材料与试剂

动物

动物饲养是按照伊朗德黑兰谢法神经科学研究中心的指导方针进行的。使用2至3个月大的年轻成年雄性Wistar大鼠（180-230克）和20至24个月大的老年大鼠（400-450克）。

一般材料

1.氯胺酮（ alfasan ，目录号： 36408/3000 ）
2.甲苯噻嗪（ alfasan ，目录号： 36408/3007）
3.玻璃培养皿（Nest Biotechnology，目录号：704001）
4.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（片剂）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：18912014）
5.0.2、0.5 和 1.5 mL Eppendorf 管（Nest Biotechnology，目录号：613111）
6.6、12、24、48和96贴壁孔板（已处理）（ JetBiofil ，目录号：TCP011096、TCP011012、TCP011048）
7.非粘附孔板：6 个孔（Falcon，目录号： 353046）和 12 个孔（Falcon，目录号：351143）
8.粘附T - 25 烧瓶（ JetBiofil ，目录号：TCF012050）
9.非粘附 T-25 烧瓶（ JetBiofil ，目录号：TCF012600)
10.0.2 μm 过滤器（PES 膜）（ BioFil ，目录号：FMC 2011018）
11.封口膜（Sigma，目录号：P7793）
12.96% 乙醇（Merck，目录号： 100971）
13.70 μm 细胞过滤器（BD Falcon，目录号：352340）
14.培养皿培养（ JetBiofil ，德国，MCD000035 ）
15.15 和 50 mL Falcon 管（ JetBiofil ，目录号： CFT011500）
16.移液器吸头蓝色 1,000 μL（通用，目录号： 2451-1K0 ）、黄色 100 μL（通用，目录号： 200-B-YL ）和 10 μL （ Labcon Eclipse ，目录号： 490007-952）

试剂

1.0.05% 胰蛋白酶/EDTA（ Biowest ，目录号：L0931-100）
2.消化酶和材料：
a.木瓜蛋白酶（罗氏，目录号： 108014）
b.分散酶（Gibco，目录号：17105-041）
c.DNase（罗氏，目录号：11284932001）
d.Accutase （Sigma，目录号：A6964）
e.L-半胱氨酸（Sigma，目录号：52904）
f.EDTA（Sigma，目录号：17892）
3.Hanks平衡盐溶液（HBSS）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：24020117）
4.胎牛血清（FBS）（ Thermo Fisher Scientific， Gibco TM ，目录号：10270106）
5.台盼蓝溶液0.4%（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
6.4% 多聚甲醛（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
7.Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
8.牛血清白蛋白（BSA）（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
9.正常山羊血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：50197Z）
10.小鼠抗巢蛋白（Merck Millipore，目录号：MAB 353）
11.兔抗 Sox2（Santa Cruz，目录号：SC20088）
12.小鼠抗 GFAP（Sigma，目录号：G3893）
13.山羊抗兔 IgG（Abcam，目录号：ab9717）
14.山羊抗小鼠（Abcam，目录号：ab6785）
15.4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：62248）

涂层

1.层粘连蛋白（Sigma，目录号：L2020）
2.聚-L-鸟氨酸溶液（Sigma，目录号：P4957）

培养基（参见食谱）

1.Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/F12（ Gibco，目录号： 11320033 ）
2.N2补充剂（Gibco，目录号：17501），用于神经母细胞瘤和中枢神经系统原代细胞的无血清培养条件。它由维生素、激素、胰岛素和转铁蛋白组成。这些成分维持神经干细胞处于未分化状态，并支持无血清培养物中细胞的增殖
3.B27 补充剂（Gibco，目录号：12513-010），一种抗氧化剂、维生素和蛋白质混合物的补充剂，可减少活性氧损伤并促进神经干细胞的长期存活。它是一种广泛用于无血清培养条件的补充剂。因此，该补充剂含有维持培养物健康和减少变异性所必需的特定成分
4.肝素（Sigma，目录号：H3149）
5.青霉素/链霉素（青霉素/链霉素）（Sigma，目录号： P4333）
6.两性霉素 B（ Biowest ，目录号： L0009-050)
7.Glutamax （Gibco，目录号：35050-061）
8.碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF ）（Sigma，目录号：F0291）
9.表皮生长因子（EGF）（Sigma，目录号：E4127）

