材料与试剂

生物材料

菌株
1.BL21(DE3) Δ serC （ Addgene ，#197656）。这种 BL21(DE3)大肠杆菌菌株的serC基因被敲除，以阻止磷酸丝氨酸的生物合成，磷酸丝氨酸会与nhpSer竞争掺入蛋白质（图 1）。该菌株含有释放因子 1 (RF1)，该蛋白质负责终止 TAG 琥珀密码子的翻译，因此截短的蛋白质将与全长nhpSer蛋白质一起产生。为了避免截短蛋白与全长蛋白的共纯化，建议使用 C 端纯化标签。对于自组装成同源多聚体（二聚体、三聚体等）的蛋白质，纯化可能具有挑战性，因为可能对作为亚基掺入组装中的截短形式进行共纯化。如果使用 N 端纯化/溶解标签，可能需要额外的纯化步骤来去除截短的蛋白质种类。更多讨论请参见一般注释 1。
2.DH10b（ Thermo Fisher，目录号： EC0113）。当用户希望将其感兴趣的基因克隆到pRBC质粒中时，该菌株可用于质粒的忠实繁殖和克隆需求（参见下面的质粒）。请勿用于蛋白质表达。尽管我们尚未明确测试所有这些菌株，但可以使用其他经典的大肠杆菌克隆菌株，包括 NEB 10-beta（New England BioLabs ，目录号： C3019H）、DH5 α （例如Thermo Fisher，目录号： 18258012）、NEB 5-alpha（New England BioLabs ，目录号： C2987H）或 TOP10（ Thermo Fisher，目录号： C404010）。

质粒
1.pERM2-nhpSer（ Addgene ，#201922）：用于nhpSer掺入的机械质粒，具有pUC复制起点的卡那霉素抗性。该质粒表达与pSer掺入相同的 tRNA 合成酶和 EF-Tu (Rogerson 等人，2015）。 Chin 及其同事开发了抑制SeptRNA CUA 的琥珀密码子v2.0，以尽量减少错误氨酰化（Zhang 等人，2017）。 Sep-tRNA 和 tRNA 合成酶分别通过lpp和GlnS启动子组成型表达。 EF-Tu 受 IPTG 诱导型 tac 启动子控制。大肠杆菌也通过 OXB20 启动子组成型表达 serB蛋白进一步消除（水解）可能来自培养基或由混杂的转氨酶产生的游离pSer氨基酸。
2.pCDF-Frb-v1（ Addgene ，#201923）：表达Streptomyces rubellomurinus nhpSer 生物合成所需的FrbA 、 FrbB 、 FrbC 、 FrbD和FrbE酶。见朱等人。 (2023) 详细描述了该生物合成途径，图 2 也对此进行了总结。每种Frb蛋白均在工程 T7 转录启动子变体的控制下表达，因此所有Frb酶均通过添加 IPTG 来表达。该质粒具有奇霉素抗性并包含CloDF复制起点。该质粒很大（~11 kb）并且包含重复元件；虽然我们尚未观察到该质粒的不稳定性，但鉴于其体积较大，最好尽量减少繁殖。我们建议您在收到来自Addgene的带有 pCDF-Frb-v1 质粒的 DH10b 细胞时，在液体培养基中培养几个单独的菌落过夜 [例如，补充有 100 μg/mL 壮观霉素的 2 × YT 培养基（参见配方） ] 并制作细胞的冷冻甘油储备液以供长期储存。甘油原液可通过将 600 μL过夜培养物与 400 μL无菌 50% (v/v) 甘油混合来制备。将培养管放入-80 °C 冰箱中保存。这些储备液可作为永久、长期的质粒来源，可以通过用来自冷冻甘油储备液的细胞接种培养物来制备质粒。甘油原液冷冻后请勿解冻。
3.pRBC-sfGFP野生型（ Addgene ，#174075）：在 T7 转录启动子、氨苄青霉素抗性/p15a 复制起点下表达带有 C 端 His6 标签的野生型sfGFP控制蛋白。 sfGFP是通过添加IPTG来表达的。
4.pRBC-sfGFP 150TAG（ Addgene ，#174076）：与上述相同，只是sfGFP基因在位点 N150 处包含 TAG 琥珀终止密码子。 TAG密码子用于指导nhpSer的翻译编码。请注意，这也是用于pSer编码的相同质粒（Zhu 等，2022）；克隆到该载体中用于pSer编码的任何蛋白质也适用于nhpSer编码。有关更多讨论，请参阅一般注释 2。
5.pRBC -[x] 野生型（您必须创建）：表达您的野生型目的蛋白 (POI)。您可以通过从pRBC-sfGFP中删除sfGFP基因，将 POI 克隆到pRBC中使用NdeI和XhoI酶限制性消化wt质粒，并使用标准克隆技术（例如，连接、Gibson Assembly 或SLiCE ）将其替换为您的 POI 基因。由于上述原因，优选 C 端纯化标签。有关构造设计的有用提示，请参阅故障排除 1。
6.pRBC -[x] TAG（您必须创建）：用TAG 密码子编码的nhpSer表达您的 POI。您可以通过使用NdeI和XhoI限制性消化去除sfGFP基因，然后使用标准克隆技术（例如，连接、Gibson Assembly 或SLiCE ）替换为 POI 基因，从而将 POI 克隆到pRBC中。使用定点诱变，将密码子更改为 TAG（琥珀色终止密码子），您打算将nhpSer编码到 POI 中。

试剂

1.胰蛋白胨（例如，VWR ，目录号： 97063-386）
2.酵母提取物（例如，VWR，目录号：97064-368）
3.氯化钠（例如，VWR，目录号：97061-274）
4.琼脂（例如，VWR，目录号：97064-336）
5.MgSO 4 · 7H 2 O（例如，VWR，目录号：97062-134）
6.K 2 HPO 4 （二元钾）（例如，VWR ，目录号： 97062-234）
7.KH 2 HPO 4 （二元钾）（例如，VWR ，目录号： BDH9268）
8.α -D-葡萄糖（例如，VWR ，目录号： 97061-168）
9.甘油（例如，VWR ，目录号： BDH24388.320）
10.异丙基b -D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（例如Anatrace ，目录号： I1003）
11.氨比西林（例如，VWR ，目录号： 97061-442）
12.卡那霉素（例如，VWR ，目录号： 75856-684）
13.壮观霉素（例如，VWR ，目录号： 89156-368）
14.消泡剂 B（例如， JT Baker ，目录号： B531-05）
15.磷酸标签丙烯酰胺（例如，VWR ，目录号： 101974-086）
16.干冰
17.乙醇（例如，Sigma ，目录号： 65348-M）
18.丙烯酰胺/生物丙烯酰胺溶液（例如，Bio-Rad ，目录号： 1610146）

