材料与试剂

1.175 cm 2组织培养瓶（Sarstedt，目录号：83.3912）
2.4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）
3.5%（w/v）洋地黄皂苷（ Thermo Fisher Scientific， Invitrogen TM ，目录号：BN 20061）
4.Albumax II（Gibco，目录号： 11021-045-1kg）
5.阿托伐醌（Sigma-Aldrich，目录号：A7986-10MG）
6.Cell-Tak（康宁，目录号：354241）
7.D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
8.D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M9546-250G）
9.二甲亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-250G）
10.乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N,N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889-25G）
11.无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3803-100G）
12.通用塑料耗材【无菌Eppendorf管、无菌falcon管（15、50mL）、无菌移液器吸头（20、200、1000μL）、无菌血清移液器（10、25mL）；萨斯特或康宁]
13.庆大霉素（Invitrogen，目录号：15710-072）
14.次黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：H-9636）
15.L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960-25G）
16.L-苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：M1000-100G）
17.六水氯化镁（MgCl 2 ·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-100g）
18.Milli-Q 水（来自任何可用的净化系统的新鲜水）
19.N,N,N,N'-四甲基对苯二胺（TMPD）（Sigma-Aldrich，目录号：T7394-5G）
20.氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：7447-40-7，500G）
21.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（ ChemSupply ，目录号：PA009-500G）
22.RPMI-HEPES 与Glutamax （ Thermo Fisher Scientific TM ，目录号：72400120）
23.氮化钠（AJAX- Finechem Univar，目录号：AJA1222-100G）
24.氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5886-5KG）
25.磷酸二氢钠一水合物（ AnalaR ，目录号：102454R）
26.山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：50-70-4）
27.蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378-5KG）
28.抗坏血酸原液 (200 mM)（参见食谱）
29.Albumax II (5% w/v)（参见食谱）
30.阿托伐醌原液 (25 mM)（参见食谱）
31.完全培养基（参见食谱）
32.苹果酸原液 (500 mM)（参见食谱）
33.MAS 缓冲液（3× 库存）（参见配方）
34.MAS 缓冲液（1× 工作溶液）（参见配方）
35.磷酸盐缓冲盐水 (10×)（参见食谱）
36.皂苷（0.15% w/v）（参见食谱）
37.氮化钠库存 (100 mM)（参见食谱）
38.碳酸氢钠 (0.1 M)（参见食谱）
39.山梨醇（5% w/v）（参见食谱）
40.TMPD 库存 (500 mM)（参见配方）
生物材料

恶性疟原虫细胞（野生型 3D7）

食谱

1.抗坏血酸储备液 (200 mM)
将 352 mg L-抗坏血酸溶解在 5 mL 1 × MAS 缓冲液中。用氢氧化钾 (KOH) 将 pH 调节至 7.4，并用 1 × MAS 缓冲液将最终体积调节至 10 mL。等分抗坏血酸库存（500 μL /等分）并储存在-20°C 下以进行长期储存。

2.蛋白II (5% w/v)
将 25 g Albumax II 溶解在 500 mL 的 RPMI 介质中。使用 Millipore Stericup真空驱动一次性过滤系统进行过滤灭菌。等分Albumax II 库存（50 mL/等分）并储存在 -20 °C 下以便长期储存。

3.阿托伐醌原液 (25 mM)
将 10 mg 阿托伐醌溶解在 1.09 mL DMSO 中。等分阿托伐醌原液（50 μL /等分）并储存在-20°C 下以便长期储存。

4.完全培养基
Glutamax的 RPMI 1640-HEPES 中制备完整培养基，并补充如下所示的细胞培养基成分。将完整培养基储存在 4 °C下，并在使用前预热至 37 °C 。
成分最终浓度体积
RPMI培养基-500毫升
额外的葡萄糖 (2.5 M)10毫米2毫升
次黄嘌呤 (200 mM)480μM _ 1.2毫升
庆大霉素 (10 毫克/毫升)20微克/毫升1毫升
5%白蛋白溶液0.375%w/v37.5毫升
热灭活人血清2.5%体积比12.5毫升

5.苹果酸储备液 (500 mM)
将 670.45 mg L-苹果酸溶解在 5 mL MAS 缓冲液中。用 KOH 将 pH 调节至 7.4，并用 MAS 缓冲液将最终体积调节至 10 mL。等分苹果酸库存（1.5 mL/等分）并储存在-20°C 下以便长期储存。