解决方案

1.7 0% 乙醇（参见配方）
2.消化液（无菌，0.2 μm 过滤）（参见配方）
3.封闭液（参见配方）
4.抗体溶液（参见配方）
5.生长培养基（培养基）（参见食谱）
6.涂层溶液（无菌，0.2 μm 过滤）（参见配方）
7.解剖解决方案（参见食谱）
8.氯胺酮 (80 mg/mL) 和赛拉嗪 (10 mg/mL) 工作溶液（参见配方）
9.PBS (1 × )（参见食谱）

食谱

1.70%乙醇
用 135 mL 蒸馏水稀释 365 mL 96% 乙醇，配制成 500 mL 70% 乙醇。

2.消化液（无菌，0.2μm过滤）
将 40 μL分散酶( 2 mg/mL)、80 μL DNase (0.2 mg/mL)、100 μL 木瓜蛋白酶 (0.5 mg/mL)、1 mg L-半胱氨酸和 100 μL EDTA 溶解在 2 mL 的DMEM/F12。此体积的溶液适合一只大鼠。
a.木瓜蛋白酶（0.5 mg/mL）的制备：将100 μL木瓜蛋白酶原液（10 mg/mL）加入到1.95 mL DMEM/F12基础培养基中，制备2 mL 0.5 mg/mL木瓜蛋白酶工作液。
b.Dispase (2 mg/mL)的制备：将 100 μL Dispase库存溶液(10 mg/mL) 添加到 1.9 mL DMEM/F12 基础培养基中，制备 2 mL 2 mg/mL Dispase工作液。
c.DNase (0.2 mg/mL) 的制备：将 80 μL DNase 库存溶液 (5 mg/mL) 添加到 1.96 mL PBS (1 × ) 中，制备 2 mL 0.2 mg/mL DNase 工作液。
d.向溶液中添加 1 mg L-半胱氨酸和 100 μL EDTA。

3.封闭液
将 10% 正常山羊血清、1% BSA 和 0.01% Tween 溶解在 PBS (1 × ) 中。要制备 500 µL 封闭液，请将 50 µL 正常山羊血清、5 µL BSA 和 0.5 µL Tween 添加到 444.5 µL PBS (1×) 中。

4.抗体溶液
在封闭液中稀释一抗：
a.要制备 350 μL 1:200 抗巢蛋白溶液，请将 1.75 μL巢蛋白抗体添加到 348 μL 封闭溶液中。使用前准备。
b.要制备 350 μL 1:100 Sox2 溶液，请将 3.5 μL Sox2 抗体添加到 346.5 μL封闭溶液中。使用前准备。
c.要制备 250 μL 1:250 GFAP 溶液，请将 1 μL GFAP 抗体添加到 249 μL 封闭溶液中。使用前配制溶液。

抗体库存集中度稀释范围最终浓度（染色用稀释液）
索克斯2200微克/0.1毫升1:50–1:5001:100
巢蛋白1.25微克/毫升1:20–1:2001:200
GFAP2.5–5微克/毫升不适用于免疫细胞化学1:250

5.生长培养基（培养基）
DMEM/F12
2% B27 补充剂
1% N2 补充
20 纳克/毫升bFGF
20 纳克/毫升表皮生长因子
2 μg/mL 肝素
1%青霉素/链霉素
1%谷氨酰胺

6.涂层溶液（无菌，0.2μm过滤）
a.PLO工作液（20μg/mL）：
将 2 mL 的 PLO 库存溶液 (0.1 mg/mL) 溶解在 8 mL 的 PBS (1 × )中，制备 10 mL 的 PLO，终浓度为20 μg/mL （储存于 4 °C ）。
b.层粘连蛋白工作液 (5 μg/mL)
将 250 μL 储备液 (1 mg/mL) 溶解在 49.75 mL PBS (1 × )中，得到 50 mL 层粘连蛋白溶液，终浓度为 5 μg/mL。

