材料和试剂

I. RT-PCR

QuantiTect Probe RT-PCR Kit（QIAGEN，目录号：204443）
引物（有义和反义）（Biomers）
分离的RNA
PCR管（Starlab）
无核酸酶水（B Braun）

II。克隆

琼脂糖（Roth，目录号：2267.4）
溴化乙锭（AppliChem）
DNA梯（1kb和100bp）（Life Technologies，Invitrogen ^TM）
Geneclean III试剂盒（Qbiogene，目录号：1001-600）
受体质粒的实例：pcDNA3.1（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：V790-20）
具有反应缓冲液的限制性内切酶（New England Biolabs）
具有反应缓冲液的南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289L）
TaKaRa-DNA-Ligation-Kit version 2.1（TaKaRa，目录号：6022）
Ultracompetent XL2-blue bacteria（Stratagene，目录号：200150）
羧苄青霉素（AppliChem，目录号：A1491）
细菌培养管（Sarstedt）
质粒制备试剂盒（QIAGEN，目录号：27104,12362）
Tris-HCl（pH7.8）
醋酸钠
EDTA
NaCl
KCl
MgCl 2
MgSO 4 4 /
LB介质（见配方）
TAE缓冲区（请参阅配方）
6x loading染料（见配方）
SOC介质（参见配方）
LB琼脂（见配方）

设备

PCR循环仪（Mastercycler gradient 5331，Eppendorf，目录号：5331000.010）
微波炉（阿拉斯加，型号：M 1001）
凝胶电泳室（Perfect Blue电泳系统40-1214，PeqLab）和电源（电源E844，Consort）
UV光盒（UV-透射器）（Vilber）
孵育器（Thermomixer comfort，Eppendorf，目录号：5355000.011;用于细菌细胞培养物的Novotron，Infors HT的37℃振荡器）
Scalpel（B Braun）
Scalpel（B Braun）
细菌培养管（Sarstedt）

程序

根据实验，应该进行细胞质或总RNA的分离。一般来说，细胞质RNA富含缺少所有内含子的剪接的RNA，而总RNA含有未剪接的，部分剪接的和完全剪接的RNA。从哺乳动物细胞分离细胞质RNA的方案可以从生物协议的第一部分"通过定量逆转录酶-PCR分析将逆转录病毒RNA包装到病毒颗粒中"。有义和反义引物应分别在剪接供体的上游和剪接受体序列的下游杂交（图1A）。也有可能一个引物与外显子 - 外显子连接重叠，确保仅与剪接的RNA完全杂交。对于随后的克隆，两个引物应在其5'端含有限制性内切核酸酶的识别位点（通过限制性酶克隆）或与受体质粒相同的序列（通过同源序列克隆）。当有义和反义引物与ORF序列的起始或5'非翻译区和ORF序列的末端或3'非翻译区杂交时，可产生含有基因的完整开放阅读框（ORF）的cDNA区域（图1B）。

使用QuantiTect Probe RT-PCR Kit（QIAGEN）设置RT-PCR反应，如下：

PCR混合物（2x，含有Taq，dNTP和缓冲液）	10微升
反转录酶	0.2μl
引物检测（10μM）	0.4μl
引物反义（10μM）	0.4μl
分离的RNA	0.5至1μg模板RNA至多5μl
加入无核酸酶水至20μl

还要制备一个没有加入逆转录酶（RT）的对照，以控制（基因组或质粒）DNA污染。
当在RT-PCR中获得的cDNA通过限制性酶消化插入受体质粒时，它必须携带所需的限制酶识别位点，其可以加到引物的5'末端。注意，应在引物的识别位点上游添加大约4个额外的随机核苷酸，以允许有效裂解发生。