6.MAS 缓冲液（3 ×库存）
称出组分（如下所列），并将溶液放入水浴中和/或使用磁力搅拌器，溶解在 50–75 mL Milli-Q 水中。使用 KOH 将溶液的 pH 值调节至 7.4。将最终体积调至 125 mL。过滤灭菌可长期保存。
成分最终浓度重量
甘露醇660毫米15.03克
蔗糖210毫米8.99克
KH 2 PO 430毫米0.51克
氯化镁215毫米0.381克
HEPES6毫米0.1785克
EGTA3毫米0.1425克

7.MAS 缓冲液（1 ×工作液）
实验当天，将 15 mL 3 × MAS 缓冲液与 30 mL Milli-Q 水混合，得到 45 mL 1 × MAS 缓冲液。添加 90 mg 不含脂肪酸的 BSA 和 2.25 mL 0.5 M 苹果酸盐。
8.磷酸盐缓冲盐水 (10 × )
成分重量
氯化钠80克
氯化钾2克
Na 2 HPO 414.4克
KH 2 PO 41.9克
将化合物溶解在 800 mL Milli-Q 水中。使用 HCl 将溶液的 pH 值调节至 7.4。将最终体积达到 1 L。在 15 psi 下高压灭菌 20 分钟，对溶液进行灭菌。室温保存。需要时，将 100 mL 10 × PBS 与 900 mL Milli-Q 水混合，得到 1 × PBS。

9.皂苷 (0.15% w/v)
将 0.15 g 皂苷溶解在 100 mL PBS 中。使用 0.2 μm过滤器对溶液进行过滤灭菌。 4 °C下保存，可长期保存。需要时，将 1 mL 0.15% 皂苷与 2 mL PBS 混合，以获得 0.05%（w/v）皂苷工作溶液。

10.氮化钠库存(100 mM)
将 65.1 mg 叠氮化钠溶解在 10 mL MAS 缓冲液中。等分叠氮化钠库存（500 μL /等分）并储存在-20°C 下以进行长期储存。

11.碳酸氢钠 (0.1 M)
将 84 mg 碳酸氢钠溶解在大约 8 mL Milli-Q 水中。将 pH 调节至 8.0，并将体积补至 10 mL。使用 0.2 μm过滤器过滤灭菌。室温保存。

12.山梨醇（5% w/v）
将 5 g 山梨醇溶解在 100 mL Milli-Q 水中。使用 0.2 μm过滤器对溶液进行过滤灭菌。 4°C 下保存，可长期保存。

13.TMPD 库存 (500 mM)
将 82.2 mg TPMD 溶解在 1 mL 乙醇中。等分 TMPD 溶液（50 μL /等分）并储存在 -20 °C 下以进行长期储存。

设备

1.4°C 冰箱和-20°C 冷冻室
2.适用于 15 和 50 mL 管的台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
3.用于微量离心管的台式离心机（ Thermo Scientific，型号：Heraeus Pico 17）
4.改进的 Neubauer血细胞计数器（Hirschmann，型号：8100104）
5.加湿 37 °C无 CO 2培养箱
6.MACS ®磁力柱（CS 柱、 Miltenyi Biotec ，目录号：130-041-305），带有无菌三向秒表
7.SuperMACS II 分离器（ Miltenyi Biotec ，目录号：130-044-104）
8.多道移液器 (30–300 µL ) (Gilson)
9.pH计（ Cyberscan pH510）
10.移液器（0.2–2、2–20、20–200 和 100–1,000 µL ）(Gilson)
11.试剂槽
12.Seahorse XFe96 分析仪（安捷伦）
13.Seahorse XFe96 FluxPak （XFe96 细胞培养微孔板、XFe96 传感器盒和实用板、XF 校准溶液）（Agilent，目录号：102416-100）
14.标准倒置光学显微镜（Olympus CKX41），配有20 ×物镜
15.生物安全柜（ Safemate 1.2 Vision，Edwards Group）
16.水浴，37 °C（WB7，Ratek）
17.自封袋