7.解剖解决方案
要制备含有 3% Pen/Strep 和 1% 两性霉素 B 的 PBS 或 HBSS 或 DMEM/F12：将 0.3 mL 的 Pen/Strep 和 0.1 mL 的两性霉素 B 添加到 9.7 mL 的 PBS (1 × ) 。

8.氯胺酮 ( 80 mg/mL ) 和甲苯噻嗪 ( 10 mg/mL ) 工作溶液
a.配制 3 mL（浓度 80 mg/mL）氯胺酮工作溶液：
将 2.4 mL 的氯胺酮储备溶液 (100 mg/mL) 添加到 0.6 mL 的 PBS (1 × )中。
b.制备 3 mL （浓度 10 mg/mL）甲苯噻嗪工作溶液：
将 1.5 mL的甲苯噻嗪储备溶液 (20 mg/mL) 添加到 1.5 mL的 PBS (1 × )中。

9.PBS (1×)
将 1 片 PBS 溶于 500 mL 蒸馏水中，用于制备 PBS (1 × ) 溶液。然后将溶液高压灭菌。

设备

1.层流罩（Jal Tajhiz ，目录号：1229）
2.37 °C 培养摇床（IKA，型号：KS 4000i Control）
3.离心机（Hettich Lab Technology，型号：Universal 320R）
4.血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号： Z359629）
5.CO 2细胞培养箱（ Memmert ，型号：INC108 T2T3）
6.倒置荧光显微镜（ Optika ，型号：XDS-2FL）
7.小镊子手术工具（Fine Science Tools，目录号：11050-10）
8.体视显微镜（奥林巴斯，目录号：7L19549）
9.解剖工具
a.大剪刀（ Fishersci ，目录号：10633652）
b.小剪刀（ Fishersci ，目录号：15207266）
c.镊子（ Fishersci ，目录号：10098140）
d.弯钳（ Fishersci ，目录号：10213941）
e.斜角钳（ Fishersci ，目录号：22-079-762）
f.抹刀（ Fishersci ，目录号：11750229）
10.高压灭菌器（ Kavoosh ，目录号：2589224）
11.烤箱（ Memert ，目录号：1-100-800）
12.啮齿动物断头台（DCAP，德国）
13.Rongerus （精细科学工具，目录号：16004-16）

软件

1.Infinity 软件（4.6 版）

程序

整个实验过程的示意图如图1所示。

图 1. 展示大脑切除、齿状回 (DG) 解剖和 DG 消化的图片

A.细胞培养板层的聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂层

1.将适当体积的聚-L-鸟氨酸 (PLO) 溶液 (20 μg/mL) 添加到细胞培养孔板中，以完全覆盖表面（6 孔板为 1.5 mL，24 孔板为 450 mL，60 μL对于 96 孔板）（参见配方）。
2.°C孵育2 小时。
3.倾斜板并通过在每个孔的角落移液去除 PLO，然后向每个孔中添加适当体积的 PBS（1 × ）（6 孔板为 2 mL，24 孔板为 1 mL，100 μL对于 96 孔板），并孵育 2 分钟。用 PBS (1 × ) 洗涤并孵育 3 次。
4.添加层粘连蛋白，使其在每孔中的浓度为5 μg/mL，并在37 ℃下孵育过夜（16小时）。
5.在让盘子干燥之前立即使用它们。在接种细胞之前，可以选择用 PBS (1 × ) 清洗每个孔。去除层粘连蛋白或用 PBS (1 × )清洗后 1-2 分钟接种细胞。