解决方案

1.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（例如，VWR ，目录号： 75800-982）
2.LB/琼脂（参见食谱）
3.2 × YT 媒体（参见食谱）
4.50% (v/v) 甘油（参见配方）
5.10% (v/v) 甘油（参见配方）
6.SOC 介质（参见食谱）
7.发酵剂培养基（参见食谱）
8.1.1 ×很棒的肉汤培养基（参见食谱）
9.10 × TB 磷酸钾缓冲液（参见配方）
10.氨苄青霉素原液（参见食谱）
11.卡那霉素原液（参见食谱）
12.大观霉素原液（参见食谱）
13.0.5 M IPTG（参见配方）

食谱

1.LB/琼脂培养基 (0.5 L)
试剂最终浓度数量
胰蛋白胨1 % （重量/体积）5克
酵母抽提物0.5 % （重量/体积）2.5克
氯化钠1.0 % （重量/体积）5克
琼脂1.5 % （重量/体积）7.5克
水分子_不适用至 500 毫升
全部的不适用500毫升
a.充分混合试剂后，在标准液体设置下进行高压灭菌。请注意，琼脂在高压灭菌之前不会进入溶液。
b.高压灭菌后，轻轻旋转瓶子，确保融化的琼脂混合均匀。
笔记：
我。将 LB/琼脂瓶存放在 55 °C烤箱中，并根据需要倒入平板。如果保持无菌，LB/琼脂可以熔融形式保存约 2 周。
二.如果没有烤箱，一旦LB/琼脂充分冷却到可以触摸，就可以在平板上倒入抗生素。板可在 4 °C下保存长达一周。

2.2× YT 媒体（1 L）
试剂最终浓度数量
胰蛋白胨1.6 % （重量/体积）16克
酵母抽提物1.0 % （重量/体积）10克
氯化钠0.5 % （重量/体积）5克
水分子_不适用至 1,000 毫升
全部的不适用1升
a.充分混合试剂后，在标准液体设置上进行高压灭菌。
b.高压灭菌后，使用前冷却至室温。

3.50% (v/v) 甘油 (500 mL)
试剂最终浓度数量
甘油（100%）50 % （体积/体积）250毫升
水分子_不适用250毫升
全部的不适用500毫升
将合适的磁力搅拌棒放入 500 mL 量筒中进行混合，并向量筒中添加 250 mL 水。搅拌的同时，将纯甘油倒入量筒上至 500 mL 标记处。搅拌 5 分钟，然后转移至 0.5 L 瓶中。通过液体设置高压灭菌进行灭菌。

4.10 % (v/v) 甘油 (1 L)
试剂最终浓度数量
甘油（100%）10 % （体积/体积）100毫升
水分子_不适用900毫升
全部的不适用1升
将合适的磁力搅拌棒放入 1,000 mL 量筒中进行混合，并向量筒中添加 900 mL 水。搅拌的同时，将纯甘油倒入量筒上至 1,000 mL 标记。搅拌 5 分钟，然后转移至 1 L 瓶中。通过液体设置高压灭菌进行灭菌。

5.SOC 介质，50 mL
试剂最终浓度数量
2 × YouTube 媒体不适用49毫升
1M 硫酸镁410毫米0.5毫升
40% (w/v) α -D-葡萄糖0.4% (w/v) 或 ~20 mM0.5毫升
全部的不适用50毫升
a.1 M MgSO 4可以通过将 12.3 g MgSO 4 · 7H 2 O 在水中混合至总体积达 50 mL 来制备。如果使用不同水合状态的盐，则调整MgSO 4的质量。
b.40% (w/v) α -D-葡萄糖可通过将 20 g α -D-葡萄糖与水混合至总体积达 50 mL 来制备。充分混合直至葡萄糖溶解。在微波炉中温和加热可促进葡萄糖的溶解。
c.MgSO 4 、葡萄糖和 2 × YT 溶液进行灭菌。让每个组分冷却至室温并按上述方法混合。将成分添加在一起时保持无菌。
d.很容易污染SOC。我们建议在使用前将其分成 5 × 10 mL 等份或进行小批量生产。如果保持无菌状态，SOC 可以在室温下无限期保存。它也可以储存在-20 °C ，但避免反复冻/融。

6.发酵剂培养基：2 × YT + 0.5% (v/v) 甘油 (50 mL)
试剂最终浓度数量
2 × YT 介质（无菌）不适用49.5毫升
50% (v/v) 甘油（无菌）0.5%（体积/体积）0.5毫升
全部的不适用50毫升
使用前立即准备。

7.1.1 ×极好的肉汤培养基 (0.9 L)
试剂最终浓度（1 × ）数量
胰蛋白胨1.2 % （重量/体积）12克
酵母抽提物2.4 % （重量/体积）24克
甘油（50 % [v/v]）0.5 % （体积/体积）10毫升
水分子_不适用至 900 毫升
全部的不适用900毫升
a.通过液体设置高压灭菌进行灭菌。
b.在所有溶液冷却并立即使用前，请勿混合 TB 磷酸盐缓冲液（如下）。

8.10 × TB 磷酸钾缓冲液 (1 L)
试剂最终浓度数量
KH 2 PO 4 （一元，无水）0.17米23.1克
K 2 HPO 4 （二元，无水）0.72M125.4克
水分子_不适用至 1 升
全部的不适用1升
a.为磷酸钾盐提供的质量是针对无水制剂的。可以使用这些盐的水合物形式，但必须调整质量以维持指定的摩尔浓度。
b.通过液体设置高压灭菌进行灭菌。
c.在所有溶液灭菌并冷却至室温之前以及使用前，请勿将 TB 磷酸盐缓冲液与 1.1 × TB 培养基混合。

9.氨苄青霉素原液 (10 mL)
试剂最终浓度数量
氨苄西林100毫克/毫升1克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升
a.0.2 μm注射器端过滤器过滤灭菌。
b.以 1 mL 等分试样储存在 -20 °C下。

10.卡那霉素原液 (10 mL)
试剂最终浓度数量
卡那霉素50毫克/毫升0.5克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升
a.0.2 μm注射器端过滤器过滤灭菌。
b.以 1 mL 等分试样储存在 -20 °C下。

11.大观霉素原液 (10 mL)
试剂最终浓度数量
大观霉素100毫克/毫升1克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升
a.0.2 μm注射器端过滤器过滤灭菌。
b.以 1 mL 等分试样储存在 -20 °C下。
注意：不要将壮观霉素与链霉素混淆。这些抗生素不可互换。