软件

1.Wave 桌面软件，版本 2.6.3（用于运行 Seahorse XFe96 测定）
2.GraphPad Prism 9（用于结果的统计分析）

程序

A.寄生虫培养

1.完整培养基中的恶性疟原虫维持在 4% 的血细胞比容和细胞培养板和烧瓶中约 3% 的寄生虫血症（Maier 和 Rug，2013）。
2.每隔一天，使用吉姆萨染色技术检查寄生虫血症；用预热至 37 °C的新鲜完整培养基替换培养物，并将寄生虫培养物稀释至 0.2%寄生虫血症。用1% O 2 、5% CO 2和 94% N 2的疟疾气体混合物给培养瓶充气持续 30 秒；盖上烧瓶盖并在 37°C 下孵育。
3.Lambros 和 Vanderberg (1979) 的规定，通过用山梨醇处理寄生虫来维持同步恶性疟原虫培养。
4.将细胞培养物扩大至约3 × 10 8 滋养体感染红细胞并继续进行 Seahorse XFe96 测定（一般说明 2）。

B.XF96细胞培养微孔板预处理（至少在实验前1天）

图 2 描绘了协议中使用的 Seahorse XFe96 传感器盒的各个部分。 XFe96 分析仪仅使用 96 孔板。 24 孔板格式可与 Seahorse XFe24 分析仪配合使用，之前发布的协议描述了使用此方法 (Sakata-Kato)分析恶性疟原虫中的 O 2消耗率和沃斯，2016）。

图 2.Seahorse XFe96 传感器盒的部件。 A) 侧视图显示连接到绿色传感器盒的传感器探头的底部。 B) 俯视图显示了 96 个孔上方的四个注入口的示例。插图显示端口 A–D 和传感器探头的顶部。使用BioRender.com创建。

1.为了在实验期间将恶性疟原虫细胞固定在 Agilent Seahorse XFe96 板上，请在实验前 1-5 天根据制造商的方案用 Cell-Tak 包被每个孔。简而言之，在 0.1 M 碳酸氢钠中制备 Cell-Tak，终浓度为 22.12 μg /mL（一般说明 3）； 2.5 mL 足以包被一块 96 孔板。使用前稀释 Cell-Tak，充分混合并立即分配。
2.XFe96 细胞培养微孔板的每个孔中分配 25 μL Cell-Tak ； 25 µL通常足以覆盖整个孔底部，但必须小心地将 Cell-Tak 铺展到整个孔中。
3.将板在室温下孵育 20 分钟。吸出溶液。翻转并轻拍板以除去任何残留的 Cell-Tak 溶液。
4.μL Milli-Q 水清洗每个孔两次，以减少任何痕量碳酸氢钠。
5.倒掉水并在无菌条件下风干孔。可将板留在细胞培养罩中进行干燥。
6.将 XFe96 细胞培养微孔板放入拉链袋中，在冰箱（4°C）中保存最多一周。
7.实验当天，在接种细胞之前，将板在生物安全柜中加热至室温。

C.给传感器盒加水（实验前 1 天）

1.传感器盒由固态传感器材料组成，可检测实验过程中pH和O 2浓度的变化。按照如下所示的安捷伦用户指南，通过水合传感器盒来准备传感器。打开 XFe96 FluxPak （墨盒 + 实用板包装）并将墨盒倒置（传感器端朝上）靠近实用板。请勿触摸传感器。用 200 μL Milli-Q 水填充实用板的所有孔。
2.将墨盒放回公用板上，并确保传感器完全浸没。将传感器盒和实用板在 37°C 加湿培养箱中孵育过夜。
3.在检测当天，取出试剂盒并将其倒置（传感器端朝上）。倒掉公用板中的水，并用预热至 37 °C 的200 μL XF Calibrant 填充所有孔。
4.将墨盒放回公用板中，然后上下移动墨盒两次，以清除传感器中残留的气泡。
5.在实验开始之前，将实用板与传感器盒和校准溶液在 37 °C加湿培养箱中孵育至少 1 小时。

