材料与试剂

1.预先定点 AnchorChip适配器（ Bruker Daltonics ，目录号： 221598）、四个定制1.2 mm × 105 mm × 75 mm目标板和铜导电胶带（3M，目录号：05012A-AB）（注 1）
2.MTP 目标框架（ Bruker Daltonics ，目录号： 8074115）和 MTP 384 目标板抛光钢（ Bruker Daltonics ，目录号： 8280781）
3.真空干燥器（SP Bel-Art，目录号： F42020-0000)
4.5′ 的 1/2英寸管（McMaster-Carr，目录号： 5648K33)
5.N-苯基-2-萘胺（PNA）（Sigma-Aldrich，目录号： 178055）
6.7.25英寸 × 5英寸 × 1.875 ″ HDX 亲水海绵（QEP，目录号： 70005-24)
7.6英寸 × 6英寸 × 3/8英寸金属板（McMaster-Carr，目录号： 8983K212)
8.6英寸 × 6英寸 × 0.12英寸金属板（McMaster-Carr，目录号： 8983K118）
9.A4纸
10.标准实验室胶带
11.打火机
12.按大头针
13.管道胶带
14.记号笔
15.电源板
16.异丙醇
17.甲醇
18.甘油
19.精致任务湿巾（Kimberly-Clark Professional，目录号： 34155）
20.10%漂白剂
21.150毫米× 15毫米细菌培养皿（康宁，目录号： 351058）
22.注射器过滤器，0.2 μm尼龙（ Thermo Scientific，目录号： 726-2520）
23.90 mm 过滤器单元，500 mL（ Thermo Scientific，目录号： 569-0020）
24.无菌 10 mL 注射器，一次性使用（BD，目录号： 302995）
25.无菌 1.5、15 和 50 mL 试管及相应的试管架
26.无菌 2、20 和 1,000 µL移液器吸头以及相应的可调容量移液器
27.无菌 5 和 50 mL 血清移液器和移液管
28.羧苄青霉素（Gold Biotechnology，目录号： C-103-5)
29.高压灭菌的 90 mm 膜过滤器，0.22 μm （Millipore，目录号： GVWP09050)
30.14 mL 细胞培养管（Greiner Bio-One，目录号： 187262)
31.无菌 250 和 1,000 mL 可高压灭菌烧瓶（Pyrex，目录号： 4980)
32.L 形细胞撒布器（VWR，目录号： 76207-748)
33.接种转盘
34.冰桶
35.4英寸× 125 英寸 Parafilm-M 薄膜（Bemis Company Inc，目录号： PM996)
36.加仑存储双拉链袋，26.8 厘米× 27.3 厘米（沃尔玛）
37.用于运输 MALDI 目标适配器的塑料盒
38.铝箔
39.镊
40.分光光度计比色皿
41.10 nm 金胶体溶液（BBI Solutions，目录号： EM.GC10/4)
42.LB粉末（Fisher Scientific，目录号：BP9722-2）
43.琼脂（BD，目录号：214030）
44.异丙基β -D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：IPTG-RO）
45.葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D1610）
46.高压灭菌胶带
47.钟
48.纸巾
49.小量制备试剂盒（QIAGEN，目录号： 27104)
50.化学废瓶
51.翻边袖实验室外套
52.一次性实验室检查手套
53.生物危害垃圾桶
54.电感受态细胞（即RL08ara株）
55.突变文库质粒（即 pTrc99a-*BTE）
56.野生型对照质粒（即pTrc99a-WT BTE）
57.乙腈（ Thermo Fisher Scientific，目录号：51101）（注2）
58.丙酮（Fisher Scientific，目录号：A929-1）
59.LB 琼脂平板（参见配方）（注 3）
60.液体 LB 培养基（参见配方）
61.PNA 溶液（每 20 mL）（参见配方）（注 2）
62.（可选）搭建MALDI矩阵喷涂站的材料
a.数控机床（惠州巴勤电子科技，目录号： T-A4)
b.与 CNC 机床兼容的 Windows PC
c.化学安全罩，带有氮气、空气、真空和电力工作端口。氮气端口的塑料倒刺连接器必须可通过拧松来拆卸，露出管道的母开口
d.注射泵（KDS Scientific ，目录号： KDS-100-CE)
e.带夹子的实验室支架
f.两个可调扳手
g.卡尺
h.25 英尺 1/4英寸尼龙管（McMaster-Carr ，目录号： 5548K75)
i.两个带鲁尔锥度的 50 mL 注射器（BD ，目录号： 309653）
j.1/4英寸 × 1/16英寸不锈钢异径接头（Swagelok ，目录号： SS-400-6-1)
k.1/16英寸外径× .020英寸内径不锈钢管，5 厘米（IDEX ，目录号： U-101)
l.1/16英寸外径× 0.030英寸内径不锈钢管，5 厘米（IDEX ，目录号： U-115)
m.1/16 ”联合三通（世伟洛克，目录号： SS-100-3)
n.两个 1/16英寸外径× 0.0155英寸内径× 1.6英寸 NanoTight TM管套（IDEX ，目录号： F-242)
o.350 μm OD × 250 μm ID 熔融石英毛细管（ Polymicro ，目录号： 1068150026)
p.10-32 母对母鲁尔适配器（IDEX ，目录号： P-659)
q.1/16英寸外径一体式手紧接头，10-32 锥形（IDEX ，目录号： F-120Y)
r.大猩猩胶（大猩猩胶公司）
63.（可选） HTS MALDI 适配器 1.0 mm（Bruker Daltonics ，目录号： 1847571）
64.（可选） HTS MALDI 板（Bruker Daltonics ，目录号： 1833280）
65.（可选） MTP 目标框架（Bruker Daltonics ，目录号： 8074115）
66.（可选） MTP 384 靶板抛光钢（Bruker Daltonics ，目录号： 8280781）
67.（可选） 1/4英寸管外径× 3/8英寸内径-18 NPTF 公头连接器（Parker ，目录号： 68C-4-6)
68.（可选）1 mL 玻璃注射器（Hamilton，目录号：气密#1001)

食谱

1.LB琼脂平板
制作 500 mL 2×浓缩 LB 介质（每 500 mL 介质 20 g LB 粉末）。
对溶液进行过滤灭菌。
将 250 mL 去离子水添加到 1 L 烧瓶中。
将 7.5 克琼脂加入烧瓶中。
将烧瓶在 15 psi 和 121 ℃ 下高压灭菌 20 分钟。
完成高压灭菌后，立即将烧瓶转移到生物安全罩中。
在室温下将 250 mL 2× LB 介质添加到烧瓶中，同时旋转烧瓶。
添加羧苄青霉素（100 µg/mL)、IPTG (0.1 mM) 和葡萄糖 (1% w/v)。
通过旋转烧瓶彻底混合介质。
将 40 mL 的介质倒入每个 150 mm 培养皿中。
将培养皿完全打开并在生物安全罩中干燥 30 分钟。
将盘子放入塑料袋中并储存在 4 °C 下。存放时，餐具应面朝下。