12.0.5 M IPTG (10 mL)
试剂最终浓度数量
IPTG0.5M1.19克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升
a.0.2 μm注射器端过滤器过滤灭菌。
b.以 1 mL 等分试样储存在 -20 °C下。

实验室用品

1.1.7 mL Eppendorf 管（例如，VWR，目录号：87003-294）
2.0.6 mL Eppendorf 管（例如，VWR，目录号：89000-010）
3.100 mm 板（例如，VWR，目录号：470210-568）
4.0.5 L 离心瓶（必须适合可用的离心机/转子）
5.500 mL 量筒
6.15 mL 锥形管（例如，VWR，目录号：89126-798）
7.50 mL 锥形管（例如，VWR，目录号：89039-656）
8.14 mL 无菌培养管（例如，VWR，目录号：60818-689）
9.250 mL 带挡板烧瓶（例如，VWR，目录号：89095-266）
10.2.8 L 带挡板的Fernbach烧瓶（例如，VWR，目录号：22877-168）
11.微量移液器吸头 10 μL （例如，VWR，目录号：76323-394 ）
12.微量移液器吸头 200 μL （例如，VWR，目录号：76323-390 ）
13.微量移液器吸头 1,000 μL （例如，VWR，目录号：76323-454 ）
14.0.2 μm注射器端过滤器（例如，VWR，目录号：28145-477 ）
15.10 mL 注射器（例如，VWR，目录号：76124-664）

设备

1.高压灭菌器（任何能够在 121 °C下对液体培养基和培养材料进行灭菌且饱和蒸汽压力为 15 PSI 的设备）
2.表达设备：
a.用于生长 LB/琼脂板的静态培养箱（设置为 37 °C ）（例如，VWR，目录号： 97025-630)
b.用于培养液体培养物的摇床培养箱（例如，New Brunswick I26R，Eppendorf，目录号： M1324-0004)
我。摇床应能够以 200 – 250 rpm 的速度旋转
二.低于室温 (< 25 °C )的表达需要冷藏
三.摇床甲板应配有夹子以固定 250 mL 和 2.8 L Fernbach烧瓶
c.光密度 600 nm 分光光度计（例如， Ultrospec 10，Biochrome，目录号： 80-2116-30)
3.感受态细胞的制备和细胞收获
a.离心机速度至少为 5,000 × g并能够容纳与培养物大小相称的体积（例如，Beckman Coulter，型号：Allegra 25R）
b.离心瓶能够承受离心力并容纳用于收获细胞的培养物体积。瓶子的类型取决于所使用的离心机和转子
c.冷冻柜 (-80 °C )，如果在纯化蛋白质之前储存细胞（例如，VIP ECO ULT 冷冻柜、VWR，目录号： 76305-596）
4.电穿孔器（例如，Eppendorf Eporator ，Fisher Scientific ，目录号： E4309000027）
5.0.1 cm 电比色皿（例如，Bio-Rad，目录号： 1652089）
6.荧光计能够读取sfGFP荧光（激发 488 nm/发射 512 nm）。手持式荧光计非常适合常规荧光读数（例如，Turner Biosystems，型号： PicoFluor ）
7.-20 °C冰箱用于储存质粒和抗生素（例如，Fisher Scientific ，目录号： 10-549-264）
8.制冰机（例如，Fisher Scientific ，目录号： 09-540-003）

程序

在 A 部分中，您首先要准备电感受态 BL21(DE3) Δ serC细胞，然后在 B 部分中表达蛋白质。这些电感受态细胞需要高效才能成功表达（请参阅故障排除 2）。下面概述的过程足以产生足够的电感受态细胞，用于约 20-30 次转化和表达。