D.波形程序模板准备

1.设置 Wave 桌面软件。
2.在组定义选项卡下，定义注入策略（图 3A）。一个例子如下所示。
a.A 端口，抑制剂/阿托伐醌 (5 μM )。
b.B 端口、TMPD (0.2 mM) 和抗坏血酸 (2 mM)。
c.端口 C，叠氮化钠(NaN 3 ；10 mM)。
3.通过将各个组分配到不同的实验条件来配置板图（图 3B）。确保包括背景孔（无细胞测量）。 A–D 代表不同的候选恶性疟原虫ETC 抑制剂。阿托伐醌用作阳性对照。对照孔有未经药物处理的寄生虫（即溶剂控制从端口 A 注入）。背景孔没有寄生虫。每个条件都包含四个技术重复。
4.在协议选项卡下，单击注射并指定每次注射的混合和测量周期的时间和重复次数（图 3C）。例如，注射抑制剂后进行八个测量周期（否则进行五个测量周期）。每个测量周期有：
a.搅拌20秒，
b.等待1分钟，
c.测量 2.5 分钟。

图 3. 在 Wave 软件中设计 Seahorse XFe96 实验模板。 A) 在“组定义”选项卡下，填写注入策略，如下所示。 A 口：抑制剂/阿托伐醌； B口：TMPD； C口：叠氮化钠。 B) 在“板图”选项卡下，根据您的组定义自定义板图。确保包括背景孔（没有细胞的孔）。 C) 在“协议”选项卡下，指定从特定端口注入的时间和底物。指定混合和测量周期的数量如下。抑制剂注射8个循环后（所有其他底物注射5个循环）；搅拌20秒；等待1分钟； 2.5 分钟测量。

5.保存此模板。实验当天，打开模板并单击“运行检测”选项卡开始检测。

E.抑制剂/底物制备

1.准备 45 mL 的 1 × MAS 缓冲液（参见配方）。在水浴 (37 °C )中预热 1 × MAS 缓冲液、PBS 和皂苷直至使用。
2.在准备寄生虫之前，准备好将注入传感器盒端口的底物/抑制剂/对照（一般说明 4）。对于模型实验，我们使用：
a.8 ×阿托伐醌/抑制剂溶液。在测定过程中注射到孔中后，制备40 μM溶液以获得 5 μM的终浓度。要配制 40 μM库存，请将 1.4 μL 10 mM 抑制剂添加到 348.6 μL MAS 缓冲液中，或将 1.1 μL 25 mM 阿托伐醌添加到 698.9 μL MAS 缓冲液中。
b.9 × TMPD/抗坏血酸溶液。制备含有 1.8 mM TMPD 和 18 mM 抗坏血酸的溶液，以获得注射 0.2 mM TMPD/2 mM 抗坏血酸后的最终浓度。将6.5 μL 500 mM TMPD 和 162 μL 200 mM 抗坏血酸添加到 1,631.5 μL MAS 缓冲液中。
c.10 ×叠氮化钠溶液。制备 100 mM NaN 3溶液以获得注射 10 mM NaN 3后的最终浓度。将 300 μL 1 M NaN 3添加到 2,700 μL MAS 缓冲液中（一般说明 5）。

F.寄生虫准备

1.将 MACS ®磁柱与三通旋塞阀组装在生物安全柜内。通过加入 30 mL 100% 乙醇、30 mL 80% 乙醇、30 mL PBS（预热至 37 °C）和 30 mL带有Glutamax 的 RPMI-HEPES （预热至 37 °C）来预洗柱。 °C（一般注释 6）。
2.3 × 10 8丰富滋养体阶段寄生虫的培养物滋养体感染的红细胞逐滴通过置于SuperMACS II 分离器磁场中的 MACS ®磁力柱（ Ridgway等人，2021）。在通过柱之前，调节培养物的体积以产生约 15% 的血细胞比容。未感染和环期感染的红细胞将通过柱，而感染成熟期寄生虫（滋养体和裂殖体）的红细胞将被保留。
3.将 30–50 mL 预热至37 °C 的完全培养基通过柱，去除柱中保留的任何残留的未感染红细胞或环期寄生虫。
4.从磁铁上取下柱子，并在 20-30 mL 完全培养基中洗脱感染成熟期寄生虫的红细胞。
5.使用血细胞计数器确定寄生虫感染的红细胞产量。使用吉姆萨染色的血涂片检查洗脱液中寄生虫的纯度。
6.通过在 PBS 中用 1 mL 预热的 0.05%（w/v）皂苷在 37°C 处理感染的红细胞 3 分钟，从红细胞中释放 2 × 10 8 –3 × 10 8滋养体阶段寄生虫。用预热的 PBS 洗涤细胞 3 次或直至上清液不再呈红色（即直至血红蛋白完全去除），通过 2,000 ×离心沉淀寄生虫。每次洗涤后，在室温下g 2 分钟。
7.寄生虫产量应约为 2 × 10 8 –3 × 10 8 个电池。在含有 0.002%（w/v）洋地黄皂苷的线粒体测定溶液（MAS）缓冲液中将寄生虫浓度调整为 5 × 10 7寄生虫/mL。洋地黄皂苷可透化寄生虫质膜。添加前将洋地黄皂苷溶液预热至 62 °C （以溶解）。寄生虫在洗涤剂处理后开始失去活力，建议在洗涤剂处理后一小时内开始O 2消耗率(OCR) 测量。
8.孔接种 100 μL透化寄生虫。这导致每孔的密度为 5 × 10 6 个细胞。 800× g离心10 分钟室温，离心机制动设置为低。此步骤确保寄生虫粘附在孔底部。在显微镜下检查培养板，确保形成单层细胞（见图 4）。

