材料与试剂

材料

1.培养基：Mueller-Hinton 琼脂/肉汤 (MHA/MHB)（Thermo Fisher Scientific，目录号： CM0337 ）和Luria-Bertani 肉汤（LB）（Oxoid，目录号： CM0996B）
2.抗生素库存：甲氧苄啶（2.5 μg /mL）（Sigma-Aldrich，目录号：T7883-5G）和万古霉素（10 μg /mL（Sigma-Aldrich，目录号：1709007）
3.菌株：空肠弯曲杆菌NCTC 11168-O [24] 和铜绿假单胞菌PA0-1
培养条件：空肠弯曲菌培养物在 42 °C微需氧（85% N 2 、10% CO 2和 5% O 2 ）条件下培养36 小时，而铜绿假单胞菌在 37 °C 条件下需氧培养 24 小时
4.化学品：具有高抗生物膜特性的天然化合物，例如 D-丝氨酸 (D-Ser)（Sigma-Aldrich，目录号：S4250）
5.磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（ Sigma-Aldrich，目录号： P4417）
6.多通道移液器（例如， 100–200 μL 、300–1,000 μL ）（ Thermo Scientific，目录号： 4661180N ）
7.用于培养液体培养物的 15 mL 锥形管或玻璃试管（ Thermo Scientific，目录号： 339650）
8.24孔或96孔透明平底板（Geiner Bio-One，目录号： 655101 ）
9.比 96 孔板稍大的托盘或盒子（例如，托盘尺寸 ~200 mm × 100 mm）
10.0.1％结晶紫溶液（0.1克结晶紫溶于100毫升软化水中）（Sigma-Aldrich，目录号：548-62-9）
11.改良的生物膜溶解溶液（MBDS）[十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：436143）用80％乙醇溶解在H 2 O中，最终浓度为10％）[25]
12.纸巾
13.大烧杯
14.对于共焦激光扫描显微镜 (CLSM)：
a.6孔聚苯乙烯透明平底板（Geiner Bio-One，目录号： 655101 ）
b.玻璃盖玻片（例如， 22 mm 2 盖玻片）
c.载玻片
d.2 O中）
e.4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
f.封固剂（ Ibidi GmbH，目录号：50001）
g.指甲油
h.CLSM（尼康显微镜，型号：尼康 A1R+ ）
设备

1.读板器（ Tecan，型号： Infinite M200 Pro ) 用于测量 570–600 nm 的光密度 (OD) 范围
2.培养箱（SHEL LAB，型号：SM12 ）
3.层流柜（ESCO，型号：AHL-4A2 ）

软件

1.ImageJ 分析软件（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州）

程序

方案 1：生物膜形成抑制测定（图 1）

图 1. 用于筛选生物膜形成抑制的方案 1。 (1-2) 制备菌悬液，分装至24孔微孔板中。 (3) 将不同浓度的测试化合物 (D-Ser) 以所需的增量分配到微孔板中。 (4) 孵育微孔板以在孔内生成生物膜。 (5)孵育后，洗涤孔，干燥，然后用结晶紫溶液染色(6)。洗涤染色的生物膜以除去多余的染料，并将一定体积的MBDS溶液添加到孔中以溶解结晶紫染色的生物膜。 (7)在分光光度计上读取脱色的MBDS溶液的吸光度(OD)。

A.单物种测定

注意：研究待测化合物对生物膜形成的空肠弯曲菌的影响。
1.回收空肠弯曲菌NCTC 11168-O，将库存接种在补充有适当抗生素[甲氧苄啶（2.5微克/毫升）和万古霉素（10微克/毫升）]的MHA培养基上，并微氧孵育（85％N） 2、10 % CO 2和 5% O 2 ）在 42 °C 过夜。
2.使用玻璃或一次性塑料棒将琼脂板上的细菌细胞从琼脂板上收获到 1 mL MHB 中，将细胞从琼脂板上提起到试管中，并将约 100–200 μL 所得细菌悬浮液转移到 15 mL MHB中（补充适当的抗生素）。在摇床培养箱中于 42°C 和 125 rpm 微氧条件下孵育（18-20 小时过夜）。
3.稀释过夜培养物在新鲜的 MHB（补充有适当的抗生素）中，以在对数生长开始时达到 OD 600的细胞密度0.05 相（~10 7 CFU/mL）。
4.将 2 mL 稀释的细菌悬浮液分配到 24 孔板的每个孔中（每个样品至少三排，每孔四个孔），或者对于 96 孔板，每孔180 μL 。未接种的 MHB 用作阴性对照。
5.为了测试测试化合物（例如，D-Ser）的抑制效果，将选定浓度（即，1-50 mM）的待测试化合物直接添加到孔中的培养物中。例如，使用 1 M D-Ser（PBS 中）作为储备液，除阴性对照外，每孔添加 100 μL储备液。
6.盖上 24 孔板，并在微需氧条件下于 42°C 孵育，无需摇动（静态培养）24 小时（参见注释 1 和 2）。每个板必须在四个孔中包含仅培养基对照。
7.要量化生物膜形成，请转至方案 2 中的“生物膜形成评估”部分。