A.电感受态 BL21(DE3) Δ serC细胞的制备

1.第一天
a.准备LB/琼脂板（不含抗生素）并冷却至室温凝固。
b.取自冷冻甘油储备液的一小团细胞中的BL21(DE3) Δ serC细胞划线到 LB/琼脂板上。
c.将带有划线细胞的 LB/琼脂板倒置在 37 °C 静态培养箱中，培养过夜（14-20 小时）。
2.第二天
a.过夜生长后，将装有 BL21(DE3) Δ serC细胞的 LB/琼脂板放入冰箱中直至一天结束。
b.Fernbach烧瓶中准备并高压灭菌 1 L 2 × YT 介质。
c.准备 1 L 10% (v/v) 甘油并通过高压灭菌以及以下各项进行灭菌：
我。 500 mL 量筒。
二. 2 × 0.5 L 离心瓶（或适合在 4 , 000 × g下离心 1 L 培养物的瓶子）。在高压灭菌之前，应彻底清洁离心瓶，以去除任何可能污染电感受态细胞的残留 DNA 或细胞。
三. 1,000、100 和 10 μL移液器吸头各一盒。
四.大约五十个 0.6 mL Eppendorf 管。
d.高压灭菌后，将 10% (v/v) 甘油溶液放入冰箱或冷藏室中冷却过夜。
e.一天结束时，将 5 mL 的 2 × YT 培养基添加到 14 mL 培养管中，并接种前一天晚上在 LB/琼脂板上生长的BL21(DE3) Δ serC细胞的单菌落。在 37°C 下培养液体培养物过夜，并以 250 rpm 的速度摇动。
3.第三天
a.接种 1 L 2 × YT 介质（在 2.8 L 带挡板的Fernbach烧瓶中）。
将 ~5–6 滴消泡剂添加到培养瓶中。烧瓶挡板引起的培养基过度发泡会抑制空气交换，导致细胞生长减慢。
b.在 37°C 下培养 1 L 培养物，并以 200–250 rpm 的转速摇动，直至 OD 600 ~0.4。这大约需要 2-3 小时。不要让培养物生长超过 OD 600 ~0.5。最好在接种后约 1.5 小时检查 OD 600 ，以验证细胞是否正在生长。
c.当细胞生长时，将离心机和转子预冷至 4°C，并将离心瓶和量筒放入冰箱中冷却。
d.一旦细胞达到 OD 600 ~0.4，立即将培养瓶放入冰/水浴中 15 分钟。偶尔混合培养物以确保有效冷却。
注意：从现在开始，工作要迅速，并始终保持细胞冰冷。如有必要，切勿让细胞升温并在寒冷的房间中工作。保持无菌。
e.将冷冻培养物倒入两个灭菌的 0.5 L 离心瓶中，并以 4,000 ×离心细胞 g在 4°C 下保持 15 分钟。
f.倒出上清液，不要扰乱细胞沉淀。如有必要，擦拭离心瓶边缘周围残留的培养基上清液。立即将装有细胞沉淀的离心瓶置于冰上。
g.通过在冰上轻轻旋转，用各 250 mL 冰冷的 10% (v/v) 甘油溶液（可以用无菌量筒测量）重悬每个细胞沉淀。对待细胞要轻柔，不要涡旋。始终保持细胞低温。
h.将细胞均匀重悬于 10% (v/v) 甘油后，合并至 1 个 0.5 L 离心瓶中，并再次以 4,000 ×离心 G 4 °C下 15 分钟。
i.离心后，倒出上清液，不要扰动细胞沉淀。将装有细胞沉淀的离心瓶置于冰上。
j.在同一预冷的量筒中测量 250 mL 10% (v/v) 冰冷甘油。通过在冰上轻轻旋转，用 250 mL 冰冷的甘油溶液重悬细胞沉淀。再次强调，在重悬过程中，请勿涡旋并始终保持细胞和离心瓶低温。
k.将细胞均匀重悬于 10% (v/v) 甘油后，再次以 4,000 ×离心 g在 4°C 下保持 15 分钟。
l.倒出上清液，不要扰乱细胞沉淀。将装有细胞沉淀的离心瓶置于冰上。
m.在冰上轻轻旋转，用 30 mL 冰冷的甘油溶液重悬细胞沉淀。再次强调，在重悬过程中，请勿涡旋并始终保持细胞和离心瓶低温。将重悬的细胞转移至无菌 50 mL 锥形管中，并用冰冷的 10% (v/v) 甘油将锥形管加满至 50 mL 总体积。
n.再次以 4,000 ×离心 g在 4°C 下保持 15 分钟。
o.在最后一次离心机运行期间，按如下方式准备干冰/乙醇浴：
在小聚苯乙烯泡沫塑料盒、平底锅或盘状容器中，添加干冰颗粒并倒入足够的乙醇（或异丙醇）以覆盖干冰床。将空的 1 mL 移液器吸头架放在干冰床上；移液管架的底部应接触乙醇，但不应浸没，这样当您将 0.6 mL Eppendorf 管放入移液器架时，Eppendorf 管的下半部分悬浮在乙醇浴中，而管帽远高于乙醇。
p.当最后一次离心运行完成时，倒出或吸出上清液。用约 0.3 mL 的 10% (v/v) 甘油轻轻将细胞沉淀重悬至均匀的悬浮液中，然后转移至无菌 15 mL 锥形管中。要重悬细胞，您可以使用配备移液器吸头的 1,000 μL移液器，该移液器末端已用无菌刀片切掉约 3 毫米。切断移液器吸头末端的原因是为了加宽末端的孔，以最大限度地减少细胞上下移液重悬时的剪切力。
q.重悬至均匀的细胞悬液中后，测量 OD 600 。
注意：您需要对细胞进行 ~1:500 稀释以获得准确的 OD 600读数，例如998 μL水+ 2 μL细胞悬浮液。测量这些稀释细胞的 OD 600 ，然后根据稀释因子计算实际细胞悬浮液的OD 600 。例如，如果 1:500 稀释度的 OD 600读数 = 0.5，则细胞悬浮液为 0.5 × 500 = 250。
r.OD 600应在 200 至 300 之间，以达到三重质粒转化和表达的足够能力。如果 OD 600高于 300，则用冷的 10% 甘油稀释细胞，使最终密度介于 200 和 300 之间。如果 OD 600低于 200，则再次离心细胞并重悬于较小体积的 10% 中（ v/v) 甘油，例如，0.1 mL 而不是 0.3 mL，重新测量 OD 600 ，并根据需要调整体积。
s.将约 35 μL细胞悬浮液移入 0.6 mL Eppendorf 管中，并快速将管放入干冰/乙醇浴架中以冷冻细胞。
Eppendorf 管底部应浸入干冰/乙醇浴中，但不要让管盖与乙醇接触；酒精会通过毛细作用进入试管，破坏细胞。
t.细胞冷冻后（在干冰/乙醇浴中约 2 分钟），从浴中取出试管，用 Kimwipe 擦去试管中的乙醇，然后将装有冷冻细胞的试管放入装有干冰的低温冷冻箱中。
u.重复此操作，直至所有细胞均分装并冷冻。将所有等分试样冷冻并放入装有干冰的盒子后，将盒子置于 -80°C 下长期储存。您应该从此过程中获得约 20–30 份感受态细胞。
v.完成后，将干冰/乙醇浴放入通风橱中，使干冰升华。乙醇/异丙醇可以倒入瓶子中重复使用。注意：乙醇/异丙醇会在数小时内释放出 CO 2气体，因此，如果将其倒入瓶子中，请务必将盖子打开/关闭，以便气体逸出，确保瓶子内不会积聚压力。