B.收获大鼠脑组织（图2）

使用两套独立的无菌手术工具，以降低头发和血液污染的风险。一套用于从成年大鼠身上采集大脑，另一套用于从大脑中显微切割齿状回。如果正确执行以下步骤，大脑将与头骨分离而不会造成任何损坏。
1.根据以下阶段，使用氯胺酮（ 80 mg/mL ， ip ）和甲苯噻嗪（10 mg/mL， ip ）的混合物腹膜内（ip）注射麻醉大鼠（参见配方）：
a.准备麻醉溶液。
b.将老鼠从笼子里抬起来，用毛巾盖住它的头。将其安静地放在笼盖上，抓住其杆并固定不动。
c.用一只手抓住前肢下方的大鼠颈部附近，同时用另一只手握住尾巴。在这种情况下，大鼠的头部保持不动。肩部向上抬起，暴露腹部，然后在腹部右下腹注射麻醉液（ ip ）。
2.用啮齿动物断头台切开靠近头部的颈部（斩首）。
3.通过喷洒 70% 酒精对头部、解剖区域和手术工具进行消毒。
4.将头部的侧面部分（颞骨）固定在两根手指之间。
5.使用细剪刀，将头部中间的皮肤一横切，然后将皮肤收回。用大剪刀将头骨底部剩余的肌肉和组织分开。开始去除从枕骨到额叶的骨头。
6.用咬骨钳取出小脑上方的枕上骨，直至露出。
7.现在按顺序步骤打开半球上的骨头：首先，将一把剪刀的扁平刀片放在右顶骨板下方，并从内部用力将其远离大脑。以同样的方式分离左顶叶板。
8.间缝合处开始，用咬骨钳去除额头颅骨板。去除骨头以暴露大脑的额叶部分（见注释 1）。
9.要去除脑膜，请将细剪刀刺入半球间裂，并用细镊子去除半球上的脑膜。
10.用圆形抹刀向前和向后运动横向松开暴露的大脑。
11.将抹刀插入颅底内并滑动，将大脑推离颅骨，用同一把抹刀切割附着的神经，然后立即将大脑翻转到含有 3-5 mL 冷 PBS (1 × ) 的 50 mL Falcon 管中，并用3 % 青霉素/链球菌和 1% 两性霉素 B 置于水冰上。观察整个大脑没有任何损伤，表明其结构完好。

图 2. 成年大鼠大脑的收获。 A. 手术工具。 B. 使用啮齿动物断头台来切割头部。 C.将70%酒精喷在头上，并用细剪刀沿中线切开皮肤。 D.用大剪刀切割剩余的肌肉组织。 E 和 F.介绍了使用咬骨钳去除枕骨。 G. 呈现暴露的小脑。 H. 通过沿中线切割骨头来进入半球。 I. 将剪刀的扁平刀片放在右顶骨板下方，并压在头骨的内表面上。 J. 显示了暴露的右半球。 K. 对左侧执行相同的程序。 L. 描绘了两个半球。 M 和 N。显示使用咬骨钳去除额骨，从额间缝合处开始，继续切割骨头的小碎片。 O. 大脑的额叶部分已被访问。 P和Q.通过在暴露的大脑的边缘插入圆形抹刀并前后横向移动并通过在大脑下方滑动抹刀来分离神经来将大脑与头骨分离。 R. 挖出大脑，将其转移到含有 3-5 mL 冷 PBS (1 × ) 的 50 mL Falcon 管中，其中含有 3% Pen/Strep 和 1% 两性霉素 B，并保存在冰水中。

C.DG 显微解剖（图 3）

图 3. 齿状回显微解剖。 A. 手术工具。 B 和 C. 解剖区域。 D. 用弯钳将分离的大脑转移到滤纸上。 E. 立体显微镜下的完整大脑。 F. 用手术刀切掉小脑。 G. 沿着中线将大脑分成两个半球。 H. 用镊子将每个半球翻转到内侧表面。 I. 去除每个半球内部的间脑（以黑线表示）。 J. 皮质内部的海马体可见。黑线所示的中间部分是齿状回。 K、L 和 M。通过在隔离边界插入抹刀并将其释放到解剖区域，将海马与脑组织分离。 N. 立体显微镜下的海马。 O. 将抹刀插入海马裂以隔离齿状回。 P. 在中心观察到齿状回（由黑线表示）。

