1z08.tif。这些图像也位于 zip 文件夹“Adjusted_xy04.zip”中。 FA 图像的对比度经过同等调整，减去其背景信号。
4.阈值化：对 FA 模板进行阈值化的目的是为了能够清楚地识别Fas ，以进行量化和鉴定。阈值被确定为高于背景值众数的两个标准差。
5.分段：为了区分每个 FA 进行分析，需要进行分段。换句话说，分割过程可以防止对同一 FA 进行重复分析。具体来说，对单个 FA 进行双重分析会生成所有参数数据相同的两个独立Fas的结果。为了进行FA分割，使用MATLAB中的分水岭分割功能。
6.FA分析
FA 分析使用第三个脚本进行处理： “ FA3_FA_identification_FAclearer_20200316chiao.m”。运行脚本的步骤如下：
a.选择不同的细胞来分析新生或突出的 FA：
我。新生 FA：选择伤口第一行的 FA 进行分析。仅选择两侧有相邻单元格的单元格。这些细胞执行向伤口的定向细胞迁移。对伤口前缘这些细胞的片状伪足中形成的新生 FA 进行分析。
二.突出的 FA：选择所有具有清晰 FA 的细胞进行分析。我们分析HaCaT的突出 FA作为演示。
每次运行都会分析板状伪足边缘7 μm （15 像素）内的所有 FA 。下面列出了详细步骤。
b.圈出目标单元格，然后运行脚本：
通过在图 5A 的面板中精确定位单元格的周围环境，手动圈出目标单元格。运行脚本，加载原始荧光图像（图 5B）。该脚本将再次显示所选目标细胞的背景扣除图像（图 5C）。之后，脚本会自动识别所有 FA（图 5D）。这将是脚本稍后将分析的背景扣除图像。

图 5.利用 MATLAB 脚本选择HaCaT细胞来分析突出的粘着斑 (FA)。通过精确定位细胞周围来手动选择单个HaCaT细胞。 (A–B) 执行背景扣除后的细胞图像 (A) 和原始 FA 图像 (B)。 (A) 的蓝色十字表示选定的单元格。 (C–D) 背景扣除后所选细胞的图像再次显示在 (C) 中。然后，MATLAB 脚本自动识别 (D) 中的 FA。比例尺：50 μm 。

c.确定片状伪足边界：
我们精确定位显示朝向伤口的清晰片状伪足突出的细胞边界，以确定目标细胞的片状伪足边界。
d.确定核中心：
标记靶细胞的细胞核，以便完全确定用于 FA 分析的透明片状足。板状伪足边界和核中心的确定完成如图6A-6C所示。红色虚线显示了片状伪足边界和确定片状伪足边界的核中心。

图 6. 然后选择所选细胞的粘着斑 (FA) 进行进一步分析。 (A-C) 确定细胞核中心和片状伪足边界。背景扣除下的 FA (A)；红色虚线表示具有确定的细胞核 (B) 和片状伪足边界 (C) 的所选细胞。 (D–G) 扣除背景后的 FA 阈值和所选细胞的 FA 编号。绿色虚线表示具有确定的细胞核和片状伪足边界的所选细胞 (D)。黄色 X 表示手动选择的 FA (E) 以及选择中实际 FA 的相应红点 (F)。 FA 根据选择顺序 (G) 进行编号。比例尺：10 μm 。

e.FA选择：
在确定的片状足下，所有 FA 均手动选择进行分析（图 5D 至 5G）。分析片状伪足边缘7 μm内的 FA。分析后，生成 FA 信号强度，如图 7 的热图所示。在此过程中，脚本会校正 FA 信号以消除光漂白的影响。生成的热图如图7所示；左图展示原始 FA 信号(Ori Cell x87y101)，右图描绘校正后的 FA 信号(Cor Cell x87y101)。然后，经过光漂白校正的校正 FA 信号数据将用于最终 FA 分析。

图 7. 粘着斑 (FA) 信号强度热图。左图：OriCellx87y101 表示光漂白校正前的原始 FA 信号强度。 X87 和 y101 表示所选目标单元格的 x 轴和 y 轴。 CorCellx87y101 表示校正后的 FA 信号强度，描绘了经过光漂白校正处理的信号。 FA# 描述了图 6 中手动选择的 11 个 FA 的顺序编号。框架描述了用于分析的七个 z 堆栈图像。

f.生成不同FA参数的数据：
完成脚本运行。生成用于量化和鉴定的不同 FA 参数：(a) FA 位置、(b) FA 偏心率、(c) FA 面积、(d) 平均 FA 信号和 (e) FA 编号。集成的 FA 用于 FA 分析。综合FA的公式如下：

积分 FA = FA 面积 × 平均 FA 信号

*积分 FA 通过 (c) 乘以 (d) 生成。
*(a) FA位置：生成坐标x和y。
*(b) FA 偏心率决定了 FA 是否更接近圆形或线性形状。运行脚本后会生成0到1之间的数值。数字越大表示偏心率越大。
g.整理FA数据：
使用 Microsoft Excel 提取并组织来自多个分析站点的 FA 和细胞数据。请参阅 Excel 文件“ xy04 ”。 Excel文件是xy04孔所有单元格的所有FA数据。突出显示的部分展示了我们的演示单元 x87y101 的 FA 数据。

致谢

这项工作得到了台湾科学技术部 (MOST 107-2320-B-002-038-MY3 和 MOST 108-2926-I-002-002-MY4)、国立台湾大学医院 (NTUH 106) 的资助-T02、NTUH 107-T13、NTUH 108-T13 和 VN 109-14)，以及台湾肝脏疾病预防和治疗研究基金会。该协议改编自 Yu等人。（2021）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

Doss, BL、Pan, M.、Gupta, M.、Grenci, G.、 Mège , R.-M.、Lim, CT、Sheetz, MP、 Voituriez , R. 和 Ladoux, B. (2020)。细胞回复到基质刚性是受监管的经过积极的和被动的细胞骨架压力。过程。国家。阿卡德。科学。美国117(23)：12817–12825。
Kanchanawong , P.、 Shtengel , G.、 Pasapera , AM、 Ramko , EB、Davidson, MW、Hess, HF 和 Waterman, CM (2010)。纳米级建筑学的基于整合素的细胞粘连。自然468（7323）：580–584。
Horzum , U.、 Ozdil , B. 和Pesen-Okvur , D. (2014)。一步步定量的分析的焦点粘连。方法X 1：56-59。
Yu, LY, Tseng, TJ, Lin, HC, Hsu, CL, Lu, TX, Tsai, CJ, Lin, YC, Chu, I., Peng, CT, Chen, HJ, 等。（2021）。合成的行动不便屏幕揭幕一个融合的 STK40-YAP-MAPK 系统驾驶细胞移民。科学。副词。 7(31)：eabg2106。
Olson，HM 和Nechiporuk ，AV (2021)。片状伪足样突出物和焦点粘连贡献到集体细胞移民在斑马鱼。开发。生物。 469：125–134。

补充资料

在此处下载以下支持信息：
1.已调整_xy04 文件
2.MATLAB 文件
3.参考图像
4.xy04.xlsx