B.具有位点特异性编码的nhpSer的蛋白质的表达

•每个表达都必须进行新的三重质粒转化。切勿冷冻含有质粒的表达细胞；如果表达细胞与表达质粒一起冷冻，细胞将在正确的抗生素存在下生长，但它们不会表达蛋白质。不要连续转化质粒。
•要在您的实验室中标准化此协议，请首先使用sfGFP运行控制表达式 wt和 sfGFP-150TAG，以验证您是否可以达到参考表达基准（参见下表 1），并确保TAG 位点的nhpSer编码按照模型蛋白的预期发挥作用。下面的协议概述了标准 50 mL 测试表达的协议，用于将nhpSer编码到位置 N150 的sfGFP （即 sfGFP-150TAG）以及野生型sfGFP中。还包括如何扩展至 1 L 表达（通常用于靶蛋白）的指导。
1.第一天：转变
a.准备两块 LB/琼脂板，一块用于sfGFP-wt ，另一块用于 sfGFP-150TAG 表达，抗生素如下：
我。如上所述对 LB/琼脂进行灭菌。高压灭菌后，使其充分冷却以触摸，同时仍保持液体。
二.将 50 mL 的 LB/琼脂倒入无菌 50 mL 锥形管中。添加氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素储备液各35 μL 。充分混合并将约 20–25 mL 倒入每个 100 mm 板中。抗生素的最终工作浓度应为 70 μg /mL 氨苄青霉素（对于pRBC质粒）、35 μg / mL卡那霉素（对于 pERM2-nhpSer 质粒）和 70 μg / mL奇霉素（对于 pCDF-Frb-v1）质粒）。
三.让 LB/琼脂在火焰旁冷却并凝固，板盖微开 30 分钟。
四.相应地标记两个板，例如“ sfGFP -WT”和“sfGFP-150TAG”。
b.将两个 1 mM 电比色皿放在冰上 15 分钟以预冷。
c.将两个 0.6 mL Eppendorf 管放在冰上并贴上标签，例如“ sfGFP -WT”和“sfGFP-150TAG”。
我。向“ sfGFP -WT”管中，添加 2 μL pRBC -sfGFP WT、pERM2-nhpSer 和 pCDF-Frb-v1 质粒（每种质粒约 100–500 ng）。
二.向“ sfGFP -150TAG”管中，添加pRBC-sfGFP-150TAG、pERM2-nhpSer 和 pCDF-Frb-v1 质粒各2 μL 。
三.让管子在冰上冷却 5-10 分钟。
d.解冻两份电感受态 BL21(DE3) Δ serC细胞。用手指的温暖即可快速解冻细胞，但解冻后应立即将管置于冰上。
e.将 30 μL电感受态 BL21(DE3) Δ serC细胞转移至每个装有质粒的试管中，并通过上下移液 2-3 次轻轻混合细胞与质粒。细胞不应出现拉丝状或表现得像“鼻涕”，这表明细胞已裂解。
f.将“ sfGFP -WT”电感受态细胞/质粒混合物转移到预冷的电比色杯中。用 Kimwipe 擦干金属电极板。轻轻弹动比色皿，确保细胞位于底部并拉伸比色皿的整个宽度。
g.将电比色皿放入电穿孔器中，并根据1 mM 比色皿的仪器说明进行电穿孔（例如，Eppendorf Eporator 的电压为 1,500 V ）。
注意：时间常数应为 4–6 ms。如果发生电弧，则丢弃细胞和比色皿。当 DNA 和/或细胞含有过多的盐时，就会发生电弧。用等体积的冷 MQ 水稀释新鲜的细胞/质粒混合物，重新尝试电穿孔。
h.立即将 1 mL 的 SOC 介质添加到电比色皿中并重新悬浮细胞。将细胞转移至无菌 1.7 mL Eppendorf 管中。
i.对“sfGFP-150TAG”电感受态细胞/质粒混合物重复步骤 f–h。
j.将两个 Eppendorf 管放入摇床（250 rpm）中，并在 37°C 下恢复细胞 90 分钟。
注意：如果使用后立即清洗，电比色皿可重复使用至少 10 次。当细胞恢复时，按如下方式清洗比色皿：
我。 MQ H 2 O。
二. 0.1 M HCl（稀酸有助于分解比色皿中残留的 DNA）。
三. MQ H 2 O。
四. 70% (v/v) 乙醇。
v. 将其倒置在 Kimwipe 上晾干。干燥后，盖上盖子保存以保持无菌。
k.sfGFP -WT”恢复培养物中的所有细胞铺到标有“ sfGFP -WT”的 LB/agar/Amp/Kan/Spec 板上。
为了铺板所有转化的细胞，您不能将整个 1 mL 恢复培养物放在琼脂板上，因为液体太多并且无法正常干燥。相反，通过 3,000 ×离心沉淀细胞 G 3分钟。取出顶部 900 μL介质，并轻轻地将沉淀重新悬浮在剩余的约 100 μL中。将这种细胞悬液均匀地铺在琼脂平板上。
l.对“sfGFP-150TAG”培养物重复电镀过程。
m.让板在盖子部分打开的情况下在火焰附近干燥约 20 分钟（保持无菌），然后在 37°C 下将板倒置孵育过夜（约 16 小时）。
2.第二天：表达
•该方案是特意编写的，以避免过夜液体发酵剂培养物达到稳定期。相反，有一天，您将在早上使用琼脂板上新鲜生长的菌落来培养起始液体培养物，然后在下午早些时候接种表达培养物。当天结束时，培养物将被诱导并在接下来的 20-24 小时内表达。每个 LB/琼脂板上必须有大量 (> 500) 的菌落才能执行这一一日表达方案。
•液体培养物必须含有 70 μg / mL 氨苄青霉素、35 μg /mL 卡那霉素和 70 μg / mL奇霉素。
•重要提示：带挡板的培养瓶对于确保表达培养物充分通气至关重要。
a.从 37°C 培养箱中取出 LB/琼脂板。应该有数百或数千个菌落（成功的三重质粒转化的例子如图 3 所示）。

pRBC-sfGFP WT（左）或 pRBC-sfGFP-150TAG（右）与 pERM2-nhpSer 和 pCDF-Frb-v1 质粒三重质粒共转化并在 37 °C下生长过夜后的代表性 LB/琼脂平板〜18小时）。由于 BL21(DE3) 细胞中 T7 表达系统的渗漏表达，左侧的 sfGFP -WT 板发出荧光。注意集落大小的均匀性，并且pRBC-sfGFP WT 板上的所有集落均为绿色， pRBC-sfGFP 150TAG板上没有出现绿色集落。