2.液体 LB 培养基 (500 mL)
将 10 g LB 粉末溶解到去离子水 (500 mL) 中后，使用真空过滤装置对溶液进行过滤灭菌。

3.PNA溶液（每 20 mL）
试剂数量
PNA100毫克
乙腈（注2）20毫升

设备

1.具有互联网连接和 Firefox 或 Chrome 网络浏览器的 PC
2.平板扫描仪（EPSON ，目录号：完美V300照片）
3.生物安全罩
4.化学安全罩
5.-20℃冷冻室
6.-70℃冷冻室
7.4℃冰箱
8.高压灭菌器
9.细胞培养箱（Fisher Scientific ，目录号： 1600D）
10.电穿孔器（Bio-Rad ，目录号：基因脉冲发生器（Xcell ）
11.冷冻离心机（Eppendorf ，目录号： 5810R)
12.紫外-可见分光光度计（ Thermo Scientific ，目录号：创尼斯 10S)
13.细胞培养摇床（新不伦瑞克省，目录号： I 24) 带 250 mL 烧瓶夹
14.MALDI- ToF -MS（Bruker Daltonics ，目录号：超柔（超柔）
15.超声波浴超声波仪（Cole Parmer ，目录号： 8891R）
16.用于超声波浴槽的实心插入托盘（Branson ，目录号： 100410174）
17.Milli-Q 供水（ELGA LabWater ，目录号： PURELAB 柔性）
18.冰供应
19.电子秤（Mettler Toledo ，目录号： PB4002-S)
20.（可选）带氮气流的丙烯酸氮气吹扫柜（ Cleatech ，目录号： 1500-1-A )
21.（可选）红外温度计（FLUKE ，目录号： 62MAX+）（注4）

软件

1.flexControl 3.4（Build 135.12、Compass for flexSeries 1.4、Bruker Daltonics ）
2.巴钦绘图（惠州巴钦电子科技， http://www.bachinmaker.com ）
3.Inkscape 1.0（ Inkscape， https://inkscape.org ）
4.MacroMS （实验室软件， https://macroms.scs.illinois.edu/ ）
5.flexAnalysis 3（布鲁克道尔顿）
6.扫描仪控制软件

程序

A.样品制备（注3）

1.殖民地文化
a.用 > 50 ng 的质粒突变体文库转化电感受态细胞（注 5）。
b.使用 1 mL LB 介质重新悬浮细菌细胞，并将细胞转移到装有 2 mL LB 的细胞培养管中。在 37°C 的摇床培养箱中培养细胞 1 小时。
c.将抗生素添加到 3 mL LB 溶液（100 μg /mL羧苄青霉素）中，并在摇床培养箱中于 37°C 下生长过夜。
d.μL LB 的微量离心管，并通过将 10 μL样品连续转移到下一个管中 3 次，对过夜培养物进行 3 次 100 倍稀释。在每个稀释步骤中彻底混合管。对于第四个管，从第二个管（10,000 倍稀释）转移 10 μL ，从而得到两个管，其中含有 1,000,000 倍稀释的样品。
e.使用接种转盘和涂抹棒，将 500 μL稀释的培养液涂抹到生物安全罩中预热的 150 mm 板上。液体应铺展在像 90 毫米滤纸一样的区域上。
f.之后，立即使用 L 型涂抹棒短腿的尖端，在缓慢滚动转盘的同时均匀涂抹液体层。在液体变干之前不要涂抹。
g.干燥罩中的液体层。以同样的方式再撒上三个盘子。
h.用石蜡膜-M 密封板（注 6).
i.在底部培养皿的顶角标记样品名称，包括板号。标签的上下方向决定了整个样品制备工作流程中的样品方向（图 1）。

图 1. 在整个样品制备工作流程中保持样品载玻片恒定的上下方向。目标板的上下方向应等于 (A) 转移菌落时的培养皿、(B) 成像时的平板扫描仪玻璃、(C) 目标板图像和 (D) 的上下方向安装目标板时的 MALDI 目标适配器。

j.孵育培养皿，无需水浴。请勿将培养皿堆叠在培养箱中并将培养皿面朝下放置。
k.在约 12–18 小时内，当菌落达到约 1–2 毫米时收集平板。
2.印记菌落
a.细胞培养步骤完成后，立即用一层封口膜密封板，并将板放入密封的塑料袋中。为了防止菌落干燥，印记步骤之前的所有后续步骤应在 2 小时内完成。
b.在 MALDI 目标板的左右边缘贴上两层胶带，同时避免覆盖角边缘的基准标记。如果使用 HTS MALDI 板，则不需要此步骤、步骤 B1b 和步骤 D6z。将样品名称写在磁带上。
c.在 MALDI 目标板的背面和正面的胶带上标记样品名称。标签的上下方向应用于防止将载玻片倒置在扫描仪中和 MALDI 目标适配器上（图 1）。
d.获取与培养皿数量相同的 A4 纸，并将单张纸紧紧地对折。
e.用手去除保护钢板（0.012英寸厚）正面和 MALDI 目标板背面的颗粒物。
f.将MALDI靶材放置在保护钢板上，镜面抛光面朝上。检查目标板标签字母的旋转方向（图 1）。
g.将培养皿放在 MALDI 目标旁边，菌落朝上（图 2）。调整培养皿方向，使标签位于顶部。应快速完成步骤 A2m 结束之前的后续步骤，以尽量减少菌落干燥。

图 2. 菌落转移设置。带有菌落的培养皿（左）和位于保护钢板上的 MALDI 板（右）。用于菌落转移的滤纸（顶部）放置在板旁边。

h.打开培养皿的盖子。
i.立即将无菌滤纸放在菌落上，并盖上培养皿的盖子。等待至少 30 秒，使菌落完全附着在纸上。
j.使用镊子抓住滤纸的底部，以大约 10 cm/s 的速度轻轻地将滤纸从琼脂板上拉下，同时避免滤纸在琼脂表面上横向移动。立即将滤纸的顶部、中部和底部放置到 MALDI 目标上，使菌落直接接触目标板。重要的是不要改变滤纸的旋转方向，这意味着当滤纸放置在 MALDI 目标上时，镊子仍应抓住滤纸的底部。
k.快速将钢制保护器（带有 MALDI 目标板和滤纸）移动到地板的底面上。
l.快速将一张未使用的折叠A4纸放在滤纸上，将海绵放在纸上，并将3/8英寸厚的钢板放在海绵上（图3）。放置滤纸、海绵和板时，避免滤纸横向移动。这些物品的中心在放置时应大致对齐。

图 3.菌落印记工具。压印工具从上到下由3/8英寸钢板、扁平海绵、折叠A4纸、带有菌落的滤纸、MALDI靶板和保护钢板组成。

m.用全身重量（> 50 kg）踏上 3/8英寸钢板。将脚的中心大致放在板的中心附近，并用脚的上侧和下侧按压；避免仅按压板周边的一个区域。用手推起桌子或引擎盖的边缘（> 1 秒）来增加额外的重量。
n.依次取出钢板、海绵、纸。
o.将 MALDI 目标板放在桌子上，等待 30 秒干燥。
p.使用镊子从 MALDI 目标板上取下滤纸（图 4）。将用过的滤纸和A4纸放入生物危害垃圾桶。

大肠杆菌菌落的 MALDI 目标板示例

q.将目标板储存在步骤 D5 的真空干燥器中 5 分钟，并使用空气管通过温和的气流去除弱附着的菌落（注 7）。
r.如果去除菌落后琼脂培养皿上没有留下可见的生物量，则将培养皿放入细胞培养箱中孵育，直至再次出现可见的生物量。如果细胞没有再生，请尝试减少初始细胞培养时间（步骤 A1k）。
s.用石蜡膜-M 密封琼脂板，并将其储存在 4 °C 冰箱中。
3.使用平板扫描仪成像
a.打开扫描仪的盖子并将盖子抬起。
b.使用乙醇擦拭物清洁扫描仪玻璃，去除灰尘和颗粒物。
c.将目标样本载玻片放在扫描仪玻璃上，样本面朝下。
d.检查目标板背面字母的旋转方向，以避免将板旋转颠倒（图 1）。
e.调整目标板的方向，使目标板的顶部和底部边缘垂直于扫描仪玻璃框架的侧边缘。
f.如果目标板是 ITO 载玻片，请关闭室内灯。如果目标板是不透明的金属板，请关闭盖子。
g.打开扫描仪的控制软件。
h.将分辨率设置为 800 dpi。
i.设置扫描区域，以便包含目标板，同时最小化偏离目标区域。最多可以同时对四个目标板进行成像。
j.获取扫描区域的宽度和高度（以像素数为单位）。通过将这些值相乘来计算总像素数，并检查总像素是否小于MacroMS软件允许的最大像素数，即 30,000,000。换句话说， macroMS不接受800 dpi 时大于 ~300 cm 2的图像。
k.检查所有基准点是否在图像中可见（图 5）。