B.双/多物种测定

注意：研究待测化合物对混合培养物形成的生物膜（本例中：空肠弯曲菌和铜绿假单胞菌）的影响。
1.成长P 。铜绿假单胞菌细胞在 MHB 中于 37°C 需氧过夜，然后在对数生长开始时用新鲜 MHB 调整细胞密度至OD 600 0.1 相（10 7 CFU/mL） [26]。
2.成长C .空肠细胞，如上所述（步骤 A1-A3）。
3.使用两种/多种细菌的细胞悬浮液比例为 1:1 进行测定。
4.如上所述重复步骤 A4-A6（参见注释 1 和 2）。
5.要量化生物膜形成，请转至方案 2 中的“生物膜形成评估”部分。

方案 2：生物膜分散测定（图 2）

图 2. 用于筛选生物膜形成扩散的方案 2。 (1-2) 制备菌悬液，分装至24孔微孔板中。 (3) 孵育微孔板以在孔内生成生物膜。 (4)然后除去细菌培养物，洗涤孔以除去浮游细胞，然后将不同浓度的测试化合物(D-Ser)以期望的增量分配到微量滴定板中。 (5)孵育后，洗涤孔，使其干燥，然后用结晶紫溶液染色。 (6)洗涤染色的生物膜以除去多余的染料，并向孔中添加MBDS溶液以溶解结晶紫染色的生物膜。 (7)在分光光度计上读取脱色的MBDS溶液的吸光度(OD)。

1.重复步骤 A1–A6，步骤 5 除外。
2.从 24 孔板中取出介质，并在每孔中添加 500 μL含有适当浓度（即 10-50 mM）待测化合物的 PBS（仅 PBS 用作阴性对照）。
3.板在 42°C 微需氧条件下孵育24 小时（不摇动）（参见注释 1 和 2）。
4.取上清液并测量每个孔的OD 600 。
5.要量化生物膜的形成，请参阅“生物膜形成的评估”部分。

生物膜形成的评估

1.从板中取出介质（通过翻转托盘中的吸水纸巾）并用蒸馏水轻轻冲洗两次以去除浮游细胞。
2.轻轻拍打纸巾干燥板，直至孔中不再残留液体。
3.此外，将板在层流柜中风干 15 分钟。
4.μL 0.1% 结晶紫溶液（ 96 孔板为 125 μL ）对附着的生物膜材料进行染色，并在室温下静置 10 分钟。
5.通过移液除去结晶紫溶液，并用蒸馏水冲洗掉未结合的结晶紫，直到所有孔中都没有液晶紫（参见注释6）。
6.将板轻拍在纸巾上，并将其面朝上放在工作台上，在室温下过夜干燥或在层流柜中风干 15 分钟。
7.添加 500 μL （或96 孔板200 μL ）MBDS 以溶解结晶紫，并在室温下孵育 10 分钟。
8.通过上下移液将 MBDS 和结晶紫混合在孔中。
9.将 125–200 μL MBDS/结晶紫溶液从每个孔转移到平底 96 孔板的相应孔中。
10.在平底板的读板器中量化每个孔的OD ( 570–600 nm ) 。
11.从包含样品/浓度的每个孔的 OD 中减去空白孔的测量值（仅限 MBDS）并计算平均值。
12.将平均值标准化为生物膜抑制和分散的百分比 (%)，如 [6,27,28] 中所述：

% = (Con - Exp)/Con) × 100

其中 Con = 对照（未处理），Exp = 实验（已处理）。

CLSM显微镜（图 3）

空肠弯曲杆菌和铜绿假单胞菌双物种生物膜的共焦激光扫描显微镜 (CSLM)图像。使用双荧光标记、DAPI（蓝色）和硫磺素 T（绿色）对空肠弯曲杆菌/铜绿假单胞菌生物膜（48 小时）进行成像（比例尺 = 20 μm ）。