图 4.细胞内恶性疟原虫的轮廓单层。 XFe96 细胞培养板中的Cell-Tak 包被的恶性疟原虫细胞单层（低速离心板后）。

9.小心地将 75 μL MAS 缓冲液以一定角度添加到孔的侧面，不要搅动和分离粘附的寄生虫。再次在显微镜下检查板，以确认单层细胞没有受到干扰。
10.将板转移至大气 CO 2下的培养箱 (37 °C ) ，以将板中多余的 CO 2水平脱气，并储存直至使用。此步骤对于有效脱除任何 CO 2塑料材料中的气体至关重要（ Thangaraj等人，2018）。脱气将测定板中的CO 2调节至（低）大气CO 2水平，确保测定溶液的pH值不受测定过程中CO 2水平变化的影响。

G.OCR 测量

1.实验前至少一小时，打开XFe96通量分析仪和温度控制器来校准仪器。
2.在 Wave 软件中打开准备好的实验模板并将其导出为设计文件 (.asyt )以运行测定。
3.将卡盒放入实用板后，小心地将 25 μL每种抑制剂/底物装入注射口。对于我们在本手稿中描述的测定：端口 A —化合物（8 ×最终浓度），端口 B — TMPD（9 ×最终浓度），端口 C — NaN 3 （10 ×最终浓度）端口 D —空这个实验。要将溶液装入端口，请将移液器吸头插入端口底部附近。轻轻提起移液器吸头，并使吸头与壁成一定角度。缓慢地将抑制剂/底物分配到端口中（一般说明 7）。
4.确保所有端口均已填充，包括空白孔的端口和不含细胞的未使用孔的端口。在样品实验中，必须填充所有孔的测定端口 A、B 和 C，以便能够分配化合物/底物。未使用的端口 D 可以保持为空。
5.单击Wave 软件中的运行测定，并在出现提示时将带有实用板的卡盒（装有要注射的底物/抑制剂）加载到板支架上。确保从实用板上取下盖子，并将实用板以正确的方向放置在板架上。
6.传感器校准大约需要 25-30 分钟。
7.校准完成后，实用板会自动弹出。传感器盒保留在 XFe96 分析仪内部。将实用板替换为含有粘附寄生虫的细胞板（同样没有盖子）并恢复运行。
8.实验完成后，细胞培养板被弹出。拆下板和传感器盒并检查注射口以验证是否注射了所有化合物（一般注释 8）。
9.结果文件 (.asyr )自动保存在计算机上。将结果文件保存到 USB 驱动器上，以便使用分析软件传输到另一台计算机。
10.安全、适当地丢弃含有寄生虫和底物的盒的细胞培养板（一般说明 9）。