图 5.基准标记示例。黄色箭头突出显示的点是在构建定制 MALDI 目标板期间创建的激光蚀刻标记。该点应该在 MALDI-MS 仪器的图像和视频输入中可见。该蚀刻标记约为 200 μm 。

l.或者，可以调整图像阈值以增加菌落和背景之间的对比度。背景应该比菌落明显更暗或明显更亮。背景应具有均匀的黑暗度。
m.执行扫描。对于镜面抛光钢板，如果由于 LED 灯泡而出现白色垂直条纹，请将钢板旋转 90 °并再次扫描。
n.确认图像的总像素数小于 30,000,000。为此，右键单击图像文件并单击属性。找出像素数中的垂直和水平尺寸，并通过将两个值相乘获得总计数（即 2,000 × 2,000 图像为 4,000,000）。如果数量大于限制，请使用较低的 dpi 分辨率。
o.确认每个板的基准点在图像中可见。
p.确认样品板的上下方向正确（图1）。
q.命名文件名时要提供信息。
r.用乙醇擦拭布清洁扫描仪玻璃。
4.用于图像分析和目标识别的宏 MS
a.确认图像的总像素数小于 30,000,000。请参阅步骤 A3n。
b.使用 Firefox 或 Chrome Web 浏览器，访问MacroMS Web 工具： https://macroms.scs.illinois.edu 。（有关操作MacroMS的视频演练可以在https://www.youtube.com/watch?v=OckpuZsUfSg找到。更深入的说明可以在https://kisurbc2.gitbook.io/macroms找到）。
c.提交图像文件。
d.使用编辑基准工具，在图像中目标板三个角的基准点处放置三个基准标记。使用最大缩放将基准标记设置在基准点的精确中心。
e.使用设置 ROI 工具，设置执行目标查找的区域。选择板中菌落所在的区域。
f.在下拉菜单中选择图像阈值类型。灰色是最常用的。
g.使用滚动条调整阈值。图像面板立即显示以当前值设置阈值的图像。使用此反馈，确定导致更明显的菌落同时最小化背景噪音的阈值。
h.设置目标查找的最小和最大尺寸。对于 800 dpi 图像中的 2 mm 菌落，200 和 1,000 可以作为最小和最大尺寸的示例值。
i.将圆度限制设置为大约 0.3。
j.执行目标查找（图 6A）。可以进行多次试验来找到增加真阳性识别和减少假阴性识别的参数。只要下一个图像具有相同的 dpi 分辨率和相似的菌落大小，参数的优化值就可以重复使用。

MacroMS软件功能概述。 A. 通过对 50 mm × 75 mm ITO 载玻片的扫描照片进行图像分析来寻找菌落（Choe 等人，2021）。 B. 数据分析输出列出所有筛选菌落感兴趣峰的信号强度。 C、D. 将数据分析结果与各个菌落相匹配的数据可视化工具。 E、F。使用数据可视化工具的菌落跳跃功能从培养皿中寻找菌落。

k.如果要对菌落周围的区域进行采样，请进行循环填充，偏移值为 1。
l.使用过滤工具和目标编辑工具，从误报中删除目标框（即合并的菌落和颗粒），并将目标框添加到假阴性中。解决高假阴性率的一个选择是从额外的琼脂平板中筛选更多菌落。
m.选择目标板类型并下载几何文件。重命名几何文件以提供信息。
n.FlexControl软件几何文件的文件夹（即 D:\Methods\GeometryFiles）。切勿手动编辑几何文件的内容。
5.喷涂MALDI基质
a.使用实验室拥有的喷雾器将大约 0.1 – 0.3 mg/cm 2的 PNA 基质喷雾到样品上。如果实验室没有喷雾器，可以选择构建喷雾器设备并执行 D 部分中所述的步骤。为了进行峰对齐，建议将一种或两种内部质量校准物放入溶液中（注 8).
b.撕下步骤 A2b 中目标板上的胶带。
c.使用甲醇擦拭布，从基准点去除矩阵。
d.在目标板左上角边缘附近的基准点处，点 0.5 μL金胶体溶液并干燥液滴。

B.MALDI-MS 分析（注 9）

1.将目标板安装到适配器上（注 1）
a.将 MALDI-MS 目标板适配器放入目标板所在的化学安全罩中。
b.将目标载玻片或 ITO 玻璃连接到 PACII 适配器上：
我。清除 MALDI 目标适配器和目标板背面的颗粒物。
二.用乙醇浸湿纸巾，彻底擦拭适配器和 MALDI 目标上铜带附着的区域。建议擦拭时用力按下。
三.将 MALDI 目标安装到适配器上。目标板的上下方向应与 MALDI 适配器的方向相同，以便目标板后面的字母不会上下翻转（图 1）。
四.使用单面铜带将板粘贴到 MALDI 适配器上（图 7）。尽可能将胶带压平；仪器内的高度差容差很小。铜带不应接触适配器的多个表面。

图 7.铜带放置示例。铜带未到达 MALDI 适配器的上边缘边界上方。

c.将目标载玻片或 ITO 玻璃连接到 PAC II 适配器以外的适配器上。
按照产品手册将目标板安装到 MALDI 适配器上。检查目标板的上下方向。
d.将适配器放入运输箱内。
e.换上新手套并将盒子搬到 MALDI-MS 仪器上。
2.设置光学引导 MALDI-MS
a.将带有板的 MALDI 目标适配器插入仪器中。
b.按加载/弹出按钮。从现在开始，可以在https://www.youtube.com/watch?v=OckpuZsUfSg找到设置仪器的视频演练。
c.MacroMS下载的几何文件。
d.单击样品载体选项卡，然后单击示教按钮。
e.从下拉菜单中，找到标记为“ fiducial_X_Y_null ”的条目。例如， “ fiducial_top_left_null ”中的“ top_left ”表示对应的基准点位于目标板的左上角边缘附近（图8）。选择一个基准点后，单击“前往” 。自动移动后，通过单击视频源将视频源中的目标标记移动到基准点的中心。当目标标记位于基准点中心时，单击“已达到” （注 10）。

图 8. flexControl中的基准训练

f.对第二个和第三个基准点重复上述过程。
g.单击“确定”按钮。
h.单击视频源下方目标地图中的多个目标点。检查视频源中的目标标记是否移动到目标内的区域。如果没有，请检查是否加载了正确的几何文件或者是否正确完成了基准训练。
i.选择所需的 MALDI-MS 方法文件。
j.使用左上方基准点添加的质量校准物执行质量校准。对于金纳米颗粒，~1 至 7 Au 的峰可用于正电离或负电离模式下的校准。
k.牺牲一些菌落，调整以下参数，使感兴趣的峰具有良好的强度（注释 11）：
我。激光强度
二.激光照射次数
三.随机游走直径
l.单击“检测”选项卡并调整质量范围。对于通过MacroMS进行数据分析，质量范围的宽度不应超过 1,000 Da。
m.保存方法文件。
n.单击AutoXecute选项卡，选择所需的AutoXecute方法文件，然后在编辑器中设置激光设置，如注释 12 中所述。
o.通过单击“当前点上的运行方法”来检查基于AutoXecute方法的峰。
p.单击“自动执行”选项卡。
q.单击运行的“新建”按钮并选择当前的几何文件。
r.单击“下一步”两次。
s.在样本选择页面，鼠标拖放选择所有目标位置（图9）。避免在地图的角边缘选择基准点。