b.准备发酵剂
我。起始培养物在上述定义的起始培养基（2 × YT + 0.5% (v/v) 甘油）中生长，抗生素和浓度与 LB/琼脂板中使用的抗生素和浓度相同。
二.对于小规模（例如，50 mL） sfGFP控制表达，通过将 5 mL 起始培养基（含氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素抗生素）添加到 14 mL 无菌培养管中来制备两种起始培养物。
三.为了接种这些 5 mL 培养物，用无菌移液器吸头从过夜的 LB/琼脂板上刮下由几十到数百个菌落组成的细胞“球”，将球抖落到培养基中，并通过轻轻移液将其分开。应将足够的细胞转移至 5 mL 起始培养物中，使其在接种时明显浑浊。
四.对于更大规模的表达（例如，> 1 L），在带挡板的 250 mL 培养瓶中准备 50 mL 的起始培养基（含抗生素）。将 5 mL 的起始培养基转移到含有转化细胞的 LB/琼脂板上。用无菌玻璃涂抹器轻轻刮擦所有菌落，将其重新悬浮到液体培养基中。将含有悬浮细胞的培养基转移到含有约 45 mL 起始培养基的 250 mL 带挡板的培养瓶中。添加 1-2 滴消泡剂。
c.在 37°C 下以 250 rpm 摇动培养起始培养物约 3-4 小时，直至 OD 600 > 1。不要过夜生长。
d.当发酵剂培养时，准备表达介质：
我。对于每个 50 mL sfGFP测试表达，将 5 mL（室温）无菌 10 ×磷酸钾缓冲液添加到 250 mL 带挡板的培养瓶中的45 mL 1.1 × TB 介质中。添加抗生素和约 1-2 滴消泡剂。
二.对于 1 L 表达，将 100 mL 无菌 10 ×磷酸钾缓冲液添加到2.8 L 带挡板Fernbach烧瓶中的 900 mL 1.1 × TB 介质中。添加抗生素和约 5-6 滴消泡剂。
e.发酵剂生长约 3-4 小时后，按如下方式接种表达培养基：
我。对于 50 mL 的sfGFP测试表达，将 1 mL sfGFP -WT 起始培养物添加到 50 mL 的 TB 表达介质（在有挡板的 250 mL 培养瓶中）。对 sfGFP-150TAG 起始培养物重复上述步骤。
二.对于 1 L 表达，将 10–20 mL 起始培养物添加到每个含有 1 L TB 表达培养基的带挡板的Fernbach烧瓶中。
f.在 37 °C 下振荡 (200–250 rpm) 培养表达培养物，直至 OD 600 = 1.0。这大约需要 3-5 小时。
g.当培养物达到 OD 600 = 1 时，添加 IPTG 至终浓度 0.5 mM。
我。对于 50 mL 培养物，这相当于 50 μL 0.5 M IPTG 库存溶液。
二.对于 1 L 培养物，这相当于 1 mL 0.5 M IPTG 库存溶液。
h.sfGFP对照表达培养物的温度降低至 30°C 。对于其他目标蛋白，温度可降至低至 20 °C。 Frb生物合成途径在 20 至 30 °C 之间发挥最佳作用。表达温度低于 20 °C 是可能的，但表达时间需要延长，并且总体产量将会降低。不要在高于 30 °C 的温度下表达靶蛋白，因为Frb生物合成途径在高于此温度时不起作用。
i.对于 50 mL 表达培养物，再添加 1-2 滴消泡剂。对于 1 L 配方，再添加 5-6 滴消泡剂。
j.sfGFP的最佳温度为 30 °C）下，继续以 200–250 rpm 的速度摇动培养物 20–24 小时。在此表达期间，培养物的密度 (OD 600 ) 应显着增加（高达 20）。
3.第 3 天：评估表达结果并收获细胞

sfGFP对照蛋白表达分析
诱导后大约 20–24 小时，测量sfGFP和 sfGFP- 150TAG 培养物的 OD 600和荧光使用荧光计。由于sfGFP发色团的形成需要合成全长蛋白质，因此全细胞荧光提供了一种方便的策略来评估sfGFP TAG 密码子抑制的效率，从而评估nhpSer掺入的效率。可以使用任何能够检测sfGFP荧光的荧光计（ex/ em ：488/510 nm）来测量荧光。在荧光测量之前，可能需要在缓冲液中按 1:10 至 1:100 稀释培养物（例如，100 μL培养物 + 1,900 μL PBS 进行 1:20 稀释），以获得荧光计线性范围内的信号。。

测试表达式基准：
一般来说，sfGFP-150TAG 培养物荧光应约为sfGFP野生型培养物的 20%–30%，相当于每升培养物 50–150 mg sfGFP-150nhpSer（表 1）。
OD 600值将根据目标蛋白而变化。 sfGFP表达的正常值范围为 ~10 到 20 。最终 OD 600值低于 5 表明细胞生长不良或因靶蛋白表达而产生毒性。

表 1.基于培养物荧光的sfGFP -WT 和 150TAG 蛋白表达产量的基准
培养物荧光#每升培养物中sfGFP毫克数*外径600
重量绿色荧光蛋白8,030 (6,000–12,000)458 (340–600)10.0 (5–15)
sfGFP 150TAG
（与Frb-v1 通路）2,550 (1,500–3,000)120 (50–150)17.0 (10–20)
#括号中所示的范围被认为是正常的，具体取决于日期和试剂制备。这里报告的荧光值是通过将培养物中的细胞直接稀释到 PBS (1:20) 中，在手持式PicoFluor荧光计 (Turner Biosystems) 上获得的。荧光值是任意的并且取决于所使用的荧光计。重要的是 sfGFP-150TAG 和sfGFP -WT 培养物荧光的相对比率与上述值一致。作为参考，不表达sfGFP 的背景培养物的自发荧光值为 ~150–250。
sfGFP的荧光标准曲线确定sfGFP的产量（毫克/升）。

收获细胞：
× g离心15 分钟收获细胞。倒出培养上清液并将细胞重悬于适当的缓冲液中。
•缓冲液的选择取决于目标蛋白、下游纯化策略和应用，并且应由用户决定。
•在此缓冲液中添加冷冻保护剂[例如，10% (v/v) 甘油]可以帮助最大限度地减少与冷冻敏感或不稳定蛋白质相关的不利影响。细胞可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C，或者您可以继续纯化。
•对于通过 TALON 树脂纯化 His 6 标签蛋白，推荐的重悬/裂解缓冲液为 50 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl、10% (v/v) 甘油、5 mM咪唑。由于nhpSer不被磷酸酶水解，因此不需要磷酸酶抑制剂。

协议验证

对于每个表达，重要的是确认nhpSer忠实地掺入目标蛋白中。可以使用多种方法来评估靶蛋白的磷酸化状态。
1.Phos-tag 电泳：Phos-tag 凝胶电泳是 SDS-PAGE 的改进形式，其中与非磷酸化蛋白质相比，磷酸化蛋白质的电泳迁移率减弱。蛋白质迁移减弱的程度随着磷酰基的连续添加而增加，允许人们区分不含、单和多pSer的蛋白质 (Kinoshita 等人，2006）。偶然的是，具有nhpSer 的蛋白质在 Phos-tag 电泳上比具有真实pSer的相同蛋白质迁移得更慢，从而可以轻松区分两者 [例如，请参见（Zhu et al., 2023）以及下面的图 4]。通过测量非磷酸化、 pSer和nhpSer蛋白条带的密度，可以估计包含nhpSer的表达/纯化蛋白的百分比。需要注意的是，野生型（非磷酸化）蛋白质必须与磷酸化蛋白质并排运行，以观察电泳迁移率的相对变化。同样，用pSer表达您的靶蛋白也很有帮助，这样您就可以确认包含nhpSer的蛋白质的电泳位移是否是由于nhpSer编码而不是pSer [请参阅我们之前使用pSer表达蛋白质的方案：(朱等人，2022）]。 Phos-tag 电泳的其他优点包括能够同时评估多个样品、仅需要标准 SDS-PAGE 电泳装置并且经济。请勿在 Phos-tag 凝胶上运行分子量标记，因为它们通常含有与 Phos-tag 不兼容的 EDTA。有关包含sfGFP的nhpSer和pSer的 SDS-PAGE 和 Phos-tag 凝胶的示例，请参见下面的图 4 。
注意： Phos-tag 凝胶中sfGFP-150pser/ nhpSer蛋白的电泳迁移率减弱特别明显且易于辨别；然而，其他磷酸化蛋白质比非磷酸化蛋白质迁移慢的程度取决于蛋白质和编码位点。如果您没有看到磷酸化和非磷酸化蛋白质之间令人信服的电泳变化，请考虑优化 Phos-tag 电泳程序以提高分辨率，方法是 (i) 将 Phos-tag 丙烯酰胺试剂的浓度从25或50 μM增加到100 μ M或更高，(ii) 减少较窄条带的蛋白质上样量，并提高类似迁移蛋白质条带之间的分辨率，(iii) 降低总丙烯酰胺浓度 [例如，从 15% 至 10% (w/v)丙烯酰胺] 使目标蛋白条带至少穿过凝胶的一半，从而提高分离度，并且 (iv) 将sfGFP WT/150nhpSer 对照蛋白与感兴趣的蛋白一起运行，以确保 Phos-tag 凝胶正确运行。如果在 Phos-tag 电泳中仍未观察到变化，则必须通过质谱法确认掺入（见下文）。