1.将培养皿盖放在立体显微镜下的冰顶部。
2.用滤纸盖住培养皿，并用 2 mL 的冷解剖溶液完全冲洗。将照明器放在右侧并将其聚焦在解剖区域。
3.使用弯钳将分离的大脑从 50 mL Falcon 管转移到解剖区域，并用解剖溶液冲洗（每个大脑 2 mL）。
4.将大脑滚动到其腹侧表面。首先，用手术刀，用镊子夹住大脑的同时切断小脑，然后将大脑沿矢状面切成两个半球。
5.向上翻转每个半球以查看内侧并使用镊子将它们固定到位。
6.首先，在穹窿和间脑的内缘处插入抹刀，将抹刀从每个半球的中心去除，然后将抹刀从后向前滑动，最后去除间脑。
7.现在海马体在内侧可见。用抹刀将整个胼胝体的皮层覆盖物与海马体分开。从颞中隔方向分离海马，用抹刀将其与其他脑组织分离，然后将整个海马翻转到解剖区域。切割剩余的皮质和白质组织碎片。
8.要从海马体中解剖 DG，请重新聚焦显微镜，并观察海马裂（在某些大鼠中它不那么明显）。
9.在大多数大脑中，海马裂中的血管（海马小动脉）是明显的，并且作为将 DG 与 CA1 区域分开的标志。从内侧平面观察海马体时，DG位于中间区域。使用镊子将海马固定到位，用细抹刀沿着海马裂隙滑动以切断 DG，然后将其转移到含有 1 mL 冷 PBS (1 ×) 或 DMEM/F12 (1:1) 的微管中。

D.DG 组织解离（图 4）

图 4.齿状回 (DG) 解离。 A. 将含有 DG 组织的微管转移到层流罩下。 B. 添加 1 mL PBS 清洗组织。 C. 使用无菌手术刀切割组织。 D. 完全切碎。 E.添加酶溶液。 F. 将组织碎片收集到 Falcon 管中。 G.根据组织碎片的量添加酶液。 H. 继续摇床。 I. 可见细胞悬液，呈乳白色。 J. 显示了离心后的单细胞沉淀。

1.将含有 DG 组织的微管转移到层流罩下。
2.将 DG 碎片清空到层流罩下的培养皿中，并添加 1 mL 含有 1% Pen/Strep 抗生素的 PBS（1 × ），用于两个齿状回清洗组织两次，将溶液从培养皿中吸出，并添加 500 μL PBS (1 × ) 以覆盖组织。保持组织碎片湿润。
3.用无菌手术刀将组织切开，根据组织量完全绞碎2-3分钟。机械消化过程中培养皿的旋转使解离更加均匀。用手术刀切开 1 mL 移液器尖端初始段的 1 mm，以扩大尖端的孔并用组织碎片填充。
4.将切碎的组织转移到含有预热木瓜蛋白酶 (0.5 mg/mL)、分散酶(2 mg/mL)、DNase (0.02 mg/mL) (PDD) 酶溶液的 50 mL Falcon 管中，并在摇动下在 37 °C下孵育（ 150 转/分钟）。每只动物使用 1 mL 的酶溶液。
5.按如下方式在酶溶液中孵育：对于年轻的成年大鼠，10-15 分钟的孵育时间就足够了。时间越长，碎片越多，细胞存活率越低。对于老年大鼠，15-20 分钟的孵育时间有效。 10 分钟后，将管转移到层流罩下，用 P1000 移液器缓慢上下移液 5-7 次。每5分钟观察一次Falcon管；如果组织变软且溶液呈乳白色，则停止消化。
6.酶孵育后，监测单细胞悬浮液。如果细胞悬浮，溶液将呈乳状。如果仍有较大的组织，最好除去上面的液体并继续下一步。要解离大颗粒，请向 Falcon 管中添加更多酶并孵育 5 分钟。
7.要终止酶活性，请添加酶溶液体积三倍的碱性 DMEM/F12 培养基。上下移液悬浮液 6-7 次，然后以 95× g离心5 分钟。
8.弃去上清液，将细胞沉淀重悬于生长培养基 (1 mL) 中，轻轻上下吹打 3-4 次。避免气泡形成和快速移液；它会降低细胞产量并产生更多碎片。可选：可以添加更多培养基至 10 mL，并通过 70 µm 细胞过滤器过滤。将细胞过滤器放在 50 mL Falcon 管上，并通过它过滤溶液；这会去除未解离的组织团块、白质和结缔组织。然而，这可能会以失去一些 NSPC 为代价。