数据分析

1.使用 Wave 软件 2.6.3 或其他版本打开结果文件。
2.单击添加视图并选择概览以查看结果和板图。
3.确保背景校正框已勾选。背景孔缺乏寄生虫，一旦勾选背景校正框，这些背景孔的 OCR 值将从实验孔中减去。
4.有时，来自一个或多个端口的基质可能无法正确分配（例如，未能注射或过早注射）。这将导致数据出现错误。除了在实验后检查注射端口（一般说明 8）外，还应分析板图上每组的数据，并查找可能发生从某些端口过早注射底物的情况。如果您有充分的理由相信井中发生了不当注入，则可以考虑通过取消选择该井来从分析中排除该井的数据（一般注释 10 ）。
5.结果表明随着时间的推移，不同底物或抑制剂对恶性疟原虫OCR 的影响（图 5A）。结果可以绘制在图表上，即时间（分钟）与 OCR ( pmol /min)（图 5B），通常为板中每个时间点的技术重复的平均 OCR 值。根据这些数据，可以计算由候选抑制剂引起的OCR抑制程度、TMPD依赖性OCR恢复程度以及NaN 3依赖性OCR抑制程度。为了确保数据的可信度，应在不同的日子进行独立的生物学重复。

图 5. 基于所执行的注入策略的模型数据。 A) 示意图描绘了抑制剂和底物对线粒体电子传递链的影响。 B)最初，苹果酸依赖性 O 2 测量消耗率 (OCR) 以确定基础 OCR。然后将感兴趣的化合物（假定的抑制剂或阿托伐醌（阳性对照））注入孔中以测量它们对 OCR 的影响。如果抑制剂影响线粒体电子传递链 ( ETC)， OCR 将会减弱。经过多次测量后，将 TMPD 注入井中。 TMPD 向细胞色素c提供电子，从而绕过复合体 III。如果 TMPD 注射恢复了 OCR，则意味着测试化合物正在抑制细胞色素c上游的 OCR 。经过几次测量后，将复合物 IV 抑制剂叠氮化钠(NaN 3 ) 注入孔中。如果 NaN 3注射抑制 OCR，则证实 TMPD 依赖性 OCR 恢复依赖于复合物 IV 活性。使用BioRender.com创建。

6.单击导出将结果导出到 GraphPad Prism 或 Microsoft Excel 等统计分析软件以进一步处理数据。

Seahorse XFe96 检测的进一步用途

在本手稿描述的实验中，我们测试了候选 ETC 抑制剂抑制恶性疟原虫线粒体 OCR 的能力，以及这些抑制剂是否靶向ETC 中细胞色素c的上游或下游。 Seahorse XFe96 检测是一种多功能检测，可用于一系列其他实验。例如，在一定范围的化合物浓度下测试线粒体 OCR 抑制的程度能够确定这些抑制剂对 ETC 的效力[例如，能够计算化合物对 OCR 的半最大有效浓度 (EC 50 ) (Hayward et al., 2023)]，以及耐药寄生虫的这种变化程度。 Seahorse XFe96 测定还可用于筛选大型文库中推定的 ETC 抑制剂，就像我们之前在相关寄生虫弓形虫中进行的类似测定一样（ Hayward等人， 2023）。 96 孔板上有四个注射口，可以使用单个 Seahorse XFe96 检测来筛选数百种化合物。我们在此描述的 Seahorse XFe96 测定法除了化合物筛选策略之外还有其他用途。例如，它可用于测量在线粒体生物学方面有缺陷的突变寄生虫菌株的 ETC 损伤，或深入了解与赋予 ETC 抑制剂抗性的突变相关的健康成本。