图 9. 选择菌落作为 MALDI-MS 的目标。通过鼠标单击并拖动，可以选择由MacroMS生成的目标进行 MALDI-MS 分析。

t.单击下一步，选择AutoXecute方法，选择输出文件的路径，然后输入示例名称。单击“下一步”，然后单击“完成”。
u.检查窗口中列出的信息，然后单击“确定”。
v.输入序列文件的名称并保存。
w.在质谱窗口中，仅通过缩放 X 轴放大感兴趣的一个主峰，然后单击“自动垂直缩放”复选框。
x.在AutoXecute选项卡中，单击开始自动运行。检查前 10 次采集的峰强度。
3.清洗可重复使用的 MALDI 靶材
a.挤压异丙醇洗瓶并冲洗掉目标板上的 MALDI 基质。将废物收集在 10% 的漂白剂溶液中。在清洁步骤中，小心不要在镜面抛光表面上留下划痕。
b.使用用水浸泡的 Kimwipes 去除平板上的菌落，并用 10% 漂白剂溶液收集废物。
c.将板和废物放入 10% 漂白剂溶液中并孵育 30 分钟。
d.将板放入 100% 异丙醇中，超声处理 10 分钟。
e.使用 Kimwipes 擦干板。
f.将板存放在密闭容器中。
4.数据分析
请参阅数据分析部分，了解如何在以下步骤中识别要分离的菌落。

C.下游测试

1.菌落挑取
a.打开数据分析电子邮件中包含的数据可视化地图。
b.在地图中，在输入框中输入感兴趣的菌落 ID。这突出了殖民地。
c.从步骤 A2s 的 4 °C 冰箱中获取相应的培养皿。
d.旋转培养皿，使标签位于顶部（参见步骤 A1i 和 A2c）。这意味着图像中的菌落和培养皿中的菌落的上下方向是相同的（图 1）。此外，培养皿的菌落一侧应面向观察者。
e.找到从图像和平板上均可识别的任何菌落组。它们以字母形状排列，如 I、O 和 U。这些菌落可能位于图像的边缘。
f.执行菌落跳跃以逐渐移向所需的菌落（图 6E、6F）。
我。使用笔在培养皿上圈出步骤 C1e 中的菌落所在的位置。
二.通过鼠标拖放，突出显示图像页面上的同一菌落。
三.找到下一个更接近目标菌落并且在板和图像面板中均可识别的菌落。
四.在培养皿上标记菌落，并在图像页上突出显示相同的菌落。
v. 重复寻找并标记逐渐接近目标菌落的菌落，直至到达目的地。
六.圈出培养皿上感兴趣的菌落所在的位置。
g.用无菌 P1000 吸头接触菌落并绕菌落数圈。如果所需的菌落太小或距离相邻菌落太近，可以按照以下步骤使用无菌针挑取菌落。
我。将大头针粘在笔上。
二.将笔粘在解剖显微镜的头上。
三.将培养皿放在显微镜的舞台上并打开背景灯。
四.使用打火机将销钉烧几秒钟，然后等待 30 秒冷却。
v. 将销钉移向菌落并将销钉尖端置于菌落正上方约 2 毫米处。使用显微镜的粗调旋钮在 Z 轴上移动，并手动移动培养皿在 XY 轴上移动（图 10）。

图 10. 用火焰灭菌针挑取菌落。解剖显微镜的粗调旋钮用于菌落挑取针的精确上下移动。

六.再次使用粗调旋钮降低销钉，使销钉尖端与菌落发生物理接触。或者，在接触时稍微移动板（< 0.5 mm），以最大限度地将细胞转移到销上。
七.将销钉提离菌落。
八.取下笔。
h.从分离的细胞开始 5 mL 过夜培养。
i.按照试剂盒中包含的手册，使用质粒提取试剂盒从过夜培养物中纯化质粒 DNA。将质粒 DNA 保存在 -20 °C下。
j.用纯化的质粒和对照质粒新鲜转化电感受态细胞。电感受态细胞应来自同一批次。
k.将分离株和对照接种到同一 150 mm 琼脂板的不同部分。该板应包含与用于形成酶活性产物（步骤 A1e）相同的培养基。播种时，将 50 μL细胞培养基点在琼脂培养皿上，并使用无菌移液器吸头在液体上划线。
2.MALDI-MS 确认重新生长的菌落（注释 13）
a.使用 P200 移液器吸头，在培养皿上挑选一个菌落，并薄薄地铺在 MTP 384 目标板的孔上（图 11）。由于 MALDI 溶液可能扩散，请在样品之间留一个空孔。从每个分离菌株和对照菌株中转移三个菌落。

图 11. 将微生物菌落铺展到 MALDI 目标孔上的示例

b.将 1 μL MALDI 溶液（10 mg/mL 溶解在丙酮中）点样到每个孔中，并通过蒸发干燥溶液（注释 14）。
c.执行 MALDI-MS（4,000 次射击，完全随机游走，约 40%–60% 激光功率）。有关分离分析，请参阅数据分析部分。

D.建造喷涂站并应用 MALDI 矩阵（图 12）（注 15）

图 12. 化学安全罩中的 MALDI 矩阵喷雾站概览。喷头安装在数控拉丝机的笔架上。当供给基质溶液和氮气时，喷雾头将基质溶液雾化成气溶胶。喷涂时，拉丝机步进移动喷涂头，将基体均匀地涂覆在 MALDI 板上。

1.氮气回路
a.使用活动扳手拧下化学安全罩氮气出口的倒钩连接器，露出母端口。
b.使用卡尺的内部测量爪，测量母端口的直径（一个内边缘和相对的内边缘之间的距离）并获得最接近的分数英寸（注 16 ）。
c.获取 1/4英寸管× D英寸NPTF 公头连接器，其中 D 是测量的小数英寸。
d.将连接器拧入母端口。
e.切下 6英尺的 1/4英寸尼龙管。
f.将 6英尺尼龙管连接到连接器的1/4英寸一侧。连接时，松开连接器1/4英寸一侧的六角螺母，然后将尼龙管插入孔中。使用两把扳手，用力拧紧六角螺母，将尼龙管牢固地固定到连接器上。从连接器中拉出管子以确认连接。这种方法是用活动扳手松开六角螺母，插入管子，然后再次拧紧六角螺母以固定管子，适用于下述所有连接。
g.'尼龙管的另一侧连接到 1/4英寸× 1/16英寸变径接头。
h.将 1/16英寸外径× 0.030英寸内径管连接至异径接头的1/16英寸开口。
i.英寸不锈钢管的另一侧连接到 1/16英寸三通接头的中间开口。用力弯曲 1/16英寸钢管，如图 13 所示。
j.英寸三通接头的第二个开口连接到 1/16英寸外径× 0.020英寸内径管。
k.英寸三通接头的第三个开口连接到NanoTight TM管套。所构造的喷雾头如图13所示。

图 13. 完成的喷雾头。在步骤 D2g 插入毛细管。

2.液体回路
a.将 Luer 适配器拧入 50 mL 注射器的 Luer 锁中。
b.将一体式手紧螺丝接头部分拧入鲁尔适配器。
c.将绿色管套完全插入螺纹接头中。
d.切割毛细管熔融石英毛细管的3 ' 。
e.将毛细管插入管套，直到毛细管大约 0.2英寸进入注射器。
f.用力拧紧螺丝接头。用手轻轻拉动（大约 0.1 N 的力）检查毛细管是否移动。如果是这样，请将螺丝接头拧紧。完成的装配如图 14 所示。