1.准备细胞。
2.将盖玻片放入 6 孔板的每个孔中。
3.将 2 mL 稀释的细菌悬浮液分配到 6 孔板的 2 个孔中，以便在盖玻片上形成生物膜。
4.将板在 42°C 微需氧条件下孵育至少 24 小时，最多 72 小时（请参阅注 1 和 2)。
5.从托盘上的板上取出介质，并用 PBS 轻轻冲洗两次以去除浮游细胞。
6.使用 5% 甲醛溶液在室温下将细胞固定在盖玻片上 1 小时，用 2 mL PBS 轻轻冲洗，并用标记 DNA 的荧光染料（例如 DAPI）染色 [6]。
7.DAPI 通常用于可视化生物膜中的细菌细胞分布[29]，并且通常包含在抗褪色封固剂中。
8.使用镊子取出盖玻片，小心握住盖玻片边缘以避免破坏生物膜，然后倒置到含有一滴具有 DAPI 的抗褪色封固剂（ 10 μg /mL）的载玻片上（参见注释 7）。
9.使用透明指甲油将密封盖玻片安装在载玻片上。应在显微镜下检查来自至少两个单独实验的每个样品/浓度的两个盖玻片。
10.所有图像均使用 ImageJ 处理 [30] . ImageJ用于将两个图像 [例如，DAPI 和硫磺素 T（绿色）] 组合/叠加到单个图像中，以生成代表性图像，如图 3 所示。简单地说，在 ImageJ 中打开图像并调整对比度（转到图像>调整>亮度）。要将两个/三个图像合并为单色图像，请转到“图像” >“颜色” > “合并通道” ；每个图像代表三个通道（红色、绿色和蓝色）之一，并且将出现合并通道框。然后，选择所需的通道并单击“确定”以创建合成图像；将其另存为 .tiff 文件。

笔记

1.为了在使用 24 孔板时为生物膜测定创造潮湿的环境，请在孵化过程中在板周围放置一个小容器水和一叠湿纸巾。
2.如果使用 96 孔板，请向每个外孔添加 200 μL无菌水以防止干燥。
3.所有溶液均应用超纯水制备，所有试剂应在室温下储存（除非另有说明）。
4.值得注意的是，有一些因素会影响该测定的结果，例如生物体粘附到表面的能力。例如，空肠弯曲杆菌81116 形成的生物膜比空肠弯曲杆菌更丰富。空肠杆菌11168-O。此外，空肠弯曲菌菌株显示鞭毛蛋白相位变化，并且在接种平板之前确保培养物具有运动性（例如，通过使用“湿滴”光学显微镜检查细胞运动性）非常重要，因为非运动变体不附着也不形成生物膜。简而言之，湿涂片是通过将一滴水放在显微镜载玻片上并将所选菌株的单菌落悬浮到水滴中来进行的。然后用盖玻片覆盖悬浮液并通过光学显微镜检查。
5.每个测试板应包含强阳性对照（即野生型菌株、未处理的样品）和阴性对照（例如接种的培养基）。由于干燥或过度清洗（细胞分离），孵育后可能会出现更高的变异性。
6.确保仅存的结晶紫与孔底部的生物膜结合。孔周围的水晶紫色环并不表示生物膜形成，应再次冲洗，因为过度染色会影响测定结果。
7.使用无菌针和镊子，小心地从 6 孔板中取出盖玻片，并用 5% 甲醛溶液在室温下固定 1 小时。

数据分析

预期成绩

在这里，我们介绍两种测定法（抑制测定法和分散测定法）来评估天然化合物（例如 DA）的效果。用 DA D-Ser处理空肠弯曲菌培养物，显示出对生物膜形成的显着抑制作用(p < 0.001) （图4），且呈剂量依赖性。此外，D-Ser对现有的生物膜具有显着的破坏作用 (p < 0.001)， 50 mM 时高达 71%（图4）。两种测定均可用于筛选所选化合物对生物膜的抑制和分散作用，并确定适合进一步研究的浓度。我们测试了空肠弯曲菌81–176 (81–176) 和C. jejuni 81116 (81116) [6]菌株。

图 4. D-丝氨酸 (D-Ser) 对空肠弯曲杆菌11168-O 生物膜的影响。 A) 不同浓度的 D-Ser 存在时对生物膜形成的抑制。 B )不同浓度的 D-Ser 诱导现有生物膜的分散。星号 (*) 表示使用未配对的学生t检验存在统计显着性差异，p < 0.05。每个实验至少包括三个生物重复，每个生物重复至少包括三个技术重复。

协议验证

该协议或其部分内容已在以下研究文章中使用和验证：
•埃尔加穆迪等人。（2020）。 D-氨基酸抑制空肠弯曲杆菌生物膜形成。抗生素（图 2 和 3）。数据代表三个独立实验 (n = 3)，数值表示为平均值±标准误差。本研究中生成的数据的统计显着性是使用双尾学生t检验确定的。 p ≥ 0.05 被认为具有统计显着性。

致谢

该协议源自原始研究论文并在原始研究论文中得到验证（ Elgamoudi等人，2020 [6]； Elgamoudi等人，2022 [31]）。这项工作得到了格里菲斯大学的部分支持。
作者贡献： Bassam Elgamoudi ：概念化、方法论、验证、形式分析、数据管理、写作：原稿、写作：评论和编辑。 Victoria Korolik ：概念化、写作：原稿、写作：审查和编辑。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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