E.细胞计数和电镀

对获得的单细胞进行细胞计数。
在某些培养条件下，分离过程失败，无法获得单细胞。明亮的圆形细胞不可见，培养物中充满了未消化的组织和死亡细胞。因此，该培养物不适合电镀。然而，在原代培养中碎片和死细胞的存在是不可避免的。实验者必须识别出小而明亮的单细胞。细胞碎片形状不均匀，在显微镜下可观察到一层，但活细胞有三层且呈圆形。碎片在培养物中表现为点状斑点。此外，还可以使用 DAPI 染色和台盼蓝染色来区分分离的神经干细胞的碎片。
1.在微管中用 10 μL 0.4% 台盼蓝稀释 10 μL 细胞悬浮液。
2.将 10 μL 从混合物转移到血细胞计数器室中。
3.计数四个单独的方块（WBC 细胞计数方块）。
4.将总数除以 4，再乘以 2（稀释系数）和 10 4 。
每个正方形的面积为1毫米×1毫米。盖玻片和载玻片之间的空间为 0.1 mm。因此，大正方形的体积为1mm 3或0.0001mL。根据血细胞计数器室的特性，为了测量每毫升的细胞计数，将平均细胞数乘以稀释因子和10 4 。
通过该计算，可测量 1 mL 细胞悬液中的细胞总数。
5.测量并优化您感兴趣的特定细胞培养容器中的细胞密度（参见注释 2）。 T-25 烧瓶2 × 10 5 个细胞，每孔 1.5 × 10 5 个细胞，6 孔板每孔 1 × 10 4 个细胞对于 12 孔板。这取决于每种情况下使用的动物数量。（NSPC 在 DMEM/F12 中的维持和生长需要高密度铺板。由基本 DMEM/F12 培养基制备的完整培养基，而不是 Neurobasal A。）
6.对于老年大鼠，平板细胞密度如下： T-25 烧瓶为2.5 × 10 5 个细胞， 6 孔板为每孔 1.5 × 10 5 个细胞， 12 孔板为每孔1 × 10 5 个细胞。使用贴壁烧瓶和孔板。对于神经球培养，在非贴壁 6 孔板中每孔使用 1.5 × 10 5 个细胞。

F.贴壁单层培养物的生成（图 5、6）

图 5. 在体外不同天从年轻成年大鼠齿状回分离的单层神经干/祖细胞 (NSPC) 培养物。 A.第2天：神经干/祖细胞可见为明亮的小圆形细胞；这些细胞在第 3 天开始附着到表面，到第 5 天，大多数增殖细胞发育出具有小细胞体的过程。 B.第18天：代表增殖的NSPC，其不断生长以占据培养容器。 C. 到第 28 天，NSPC 的数量大幅增加，并且倾向于建立联系。 D.第38天，出现玫瑰花状结构。所有比例尺均为 100 μm，使用 10 ×物镜。

图 6. 成年大鼠齿状回神经祖细胞在体外不同天的单层培养。 A. 第 12 天：单细胞扩大其过程并快速生长。 B.第19天：增殖的神经祖细胞呈纺锤状，并增殖至汇合血管。 C.第21天：可见增殖的神经祖细胞达到80%汇合度。 D.第51天：大多数细胞出现较小的突起。所有比例尺均为 100 µm，物镜为 10×。