RT-PCR反应：
注意：QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒（Qiagen）允许RT反应和PCR一次运行而不中断。
RT步骤在50℃30分钟，然后15分钟95℃。随后，通过从95℃30秒，50至60℃开始的30个PCR循环扩增cDNA，取决于引物的解链温度30秒和72℃30秒/500bp扩增子长度。可以在72℃下添加最终延伸步骤长达7分钟，以允许DNA聚合酶延长剩余的单链DNA。保持PCR在4°C，直到琼脂糖凝胶电泳短伸长步骤对于优先检测剪接的与未剪接的/部分剪接的转录物是必要的。有时可能需要进行巢式PCR以预扩增cDNA。使用在第二PCR中扩增的序列周围的引物进行第一次RT-PCR。第二次PCR的引物必须结合在第一次RT-PCR中扩增的片段。直接来自第一次RT-PCR（无任何纯化）的1微升应足够作为第二次PCR的模板。然而，第一扩增子也可以通过PCR纯化试剂盒纯化，并且每20μl反应高达200ng的DNA可以用作第二PCR的模板，其可以用QuantiTect Probe RT-PCR试剂盒进行，省略RT步骤，并在95℃下开始15分钟
在含有溴化乙锭的TAE缓冲液中制备1.5％琼脂糖凝胶（见配方）
加入4μl的6x负载染料到20μlPCR反应，并将溶液转移到琼脂糖凝胶
在100至120V（5至6V/cm电极间距离）下进行琼脂糖凝胶电泳约30分钟。平行分析DNA梯度以能够确定DNA片段大小。请注意，溴化乙锭分子带正电荷，并在琼脂糖凝胶中作为DNA分子以相反的方向移动。当加载染料带达到琼脂糖凝胶的中间时分析凝胶（见图1D）
将结果记录在UV灯凝胶文档系统下。插入的溴化乙锭允许检测扩增的cDNA片段（图1D）。由于紫外光可以损害DNA，将曝光时间降至最低。
用干净的手术刀在UV台上切出含有所需DNA片段的小凝胶片。请佩戴实验室安全眼镜，并将对紫外线的暴露时间降至最低
用Geneclean III试剂盒从凝胶片中提取DNA。用10μl无核酸酶的水从玻璃珠中洗脱DNA
准备限制酶消化分离的cDNA（全部10μl）和约3μg受体质粒DNA平行进行：

DNA溶液
10微升

限制缓冲区（10x）
2微升

牛血清白蛋白溶液（10x）
2微升

限制酶（20U /μl）
1微升

加水至20μl

在37°C孵育1至3小时。当使用多于一种限制酶时或当使用具有星号活性的限制性酶时，请将反应体积增加至30μl。酶不应构成超过反应体积的10％（v/v）。星形活性也可以通过减少消化时间来减少。然而，完全消化对于成功连接和转化是关键的。延长孵育时间直至过夜只能使用没有星号活性或增加反应体积（高达50微升）的限制性酶。
当在消化期间（例如通过仅使用一种限制性酶）产生相容的粘性末端时，线性化的受体质粒必须去磷酸化以防止自连接。限制酶消化后，将南极磷酸酶及其缓冲液直接加入到反应混合物中。在37℃下30分钟后，通过在65℃下孵育5分钟使酶失活，随后进行琼脂糖凝胶电泳。
为了在哺乳动物细胞中瞬时表达基因，质粒pcDNA3.1（Life Technologies，Invitrogen ）（http://tools.invitrogen.com/content/sfs/vectors/pcdna3.1+.pdf ）可以用作受体质粒。由于立即早期巨细胞病毒（CMV）增强子/启动子和牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化序列，其允许高表达水平。来自RT-PCR的cDNA必须插入多克隆位点。此外，应当在开放阅读框的起始密码子周围添加有效的Kozak序列（A/GCCATGG），其可以在RT-PCR期间实施到有义引物中。
用消化的DNA重复步骤3至8。切出仅含有线性化受体质粒的小凝胶切片。与环状质粒DNA的污染将导致原始质粒的有效重新转化，并且强烈降低携带含有插入片段的质粒的细菌菌落的量。
混合2微升消化和纯化插入，3微升消化和纯化的受体质粒DNA和5微升的Takara连接试剂盒的溶液I.在16℃孵育过夜。或者，可以测量DNA浓度，并且可以使用载体：Insert DNA比率为0.03pmol：0.03-0.3pmol用于连接（来自TaKaRa-DNA-Ligation-Kit版本2.1的制造商的说明书）。
用于转化DNA和随后在细菌中扩增质粒的详细方案可以在生物方案"标准DNA克隆"（He，2011b）和"Plasmid DNA Extraction from E.coli Using Alkaline裂解法"（He，2011a）（请生成超链接）。
简而言之，必须执行以下步骤：
通过热休克转化超感官XL-2细菌与1.5μl连接反应
使转化的细菌在37℃下在没有抗生素的SOC培养基中生长1小时
在含有适当抗生素的LB琼脂平板上在30至37℃下培养细菌过夜
挑选单个菌落，并使其在30至37℃下在含有适当抗生素的3至6ml LB培养基中生长过夜。
从1.5至3ml的细菌培养物中提取质粒DNA。保持其余的文化在4℃
用适当的限制酶消化质粒DNA以鉴定含有成功产生的质粒的细菌菌落。此外，对那些显示出适合的限制酶消化模式的质粒进行测序。该测序反应允许鉴定实际产生检测和克隆的RNA的剪接事件
从含有成功产生的质粒的鉴定的细菌菌落制备Midi，Maxi或Giga质粒制备物。不含内毒素的质粒制备试剂盒避免在用于转染或治疗动物的质粒DNA溶液中存在脂多糖。