图 14. 注射器头

g.将毛细管的另一端连接至喷雾头：
我。稍微打开绿色管套的六角螺母。
二.将毛细管插入管套。
三.推动毛细管，直至毛细管尖端约 0.5 mm 超出 1/16 不锈钢管末端（注 17）。避免在后续步骤中错误地将毛细管从喷雾头上拉出。
四.拧紧六角螺母。
3.设置 CNC 机床
a.使用在线手册设置Bachin Draw CNC 机床和控制 PC（注 18）。执行此操作时，将 Windows PC 设置为靠近 CNC 机床所在的化学安全罩一侧。将 CNC 机床放置在发动机罩内（注 19）
b.用铝箔覆盖 CNC 的底面。使用胶带粘贴箔片。
c.（可选）将笔架放置在起始位置（左上角边缘）。在铝箔上，在距离笔杆 4:30 方向 2 cm 处标记一个点。
d.（可选）在该点处画一条水平线和一条垂直线。这些线应与机器底板矩形表面的水平和垂直边缘平行。沿着这些线贴上六块 2 英寸的胶带来记录这些线。
e.将注射泵放置在数控机床旁边。
f.按照以下步骤将喷雾头粘到笔架上。
我。完全拧紧喷雾头的六角螺母。从 1/4" × 1/16" 异径接头上断开 6' 尼龙管。
二.用水弄湿笔架上将与喷头接触的位置（图 15）。

图 15. 使用 Gorilla 胶将喷头固定到 CNC 机床笔架上的位置

三.涂抹大猩猩胶。
四.将 CNC 设备提供的钕磁铁表面弄湿，然后将大猩猩胶涂在磁铁表面上。
v. 将磁铁安装在与蓝色螺钉相对的钢区域上。
六.用力拧紧蓝色螺钉，将底部六角螺母压在磁铁上，将喷雾头固定到笔架上（图 15）。检查喷头和笔杆之间的粘合位置是否接触。
七.在笔杆的相同位置再次涂上胶水。
八.等待24小时，直至胶水完全凝固。
九.将 6' 尼龙管连接回 1/4" × 1/16" 异径接头。
g.将喷雾器的尼龙管插入实验室支架的夹子中以稳定喷雾器（图 12）。夹具和喷头之间的距离应至少为 4 ' ，以保证喷涂过程中的灵活性。
4.设置 CNC 机床的控制软件
a.打开 Inkscape 软件。（可以使用提供的绘图文件代替绘制喷涂路径。有关尺寸，请参阅注释 20。如果使用提供的文件，请跳转到步骤 D4r。）
b.以毫米为单位，计算 MALDI 基质溶液喷涂区域的水平和垂直尺寸。该区域的水平和垂直尺寸应比 MALDI 靶板大 40 mm（即，对于 110 mm × 75 mm 的板，喷涂区域将为 150 mm × 115 mm）。
c.单击左侧边栏的绘制贝塞尔曲线和直线按钮。
d.单击 X = 1.00 且 Y = 1.00 的点。鼠标的坐标可以在窗口右下角获取。
e.单击第二个点，其中 X = 1.00 + 喷涂区域的水平尺寸，Y = 1.00。
f.单击第三个点，其中 X = 1.00 + 喷涂区域的水平尺寸，Y = 3.00。
g.单击第四个点，其中 X = 1.00 且 Y = 3.00。
h.单击第五个点，其中 X = 1.00 且 Y = 5.00。按 Enter 键终止绘图。完成的单步喷涂路径如图 16 所示。

图 16. 喷涂路径的单步绘图

i.通过单击选择绘图。复制并粘贴绘图。
j.通过移动副本将副本和原件连接起来，使原图的第五个点接触副本的第一个点。触摸由消息“尖点节点到尖点节点”指示。
k.放大绘图两点的连接点（图 17）。单击左侧边栏中的按节点编辑路径 (N)按钮。
l.在缩放视图中，按住 Shift 键并单击，选择原始图形中的线条和复制图形中的线条。
m.通过按住单击并拖动，选择两条线相交的位置。然后，单击顶部菜单中的加入选定节点按钮。这会产生一条连续的连接线（图 17）。

图 17. 连接两个节点以创建连续的单一喷雾路径

n.重复复制图形，然后连接节点，直到生成的图形的垂直尺寸增长到喷涂区域所需的垂直尺寸（图 18）。

图 18. 一轮喷涂的路径。图 16 中的多个步骤通过图 17 中所示的节点到节点连接来连接。喷涂面积应比样品尺寸大 4 cm。

o.通过按住单击并拖动，选择整个喷涂路径。然后，将路径复制并粘贴到同一画布中。然后，将复制的内容精确移到原始内容的上方，使复制的内容完全隐藏原始内容。在将复制的内容移向原始内容的同时，该软件会协助完全重叠。
p.重复上述步骤，这会产生四个重叠的路径。这意味着喷涂过程要重复四次。
q.将文件保存为 SVG 格式。
r.Bachin Draw软件中打开SVG文件，将喷涂区域的左上角边缘移动到画布的原点。原点是两条粉色线交叉的地方（图 19）。

图 19. 加载到 CNC 控制软件中的喷涂路径。红色所示的喷涂路径是Inkscape软件绘制的路径。

s.Bachin Draw的开始按钮即可完成SVG文件定义的完整路径。在模拟喷涂过程中，找到并清除阻挡喷头、毛细管和气管路径的障碍物。另外，检查气管是否接触到铝箔或对喷雾头的1/16" × 0.020" 管造成太大压力。通过调整尼龙管的长度或实验室支架的位置或通过扭转在管上产生旋转应变来避免这些问题。为了产生旋转应变，松开固定尼龙管的六角螺母，扭转尼龙管，然后用手握住扭转的管，再次拧紧六角螺母。
5.设置真空干燥器
a.将5英尺长的聚氨酯橡胶管切成两半。
b.将真空干燥器设置在通风柜内。
c.使用聚氨酯橡胶管，将干燥器上的倒刺连接器连接到安全罩真空出口的倒刺连接器。
d.将安全罩气流出口的倒刺接头连接至聚氨酯橡胶管。
6.喷涂MALDI基质
a.穿一件完全覆盖手腕的翻边袖实验室外套。
b.在乙腈中制备 20 mL 5 mg/mL 的 PNA 基质溶液（注 2），并放入 60 mL 注射器中。对于峰对齐，建议将一种或两种内部质量校准物放入溶液中。参见注释 8、17 和 21。
c.将 50 mL 甲醇放入另一个 60 mL 注射器中。将约 3 mL 空气放入注射器中。
d.准备一个含有乙腈的 50 mL 管。
e.Bachin Draw 软件的向下按钮检查 PC 是否与 CNC 通信。 CNC 应通过移动喷头来响应（注 22）。然后，按主页按钮。
f.将 50 mL 管的塑料盖放在喷雾头的喷嘴下方。
g.输入注射器的宽度和注射器泵的流量（即 60 mL 注射器为 24.5 mm 和 25 mL/h）。
h.通过毛细管将甲醇清洗注射器连接到喷雾头。
i.手动推动柱塞，用 ~1 mL 的清洗溶液清洗毛细管。
j.通过从清洗注射器中注入空气来清空毛细管。
k.从清洗注射器（图 14 中的非注射器组件）上取下鲁尔适配器和毛细管，并将它们连接到装有基质溶液的注射器上。
l.将基质溶液的注射器安装到注射泵上。
m.管线的六角螺母，断开燃气管线与 1/4英寸至 1/16英寸连接器的连接。将 2 mL 丙酮溶液移入 1/4英寸至 1/16英寸连接器的开口中，以吹扫喷雾头的气路（图 20）。将空气移入管中，除去管中的溶剂。再次将气体管线连接回连接器。在此过程中避免弯曲 1/16英寸管。