图 4. 通过 Phos-tag 凝胶电泳评估nhpSer编码为sfGFP 。纯化的 WT sfGFP 、sfGFP-150pSer 和 sfGFP-150nhpSer 蛋白的 SDS-PAGE（顶部）和 Phos-tag（底部）凝胶。 sfGFP-150pSer 蛋白是按照我们之前的方案（Zhu 等人，2022），并且 sfGFP-150nhpSer 蛋白是使用此处描述的协议产生的。由于它们在 Phos-tag 凝胶上的迁移不同，因此非磷酸化、含pSer和含nhpSer的蛋白质可以相互解析，并且可以轻松评估每个样品中每种形式的分数。在此示例中，sfGFP-150pSer 蛋白样品被pSer磷酸化 > 90% ，只有痕量的非磷酸化蛋白与野生型sfGFP蛋白迁移相同，而 sfGFP-150nhpSer 蛋白被 pSer 磷酸化 > 95% nhpSer ，仅含有微量的含pSer的污染蛋白，并且没有可检测到的非磷酸化蛋白。请注意，所有蛋白质在 SDS-PAGE 上的迁移都是相同的，这表明在 Phos-tag 中观察到的电泳变化是由于磷酸化状态而不是蛋白质大小的差异造成的。这些样品在上样到凝胶上之前在标准Laemmli缓冲液中于 95 °C孵育5 分钟。 Phos-tag 凝胶含有 50 μM Phos-tag 丙烯酰胺、100 μM MnCl 2和29:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例，并在室温下 120 V 运行 1.5 小时。

2.如果设施可用且目标蛋白适合全蛋白质谱分析，则全蛋白质谱 ( MS) 是确认nhpSer编码最令人信服的方法。请注意，某些质谱仪可能没有足够的分辨率来区分带有pSer和nhpSer的整个蛋白质的质量( Δ = 1.98 Da)，在这种情况下，进行 Phos 标签电泳或胰蛋白酶消化，然后进行 MS/MS 裂解（即自下而上）分析）可以使用。有关区分sfGFP与pSer和nhpSer的高分辨率全蛋白 MS 数据的示例，请参见 Zhu 中的图 3 等人。（2023）。在分析sfGFP蛋白的全蛋白 MS 数据时，请务必考虑发色团成熟，这会导致水分子和两个质子的损失；因此，质量将比氨基酸序列预测的质量小 20 Da。
重要提示：胰蛋白酶消化后进行nhpSer蛋白的 MS 碎片分析（即“自下而上”MS/MS 分析）对于确认nhpSer掺入和掺入位点非常有用，但不应用于得出有关 nhpSer 掺入的结论nhpSer编码程度。
3.蛋白质印迹：多种抗体可用于通过蛋白质印迹检测特定的含pSer的蛋白质。我们尚未测试此类pSer特异性抗体是否也与含有nhpSer 的相同蛋白质发生交叉反应，但预计这取决于蛋白质、磷酸化位点和抗体。请注意，虽然使用磷酸化敏感抗体进行蛋白质印迹可能有助于确认靶蛋白磷酸化，但如果不沿着同质磷酸化蛋白标准品的标准曲线运行，则不能用于评估磷酸化程度。或者，可以通过蛋白质印迹对 Phos-tag 凝胶进行成像，以评估其他蛋白质混合物中含有野生型、 pSer和nhpSer的目标蛋白质的程度[例如，参见 Zhu 中的支持信息图 S26 等人。（2023）]。在这些情况下，无论蛋白质磷酸化状态如何，使用与其表位结合的抗体都很重要（例如，FLAG 或 MYC 标签）。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

1.截断。与大多数标准大肠杆菌表达宿主一样，BL21(DE3) Δ serC菌株含有释放因子-1 (RF1)，该蛋白质负责终止 TAG 密码子的翻译。因此， TAG密码子处的nhpSer编码与RF1持续竞争，因此将产生包含nhpSer的全长蛋白质和过早截短的蛋白质的混合物。在设计目标蛋白的表达结构时记住这一点很重要。附加 C 端纯化标签可确保仅纯化全长蛋白质，但并非所有带有 C 端标签的蛋白质都能良好表达。如果使用 N 端纯化标签，截短的蛋白质可能会与全长蛋白质共同纯化，并且可能是主要的纯化蛋白质种类。在这些情况下，您将需要制定额外的策略来分离截短的蛋白质。请注意，如果目标蛋白是同源寡聚物，当编码位点位于寡聚结构域的 C 端时，截短的蛋白质可能很难或不可能纯化掉，因为截短的和全长的蛋白质都会寡聚并共纯化无论纯化标签放置在何处。
2.用于表达目标蛋白的兼容质粒。在此协议中，细胞中必须存在三个质粒才能将nhpSer编码为目标蛋白。为了在大肠杆菌中忠实地维持多个质粒，每个质粒必须具有来自不同相容性组的复制起点，并赋予不同的抗生素抗性。我们设计了pRBC载体（氨苄青霉素抗性，p15a 复制起点），以满足与 nhpSer机械载体（pERM2-nhpSer，具有pUC复制起点的卡那霉素抗性）和nhpSer生物合成途径载体（pERM2-nhpSer，卡那霉素抗性）一起繁殖时的这些要求。 pCDF-Frb-v1，奇霉素抗性与CloDF复制起点）。需要注意的是，由于 pERM2-nhpSer 载体具有pUC复制起点，因此您不能使用传统的pET 、 pGEX或pBAD样载体来表达目标蛋白，因为这些载体具有来自同一兼容性组的复制起点作为 pERM2-nhpSer 载体（ pUC复制起点是 pBR322/pMB1 起点的衍生物，因此位于相同的兼容性组中）。 pRBC载体还经过工程设计，与已建立的pSer GCE 编码系统兼容，该系统使用 pKW2-EFSep 机械质粒（氯霉素抗性和 pBR322 复制起点），能够灵活地使用相同的 pRBC 载体编码pSer或nhpSer ，具体取决于关于下游应用。如果您希望使用pRBC以外的载体来表达带有pSer或nhpSer的目标蛋白，请确保它具有 p15a 或 RSF 复制起点，并且它具有对卡那霉素、大观霉素和氯霉素以外的抗生素的抗性（例如、氨苄西林、四环素）。