协议验证

1.Jenni、A. Hayward、F. Victor Makota、Daniela Cihalova 、Rachel A. Leonard、Esther Rajendran、Soraya M. Zwahlen、Laura Shuttleworth、Ursula Wiedemann、Christina Spry、Kevin J. Saliba、Alexander G. Maier、Giel G. van Dooren：药物样分子筛选鉴定了顶端复门寄生虫中化学多样性不同的电子传递链抑制剂， PLOS Pathogens 19(7)： e10111517。
图 6. 大多数候选 ETC 抑制剂以恶性疟原虫寄生虫中细胞色素c上游的 ETC 为目标。
表3.MMV Pathogen Box化合物对弓形虫和恶性疟原虫中O 2消耗率的抑制活性。
2.威廉·阮, 玛德琳·G·丹斯、伊恩·柯里、乔恩·凯尔·阿沃尔特、布罗迪·L·贝利、克里斯·拉姆、安娜·吴、保拉·法乌扎、赛夏姆·拉梅什、乔斯林·潘宁顿、凯特·E·贾曼、亚历山大·G·迈尔、吉尔·G·范·杜伦、托尼·帕彭弗斯、塞尔吉奥·维特林、杰克·鲍姆、德尔芬·鲍德、斯蒂芬·布兰德、保罗·F·杰克逊、 Alan F. Cowman 和 Brad E. Sleebs ：具有有效抗疟活性的 7- N-取代-3-恶二唑喹诺酮类药物以细胞色素bc 1复合物为目标； ACS 传染病。 doi ： https : //doi.org/10.1021/acsinfecdis .2c00607
图 5.恶性疟原虫耗氧率 (OCR) 测定。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.目前测量恶性疟原虫线粒体 O 2消耗率的方案与我们在刚地弓形虫中建立的方案有显着差异。恶性疟原虫的制备和透化需要许多步骤，详细信息请参见恶性疟原虫寄生虫部分对碳源的耗尽特别敏感，这意味着与弓形虫不同，我们需要始终将疟原虫维持在碳源中。与之前使用 Seahorse XFe24 分析仪方法测量恶性疟原虫O 2消耗的研究相比（Sakata-Kato 和 Wirth，2016），我们发现低浓度洋地黄皂苷对寄生虫质膜的透化对于实现恶性疟原虫的 O 2 消耗至关重要。寄生虫线粒体 O 2消耗率的稳健测量。
2.确保寄生虫是同步的，并且大多数在实验当天处于晚期滋养体阶段。
3.Cell-Tak 浓度因批次而异，最终稀释度可能需要根据批次进行调整。对于模型实验，我们使用Cell-Tak Lot # 0055009 (1.58 mg/mL )，并将 35 μL Cell-Tak 稀释在 2.5 mL 0.1 M 碳酸氢钠溶液中（最终浓度 22.1 μg /mL）。
4.从最初的寄生虫准备到从端口注射化合物的时间很长。为了最好地维持寄生虫活力，请在开始寄生虫准备（F 部分）之前准备底物和抑制剂化合物（E 部分）。
5.根据制造商说明书中描述的恒定浓度方案，首先注射端口 A 的底物，然后注射端口 B、C 和 D 中的底物。注射后，孔中添加的 MAS 缓冲液体积会稀释底物。为了解决稀释问题，注射的底物浓度随着每次注射成比例增加。例如，从端口 A 注入的化合物的所需最终浓度为 8 倍，端口 B 的浓度为 9 倍，端口 C 的浓度为 10 倍，端口D 的浓度为11倍。
6.如果重复使用磁力柱，则需要用 25 mL 100% 和 80% 乙醇对柱进行消毒。如果使用新柱，则不需要乙醇洗涤。
7.确保将正确的底物或抑制剂分配到适当的端口，因为如果将错误的化合物分配到端口，则很难完全去除样品。如果不同化合物的痕迹混合，也会使数据不可靠。如果将错误的化合物分配到端口中，请将这些孔从分析中完全排除。
8.验证在测定过程中所有端口是否已注入的一种方法是在实验前后拍摄卡盒的照片，然后检查在测定过程中所有端口是否已放电。
9.Seahorse 检测板含有的试剂包括 TMPD、叠氮化钠和一些可能对人类和/或环境有毒的候选抑制剂，并且还含有潜在传染性的恶性疟原虫寄生虫。因此，实验结束后，应根据当地有害物质处置政策丢弃寄生虫和基质。
10.不正确的注射并不常见。为了尽量减少不当注射，在将底物分配到端口中时，应注意不要用移液器尖端损坏端口。此外，将基板分配到端口后应轻轻处理板。最后，每个实验条件包括四次技术重复可以有助于确保在发生不当化合物注入以及特定井被排除在分析之外的情况下对数据有足够的信心。

致谢

我们感谢澳大利亚红十字会提供人类红细胞和血清。这项工作得到了生物研究学院 (RSB) 国际博士的支持。 SR 奖学金、澳大利亚国家健康和医学研究委员会向GvD和 AGM提供的创意赠款 (GNT1182369) ，以及向GvD 、AGM、ER 和 DC 提供的生物研究学院创新赠款
使用BioRender.com创建的图形概述。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

道德考虑

人类红细胞的使用已获澳大利亚国立大学人类伦理委员会协议 HEC 2017/351 的一部分批准。

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