图 20. 清洁喷雾头以去除喷雾器中的固体残留物

n.在Bachin绘图中，打开定义目标板喷涂区域的相应 SVG 文件。在 25 mL/h 流速下，应选择具有 4 次扫描的文件。确保绘制路径的左上角边缘位于原点。
o.将目标板放置在铝箔上的喷涂区域内。
p.尽可能关闭化学安全罩的储藏处。
q.打开喷雾头的氮气管线。
r.打开注射泵。
s.等待 30 秒。
t.通过喷嘴下方出现喷雾来检查喷雾是否开始（注 23）。完全关闭安全罩的储藏室。
u.按 CNC 控制软件上的启动按钮。检查1分钟后，从房间内撤离。
v.喷涂完毕后，微开安全罩，先停止注射泵。
w.等待 30 秒并关闭氮气管线。
x.等待 10 分钟，让目标板干燥，喷雾中的气溶胶完全消失。
y.将毛细管连接到清洗注射器，并用〜1 mL的甲醇净化毛细管。
z.使用浸泡过甲醇的 Kimwipes，从板上的基准标记上除去基质。
aa.将 0.5 μL质量校准物点在板左上角附近的基准标记处。
bb.干燥校准溶液。
cc.撕掉目标板上的胶带并继续执行步骤 B2。
dd.如果 MALDI-MS 筛选是在单独的一天进行的，并且如果有氮气柜可用，则将板放入干净的塑料容器中，使用 parafilm-M 密封盒子，然后将盒子放入柜中。放入氮气柜前，用乙醇擦拭盒子外部。

数据分析

1.（数据分析的视频演练可在https://www.youtube.com/watch?v=OckpuZsUfSg的“提交数据分析”和“打开处理的数据”部分获取）使用flexAnalysis ，确认获得的质谱的质量范围低于m/z 1,000。例如，如果采集的质谱范围为m/z 300 至m/z 1,400，则无法通过MacroMS分析数据文件。请勿手动修改质谱数据文件（包括文件名）。
2.将质谱数据压缩到压缩文件夹中。重要的是压缩包含各个数据文件的文件夹，而不是压缩通过 Ctrl + A 键选择的各个数据文件。例如，如果保存质谱数据的文件夹的路径为 C:\Data_313\BTE6，则各个质谱数据的路径为 C:\Data_313\BTE6\0_0_366.64_152.14_5 和 C:\Data_313\BTE6\ 0_0_902.34_857.42_3，压缩BTE6文件夹，而不是Data_313文件夹或0_0_366.64_152.14_5_1.0。文件夹。
3.获取用于生成目标列表的图像文件。检查图像文件的名称是否包含足够的信息来识别样本，因为该名称将用作所有数据输出的标题。如果没有，请更详细地重命名它。
4.创建一个文本文件，其中包含最多 10 个感兴趣峰的m/z范围。在flexAnalysis中，以重叠模式加载 10 个随机选择的质谱图。导航至感兴趣的峰，然后找到可以跨越所有重叠峰的两个m/z值。在文本文件中输入值（图 21）。文本文件以制表符分隔，这意味着必须使用制表键而不是空格键来分隔值。或者，从 Excel 电子表格的两列剪切和粘贴会在文本文件中生成制表符分隔的条目。

图 21. 定义感兴趣的峰。如果感兴趣的峰出现在大约 218.17 处，则应将在所有 10 个重叠质谱中包含该峰的 m/z 范围值（218.02 和 218.33）插入到文本文件中。在文件中，两个值应使用 Tab 键分隔。

5.或者，可以通过添加添加到 MALDI 基质溶液中的一种或两种内部校准物的精确质量来完成峰对齐（步骤 D6b）。具有加合物的内部校准物的精确质量可以使用在线精确质量计算器（例如sisweb.com 的工具）从化学式中获得。在flexAnalysis中，以重叠模式加载大约 10 个质谱图。确认与内部校准物对应的重叠峰出现在质谱中。另外，确认质量校准物的m/z 0.5范围内没有出现更大的峰。输入准确的质量，如图 22 所示。使用峰对齐时，输入感兴趣峰的质量范围的格式也会发生变化。第一个数字是化合物的精确质量，第二个数字是重叠峰宽度的 70%，同样以制表符分隔（图 22）（注释 24）。

图 22. 定义峰对齐和感兴趣峰的质量校准物。为了定义质量校准物，将质量校准物的精确质量（在本例中为 285.279）放入文本文件中。为了定义感兴趣的峰，应插入具有加合物的化合物的精确质量以及跨越所有 10 个重叠质谱（即 339.73 和 0.21）的 70% 峰宽。这两个值（339.73 和 0.21）应使用 Tab 键分隔。

6.使用主页的输入字段将电子邮件地址、压缩数据文件、图像和文本文件提交到MacroMS中。不要从多个窗口或选项卡同时上传多个文件，这可能会导致文件上传崩溃。数据处理速度约为每个质谱 3 秒（即，每个菌落筛选生成 1,200 个质谱需要 1 小时）。
7.打开列出数据分析结果的电子邮件并保存 Excel 输出文件。
8.打开 Excel 电子表格，其中列出了感兴趣峰的离子计数（图 6B）。
9.对于酶突变体库的筛选，寻找两种产品之间比例发生改变的分离株，按两个峰的总和对样品进行排序，并去除底部 70% 的非活性变体。
10.添加一列，列出剩余样品的两个峰之间的比率。使用较大的峰值作为比率计算的分母可以减少信号噪声引起的变异性。
11.按 X 坐标和 Y 坐标将菌落分为两个大小相等的组。使用学生t检验等统计数据，检查各组之间的峰值比率是否存在显着差异。如果存在显着差异，选项可以是多元异常值检测（马氏距离计算），利用Excel中的X、Y坐标和峰值比值，按组进行异常值检测，或者看看观察到的异常值的变化是否更大比组间的差异。
12.按所有活动变体的比率值对行进行排序。获取所有峰值比率的平均值和标准偏差值。找出与平均值相差一或两个标准差的值。对于由MacroMS圆形包装生成的数据，额外的表列出了每个菌落的平均值。数据处理应使用组的平均值。
13.复制感兴趣菌落的 Blob ID 或 Group ID，从电子邮件中打开数据可视化图，并将 ID 放入输入框中。单击显示样本以找到图像中的样本（图 6C）。
14.要绘制所选菌落感兴趣峰的质谱图，请选择峰的复选框，然后单击绘制所选峰。峰应位于所示质谱的灰色区域内，并且峰强度最好应大于 4,000（图 6D）。然后，可以分离菌落进行下游测试。
15.为了分析为再生分离株采集的 MALDI-MS 数据（步骤 C1k），请将数据加载到flexAnalysis中。单击与每个文件对应的复选框。然后，通过单击顶部文件并按住 Shift 键并单击底部文件，以蓝色突出显示所有文件。
16.查找质量列表的图标按钮。
17.单击顶部文件并打开质量列表窗口。
18.通过按住 Ctrl 键并单击，选择所有感兴趣化合物的峰拾取结果。如果峰丢失，请转到“方法”，选择“编辑处理参数” ，将“峰检测算法”更改为“质心” ，然后再次对所有文件运行“查找质量列表” 。
19.将数据复制并粘贴到 Excel 文件中。同样，传输所有样本的数据。
20.使用学生t检验根据峰面积比率将分离株与对照进行比较，或创建可视化变化的散点图（图 23B）。

图23 。用于表达 UcFatB2 随机文库的大肠杆菌菌落的 MALDI-MS 筛选的示例数据集。 A. 来自 MALDI 筛选的每个菌落的 C12 游离脂肪酸和 C14 游离脂肪酸之间的比率，通过分析用 MALDI 喷雾器包被的印记菌落来测量。分离出显示最低 C12/C14 FFA 比率的两个菌落（红色箭头）进行重新测试。 B. 再生分离株和野生型对照的 C12/C14 FFA 比率，通过分析用干燥液滴 MALDI 溶液处理的手动扩散菌落来测量。