故障排除

1.构造设计。即使您的 sfGFP-150TAG 对照运行良好并且等效的野生型目标蛋白构建体以高产量表达，但在编码nhpSer （或pSer ）时目标蛋白可能无法表达的原因有多种。在这些情况下，重要的是要考虑磷酸化是翻译后修饰，而对于 GCE 系统，磷酸氨基酸是在翻译过程中安装的，因此我们需要目标蛋白与存在的磷酸氨基酸正确折叠，并且同时与任何潜在的相互作用/稳定伙伴蛋白分离。因此，即使使用高效的pSer / nhpSer GCE 系统将磷酸氨基酸编码为表现良好、高表达和可溶的天然蛋白质，也可能会遇到难以预料的挑战，需要巧妙的策略来诱导磷酸化氨基酸的靶向蛋白稳定高效表达。改善磷蛋白表达、折叠和稳定性的策略包括( i )将可溶性标签融合至靶蛋白的N-和/或C-末端(例如SUMO、GST、MBP)，(ii)共表达折叠伴侣蛋白质（例如， GroEL /ES、触发因子），以及 (iii) 共表达结合伴侣蛋白（如果已知）。同样，将可裂解的荧光报告蛋白（例如超级文件夹 GFP）融合到目标蛋白的 C 末端，可提供一种方便的策略，通过测量细胞荧光来筛选最佳表达条件。在这种情况下，只有当nhpSer被编码并产生全长目标蛋白时，才会继续翻译成sfGFP ，导致细胞发出荧光。在目标蛋白和sfGFP之间包含一个切割位点（例如，TEV、3C），如果sfGFP干扰功能或下游应用，则可以将其去除。
2.转变。该方案要求每次表达时将三个质粒同时转化到大肠杆菌细胞中，并且其效率使您能够获得足够的细胞来接种起始培养物，每天只需约 1/2 即可生长到足以满足以下条件的密度：接种表达培养物。如果转化后仅获得几个菌落，则您将没有足够的细胞来接种您的起始培养物，然后该起始培养物将需要很长时间才能生长。发酵剂培养物的一夜之间生长似乎是解决这个问题的明显策略；然而，当起始培养物达到稳定期时，我们观察到nhpSer蛋白的表达较差。如果含有质粒的表达细胞是从冷冻甘油原液中生长的，而不是从新鲜转化的细胞中生长的，则蛋白质也不会表达。如果您的转化效率较低，则可能是由于 ( i ) 电感受态细胞制备不当，(ii) 质粒浓度过低，(iii) 降解、受损或含盐质粒（参见下面的注释）和/或 (iv)电穿孔仪参数不正确。要解决效率低下的根源，请单独转化每个质粒，并在含有单一抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素）的 LB/琼脂平板上进行平板培养。您应该为每个单独的质粒转化获得一个细胞“草坪”。如果其中一个质粒的转化明显比另一个差，则可能存在与该特定质粒相关的完整性问题。如果在所有三个单质粒转化中都获得很少的菌落，则可能是电感受态细胞制备不正确，或者是电转仪无法正常工作。
3.质粒完整性。我们在极少数情况下观察到 pERM2-nhpSer 质粒在大肠杆菌细胞中繁殖时会发生重组，从而使其失去功能。我们建议您在从Addgene收到质粒时以及增殖后对质粒进行测序，以确保完整性。许多公司都可以提供经济的全质粒测序，例如Plasmidsaurus 。还建议对 pCDF-Frb-v1 和 pRBC-sfGFP-150TAG 质粒进行测序，尽管我们尚未观察到这些质粒在 DH10b大肠杆菌细胞中繁殖时存在任何稳定性问题。

致谢

描述和验证该协议的原始研究论文是 Zhu 等人。（2023）。这项工作得到了 GCE4All 生物医学技术开发和传播中心的支持，并得到了国家普通医学科学研究所拨款 RM1-GM144227 的支持。这项工作还得到了美国国立卫生研究院 [5R01GM131168-02 to RAM]、俄勒冈健康科学大学医学研究基金会 [to RBC] 和柯林斯医学信托基金 [to RBC] 的部分支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

本协议中没有描述人类或动物的使用。

参考

Kinoshita, E.、Kinoshita- Kikuta , E.、 Takiyama , K. 和 Koike, T. (2006)。磷酸盐结合标签，可视化磷酸化蛋白质的新工具。摩尔。细胞。蛋白质组学5(4)：749–757。
Rogerson, DT、Sachdeva, A.、Wang, K.、Haq, T.、 Kazlauskaite , A.、Hancock, SM、 Huguenin-Dezot , N.、 Muqit 、MMK、Fry, AM、Bayliss, R. 等。（2015）。磷酸丝氨酸及其不可水解类似物的有效遗传编码。纳特。化学。生物。 11（7）：496-503。
张，MS，布伦纳，SF， Huguenin-Dezot ，N.，梁，AD，施米德，WH，罗杰森，DT和Chin，JW（2017）。通过平行选择和深度测序进行磷酸苏氨酸的生物合成和遗传编码。纳特。方法14(7)：729–736。
Zhu, P.、 Gafken , PR、 Mehl , RA 和 Cooley, RB (2019)。用于生产多重磷酸化蛋白质的高度通用的表达系统。 ACS 化学。生物。 14（7）：1564-1572。
Zhu, P.、 Mehl , R. 和 Cooley, R. (2022)。将磷酸丝氨酸定点掺入大肠杆菌的重组蛋白中。生物协议12(21)：e4541。
Zhu, P.、 Stanishuski , S.、Franklin, R.、Vogel, A.、Vesely, CH、Reardon, P.、 Sluchanko , NN、Beckman, JS、Karplus, PA、 Mehl 、RA 等。（2023）。自主合成功能性永久磷酸化蛋白质，用于定义单体 14-3-3 的相互作用组。 ACS中心。科学。 9（4）：816-835。