图1.用于检测和克隆剪接的RNA的RT-PCR方法的原理 A.正义和反义引物（水平箭头）在由剪接供体融合产生的外显子 - 外显子边界附近杂交1（SD1）和剪接受体1（SA1）序列。限制酶识别位点（RE1和RE2，垂直箭头）存在于质粒DNA中和从部分剪接的RNA产生的RT-PCR扩增的DNA中，其可用于将PCR片段插入质粒中。 B.有义和反义引物（水平箭头）在其5'端含有限制性酶识别位点（RE1和RE2，垂直箭头）。它们在5'和5'杂交 3'非翻译区（UTR）。通过RT-PCR扩增完全剪接的RNA允许使用限制酶1和2将DNA插入到质粒（例如pcDNA3.1）中。C.描述的是用于转染HEK293T细胞的质粒和其成绩单。通过SD1和SA5之间的剪接或在SD4和SA7之间的另外的剪接事件之后产生的RNA被重新插入V H基因组中，产生质粒V H H env或V sup H nef（Grewe等人，2012）。显示了使用含有正向引物和反义引物1或引物1的引物组1，从转染有质粒V H基因组的细胞分离的RNA中RT-PCR扩增剪接的RNA后获得的琼脂糖凝胶电泳结果包含正向引物和反义引物2的集合2（参见C中的水平箭头）（Grewe等人，2012）。 SD1-SA5或SD1-SA5，SD4-SA7表示cDNA测序后检测到的剪接事件。
UTR，非翻译区; RE，限制性酶识别位点;白色条，内含子;深灰色条，开放阅读框; polyA，聚腺苷酸化信号; SD，剪接供体; SA，剪接受体;水平箭头，引物;垂直箭头，限制性酶识别位点的位置;黑点，RNA 5'CAP;黑色椭圆形; 3'聚腺苷酸尾; LTR，慢病毒长末端重复序列; CMV，巨细胞病毒立即早期增强子/启动子; GFP，绿色荧光蛋白。

食谱

1x TAE缓冲区
40mM Tris-HCl（pH7.8）
5mM乙酸钠 1mM EDTA
琼脂糖
1.5％（w/v）琼脂糖的1x TAE缓冲液中在微波炉中煮1分钟，仔细摇匀
加入0.7μg/ml溴化乙锭[ 在溶液冷却后仍然是液体并小心摇动，然后加入7μl的1％溴化乙锭溶液（10mg/ml）/100ml]。
6x装载染料
30mM Tris-HCl（pH7.6） 1mM EDTA
35％（v/v）甘油
0.35％（w/v）溴酚蓝
SOC介质
2％（w/v）胰蛋白胨
0.5％（w/v）酵母提取物
20mM葡萄糖 10mM NaCl 2.5mM KCl
10mM MgCl 2/
10mM MgSO 4 通过高压灭菌消毒。
LB琼脂
1.5％（w/v）Bacto-Agar 在LB-中
通过高压灭菌消毒。
LB培养基
1％（w/v）胰蛋白胨
0.5％（w/v）酵母提取物
171 mM NaCl pH 7.4
通过高压灭菌消毒。

致谢

该方案改编自我们的论文Grewe等人。（2012）。这项工作是由德国研究基金会（DFG）授予KlausÜberla（Ue45/11-1）资助的。 Bianca Hoffmann和Bastian Grewe得到了DFG研究生院（GRK 1045）的支持。在Bianca Hoffmann和Bastian Grewe，Katrin Ehrhardt，Maik Blissenbach，Sabine Brandt，KlausÜberla，Alexander Stang，Thomas Grunwald，Klaus Sure和Bettina Tippler之外，他们都是团队的成员。

参考文献

Grewe，B.，Ehrhardt，K.，Hoffmann，B.，Blissenbach，M.，Brandt，S.和Uberla，K。（2012）。 HIV-1 Rev蛋白增强未剪接和剪接的含有RRE的慢病毒载体RNA的衣壳化， a>。 PloS One 7（11），e48688。

他（2011a）。从 E的质粒DNA提取。大肠杆菌使用碱裂解法。生物协议 1（3）：e30。

他（2011b）。标准DNA克隆。生物协议 1（7）：e52