协议验证

硫酯酶底物特异性的工作进行了验证（Jindra 等人，2023）并且另一项研究改变了去饱和酶的区域选择性（Choe et al., 2023）。

笔记

1.从机械车间设施中，使用 8 号镜面抛光钢（9785K14，McMaster-Carr）构建以下金属目标板（图 24）。厂家镜面抛光的钢板表面会在表面留下细小但可见的线条，切割板材的角度不应是对角线，而是与这些线条平行/垂直。对角线可能会在扫描仪成像过程中导致图像伪影。这四个点是通过激光蚀刻形成的，它们充当基准点。或者，也可以使用以下适配器-目标对：1) HTS MALDI 适配器 1.0 mm 和 HTS MALDI 板，以及 2) MTP 目标框架和 MTP 384 目标板抛光钢。强烈推荐 HTS 板和适配器，因为板通过磁铁安装到适配器上，无需使用铜带，板右下角写有唯一的序列号，无需用笔标记板即使在矩阵喷涂之后，其内部基准标记在仪器视频输入中也高度可见，并且不需要在侧边缘处粘贴以固定铜带。建议使用金属 MALDI 靶标代替玻璃 ITO 载玻片，以提高灵敏度并更好地附着大肠杆菌菌落。对于 ITO 载玻片，基准点可以是玻璃的角边缘点或玻璃雕刻笔创建的十字标记的中心。

图24.定制 MALDI 目标板的D绘图

2.不同的 MALDI 基质导致印迹集落的 MALDI 敏感性不同程度。虽然 PNA 和 1,5-二氨基萘 (DAN) 能够直接测量菌落中的化合物，但 2,5-二羟基苯甲酸 (DHB) 和 α-氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA) 则不能。为了通过 DHB 和 CHCA 进行更好的测量，请使用小菌落 (~0.5 mm) 来减少样品厚度，或从菌落周围的区域测量 MALDI 基质喷雾期间从菌落散开的样品化合物。在第二种情况下，每个 MALDI 目标板 (75 mm × 110 mm)的菌落密度必须降至 250 以下，并且MacroMS的圆形包装工具应使用偏移值 1 。或者，可以使用含盐的 DAN 作为 DHB 或 CHCA 的替代品，直接从菌落进行正电离。另外，请务必阅读材料安全数据表 (MSDS)，以检查 MALDI 基质和用于制备 MALDI 基质溶液的溶剂是否有毒（即 9-氨基吖啶和乙腈）或更安全[即 DHB、CHCA 和 N-( 1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NEDC）]。即使在化学安全罩内进行喷涂，将化学溶液喷成细雾也会增加暴露的风险。此外，在将样品板转移到 MALDI-MS 仪器时，样品板应放在干净的容器中，并戴上干净的手套。当涉及有毒化合物时，可能需要佩戴呼吸器。手套应经常更换。为了安全起见，在制备MALDI溶液时可以用丙酮代替乙腈。最后，避免将纳米颗粒和碳基基质（即石墨、石墨烯、碳纳米管等）用于大型 MALDI 屏幕，因为它们对仪器有潜在影响。
3.硫酯酶以外的酶进行菌落筛选之前，应确定用于生长菌落的细胞培养方法的持续时间、温度和培养基组成，以提高酶活性或生化活性的产物形成。可以尝试具有不同拷贝数的质粒。此外，应选择生产改进产品同时保持与 MALDI 目标板良好附着而不会剥落的菌株（即大肠杆菌的 K-12 菌株）。 MALDI-MS 测量中较大的峰面积和信噪比可以更可靠地检测产品概况的变化。对于大肠杆菌，起始点可以是在含有 100 μM IPTG、100 μg /mL 羧苄青霉素和 1% 葡萄糖的过滤灭菌培养基制成的 LB 板上在 37 °C下生长细胞 12 小时。可选地，菌落可以首先在生长板中形成，然后转移到诱导板用于酶生产（Si等人，2017）。为了测量试验实验中生长的菌落的产物，使用移液器吸头将菌落的生物量转移到 MALDI 板的孔中并将其薄薄地铺开（图 11）。点取 1 μL MALDI 溶液进行分析。更准确的峰值强度测试是对通过标准喷雾程序涂有 MALDI 基质的印迹集落进行 MALDI-MS 分析。此外，该工作流程适用于非挥发性化合物。显影前检查仪器高真空环境下化合物的损失情况。首先，制备 MALDI 基质溶液和标准品的混合物，然后点样到 MTP 384 板中的 12 个不同的孔上。当 MALDI 靶板处于高真空环境时，对前三个孔进行 MALDI-MS 分析。每 30 分钟在一组不同的三个孔上重复测量。比较标准品峰强度的差异。对于 MALDI 分析，使用 5,000 次激光照射，激光频率为 1,000 Hz，并完全随机游走。最后，对于通过基于比率的菌落筛选对单一化合物进行相对定量，由于菌落 MALDI 分析中固有的化合物提取和电离不一致，基于比率的筛选的理想内部校准物可以是以下化合物：产生的细胞位置与目标化合物的产生位置相同（即细胞质与细胞膜）。
4.在添加对温度敏感的抗生素之前，可以使用红外温度计检查冷却琼脂溶液的温度。此外，它还可用于在接种细胞之前检查加热的琼脂板的温度。
5.使用从更丰富的培养基（例如过滤灭菌的 LB 溶液）中生长的电感受态细胞可以更好地生产化合物。最大限度地减少电感受态细胞和源菌株小瓶之间的代沟。此外，用新鲜转化的细胞接种平板而不进行过夜培养步骤可能会导致更好的产物形成。
6.使用石蜡膜-M 的目的是减少水分损失，以实现菌落转移步骤。根据作者的经验，增加细胞培养箱本身的湿度会导致印迹时菌落从金属板上剥落。通过封口膜密封增加菌落的湿度有助于解决剥落问题。
7.如果大肠杆菌发生明显剥落： 1) 在干燥培养箱中进行培养； 2) 对于生长菌落，请使用在生物安全罩中干燥超过 40 分钟的琼脂平板； 3) 通过减少生长时间或增加菌落密度来使用较小的菌落（1 mm或更小）； 4)使用等离子清洁器或辉光放电系统对MALDI靶板的镜面抛光表面进行深度清洁； 5) 考虑寻找粘性宿主菌株（Neve et al., 2020）并避免使用 DH5α； 6) 尝试菌落室温生长； 7) 在生长培养基中添加IPTG/阿拉伯糖诱导蛋白表达； 8) 在步骤A2i之后，通过设置在含有这些化合物的琼脂凝胶上，用MS兼容的粘合剂例如DHB (Jens等人，2022)和甘油浸泡滤纸和菌落，然后压印。
8.由于MacroMS峰对齐使用的算法而出现在距较大峰 0.5 m/z的范围内，则不应选择质量校准物。 ~1 mg/mL 的氨基酸和奇数链脂肪酸可用作内部质量校准物。
9.在屏幕之前，应优化 MALDI-MS 仪器参数和 MALDI 矩阵的灵敏度和峰分辨率。此外，还应对分析物检测方法进行验证。应查阅仪器手册来调整激光功率、激光束宽度、激光发射的数量和频率、栅极电压、脉冲延迟、随机游走、电离模式的极性、脉冲离子提取时间、加速电压、提取电压、透镜电压、反射器电压，以及反射器/线性模式的选择。这些参数应基于测量通过相同方案生长和制备的菌落中感兴趣的化合物来制定。 ultrafleXtreme的工作参数包括 50% 激光功率、超激光宽度、反射模式、4,000 次激光发射和 800 μm完全随机游走。对于由MacroMS圆形堆积生成的目标，可以使用1,500 次 600 μm完全随机游走的激光发射。 Autoflex可用于分析多个培养皿的屏幕工作流程。有文献资料介绍MALDI-MS优化和选择MALDI矩阵（ Barwick 等人，2006 年； Calvano 等人，2018 年； Leopold 等人，2018 年）。为了验证化合物的鉴定，应将串联质谱 (MS/MS) 得到的菌落样品的质谱与化学标准品的质谱进行比较。对于可诱导产生目标化合物（即通过阿拉伯糖诱导表达酶）的菌株，如果峰仅在存在诱导剂（即阿拉伯糖或 IPTG）时出现，则有助于化合物验证。
10.如果激光烧蚀点与视频输入的中心目标标记之间存在距离，请使用实际激光烧蚀点执行基准训练。例如，如果激光烧蚀点略低于视频输入中的目标标记，则使用激光目标点而不是视频输入的目标标记执行基准训练（Choe et al., 2021）。此外， macroMS软件的最终版本并不像 YouTube 视频中 1:56 的情况那样使用数值来标记基准点。
11.偶尔检查 MALDI-MS 源清洁是否执行良好。如果不进行清洁，MALDI-MS 灵敏度会显着下降。单击flexControl软件中的“状态”选项卡，单击“详细信息”按钮，打开“处理器子系统”选项卡，然后检查源清洁维护间隔。检查该值是否低于 12%–15 %。如果该值高于此范围，请咨询仪器管理员该值对于 MALDI-MS 灵敏度是否可接受。
12.下面介绍如何设置AutoXecute文件。在FlexControl主窗口的AutoXecute选项卡上，选择要在下拉菜单中打开的AutoXecute方法文件，然后单击编辑。在AutoXecute方法编辑器的常规选项卡中，选择要使用的方法文件。在AutoXecute文件的 Laser 选项卡中，关闭 Fuzzy Control。在“评估”选项卡中，为“使用背景列表”选择“无”。在“累积”选项卡中，关闭“动态终止”。单击“模糊”控制，在“总结”和“满意镜头”的输入框中输入所需的激光镜头数量，然后单击“关闭”模糊控制。在“移动”选项卡中，选中“随机游走”复选框，并为“光栅点镜头”输入 50。在“处理”选项卡中，为所有字段选择“无”。单击“保存”按钮。当完成上述步骤后保存AutoXecute文件时，在进入下一个屏幕之前只需设置激光发射的数量。
13.再生菌落的另一种 MALDI 测试是对通过与原始文库筛选相同的喷雾程序和 MALDI-MS 方法制备的分离株的印记菌落进行MacroMS引导的 MALDI-MS 分析。此时，实验组和对照组的菌落应使用相同的滤纸进行印迹。另一种选择是：1) 将每个样品中的所有菌落放入装有 50 μL水的小瓶中； 2) 充分混合液体样品； 3) 一式三份，将 1.5 μL样品点样于 MTP 384 靶板孔的精确中心； 4) 将样品放置在室内空气中干燥； 5)按照与原菌落筛选相同的喷雾程序施加MALDI基质； 6) 在 > 5,000 次激光照射、干燥液滴中心 800 µm 随机游走和 40%~60% 激光功率下执行 MALDI-MS。在这些方法之后，执行协议中提到的相同数据分析步骤。
14.对于可以显示菌落样品的 MALDI-MS 敏感性降低的 DHB 和 CHCA 基质，可以使用点和转移提取方法。使用 P2 移液器，将 1 μL基质溶液点样到 MALDI 目标孔中的菌落上，接触后 1 秒内吸出液体，然后点样到第二个孔上。 MALDI-MS 测量在第二个孔上进行。
15.为了定性筛选菌落中是否存在特定化合物，可以使用喷枪而不是使用喷雾站喷雾 MALDI 基质。然而，这可能会导致样品制备的通量降低和灵敏度的变异性增加。执行步骤D1b以获得管道和燃气管之间的连接器仍然是必要的。
16.母端口的常见尺寸是 3/8英寸。在这种情况下，可以使用的示例是 1/4英寸管外径× 3/8英寸内径-18 NPTF 公头连接器。
17.毛细管应每 1-2 个月更换一次。如果不更换，毛细管的机械强度会降低，导致破裂。
18.可以在以下链接找到构建 CNC 机床的手册： http://www.bachinmaker.com/? p=46&a=view&r=209
19.重要的是不要弯曲插入 CNC 设备 USB 端口的 USB 电缆的端子； USB 端口很容易被破坏。将 USB 电缆粘贴到化学安全罩的底面上，以稳定 USB 电缆。尽量减少 CNC 机床的移动。
20.文件定义的喷涂区域的垂直和水平尺寸如下： ALL_AREA-4 Sweeps.svg ：273 mm × 190 mm，PACII-4 Sweeps.svg ：126 mm × 150 mm，TLC-4 Sweeps.svg ： 62 毫米× 150 毫米。锉刀进行四轮喷涂。
21.如果进行化学衍生化，则在玻璃瓶中制备 1.5 mL 衍生溶液（即溶解在甲苯中的 5 mg/mL fmoc-氯化物和 1.5 mg/mL 吡啶），放入 1 mL 玻璃注射器中，将注射器安装到注射泵，连接毛细管，以 10 mL/h 的速度进行一扫喷雾。这些步骤应快速完成，因为衍生剂可能开始失去反应性（即fmoc氯化物需要 20 分钟）。喷涂后立即用 1 mL 甲醇净化液体回路（步骤 D6y），并在步骤 D6x 中至少花费 30 分钟，以便更好地消除气溶胶。然后，将 MALDI 基质溶液喷涂到样品上。对于基于气体的衍生化，例如臭氧分解，可能需要通过泵施加气体来在反应室中均匀混合气体。
22.如果即使打开机器电源并连接到 PC 后 CNC 机床也没有响应，请进入控制面板中的设备管理器，进入通用串行总线控制器，右键单击连接到 CNC 机床的 USB 设备，然后尝试禁用并启用 USB 设备。可能需要反复试验才能找到连接到 CNC 机床的正确 USB 设备。或者，关闭然后打开设备和 PC。
23.如果罩内的空气湍流足够强，足以明显扰乱喷雾的流动，请在喷嘴周围安装一个迷你塑料杯，以防止空气湍流。另外，当喷雾以大约2秒的周期间歇时，进行毛细管高度调节和液体净化（步骤D2giii、步骤D6i和步骤D6m）。最后，启动气体喷雾的另一种方法是 1) 启动泵而不打开氮气，2) 等待液滴出现，然后 3) 启动氮气。
24.具有峰对齐的m/z范围列表的另一种方法是对齐到显示所有感兴趣化合物和质量校准物的大峰的单个光谱。当目标化合物的肩部存在污染峰时，该方法是合理的；这使得使用标准方法设置m/z范围变得极其困难。使用flexAnalysis找到显示所有目标化合物和校准物大峰的质谱。接下来，最大程度地放大质量校准物的峰尖，并获取出现最大 Y 值的 X 值。将 X 值写入文本文件作为校准物的质量值。对第二个质量校准物重复上述步骤。对于感兴趣的化合物的m/z范围，使用光谱峰的m/z范围（即 521.1 521.3）作为化合物的输入值。

致谢

这项工作由能源部先进生物能源和生物产品创新中心（美国能源部、科学办公室、生物和环境研究办公室）资助，奖项编号：DE-SC0018420。所使用的仪器得到了国家药物滥用研究所的部分支持，奖项编号为 P30 DA018310。本出版物中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点，并不一定反映资助机构的观点。该协议改编自验证出版物（Jindra 等人，2023）。通过滤纸印记转移琼脂菌落的想法改编自 Si 等人。（2017）。

利益争夺

作者声明不存在竞争性经济利益。

参考

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补充资料

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