1.将分离的细胞接种到 T-25 烧瓶的 PLO/层粘连蛋白包被的表面上，这为 NSPC 的维持和生长提供了足够的底物。
2.让细胞不受干扰地扩张。对于年轻的成年大鼠，细胞在培养箱中最多可放置 4 天；对于老年大鼠，细胞最多可在培养箱中放置 7 天。对于年轻成年大鼠，在铺板后 3-4 天监测培养物；对于老年大鼠，则在铺板后 7 天监测培养物。一旦细胞粘附到表面，使用 P1000 移液器去除细胞上方的所有培养基，并将其清空到 15 mL Falcon 管中。
3.在贴壁细胞开始扩增的最初几天后，每 2 天向培养物中添加生长因子 (20 ng/mL) 和肝素 (2 µg/mL)。
4.年轻成年大鼠 7 天，老年大鼠 10 天后，从 T25 烧瓶中取出 2.5 mL 培养基，并添加 2.5 mL 新鲜培养基。
5.检查汇合度。
6.90% 汇合时，用手掌缓慢敲击烧瓶以分离这些细胞以进行生化测定。
从年轻成年大鼠获得的 NSPC 在 T25 烧瓶中需要 10 –15 天才能达到 80% 汇合。对于老化的 NSPC，需要 20-25 天才能达到 80% 的融合（见图 5 和 7）。

在体外不同天培养年轻成年大鼠齿状回的神经祖细胞作为神经球。 A.第4天。B.第8天：形成细胞簇。 C.第11天：神经球呈现圆形形态。 D.第22天：球体尺寸增大。 E.第25天：球体变大，其中心呈黑色。 F.第27天：大多数具有暗中心的神经球是明显的。所有比例尺均为 50 μm ，使用 20 ×物镜。

7.如果培养基中有非贴壁细胞或浮球，请执行以下步骤：
a.使用 P1000 移液器去除细胞上方的培养基，并将其倒入 15 mL Falcon 管中。
b.用 P1000 移液器缓慢上下移液 5-6 次，将神经球和非粘附细胞与附着的碎片分开。对于某些情况，您可以在 95× g下离心5 分钟并获得沉淀，然后添加 300 μL Accutase在室温下 3 分钟。
c.在室温下以 95× g离心 5 分钟。
d.除去上清液，并向沉淀中添加相同体积的完全无血清培养基。上下移液 3-4 次，然后将其放回孔中（参见注释 3）。

G.贴壁单层培养物的传代培养

当细胞达到约80%汇合时，必须对其进行传代培养，以避免细胞脱离和过度生长，并保持细胞处于健康状态。
执行以下步骤进行贴壁单层培养物的传代。
1.完全去除旧培养基，然后将 2 mL PBS (1 × ) 添加到 T25 烧瓶中。轻轻地左右倾斜烧瓶，慢慢冲洗烧瓶。 30 秒后取出 PBS (1 × )。
2.将 1 mL Accutase添加至 T25 烧瓶中； 37 ℃孵育2-3分钟，同时在显微镜下观察T25烧瓶，并检查细胞是否脱落。如果它们没有分离，轻轻拍打烧瓶的两侧和底部以帮助细胞分离。关键：用最少量的酶即可有效地机械分离细胞。
在酶溶液中较长的孵育时间会导致传代培养后单细胞与表面的附着力较低。严重研磨会导致细胞产量低。 Accutase是一种蛋白水解酶和胶原蛋白分解酶的酶溶液。它可以作为胰蛋白酶的直接替代品。
3.为了灭活酶活性，将三倍体积的酶溶液作为 DMEM/F12 培养基添加到 T25 烧瓶中。
4.上下移液几次，然后将包含单细胞的整个培养基收集到 15 mL Falcon 管中。
5.离心机在 95× g ，室温5分钟
6.非常轻轻地将沉淀重新悬浮在 1 mL 完全无血清培养基中。尽量不要形成气泡。将移液器吸头完全浸入溶液中，直至 Falcon 管底部并接触管壁，然后开始缓慢移液。将 100,000–150,000 个细胞接种到 6 孔板中（表 1）。
将细胞以高密度接种在包被的孔板上。第一次传代时，您可以使用 6 孔板每孔 100,000 个细胞，或 24 孔板每孔 50,000 个细胞。在接下来的传代中，最好增加细胞密度。

表 1. 推荐的细胞密度
细胞密度细胞培养板
100,000–150,000每孔 6 个板
50,000–70,00024块板每孔
10,000–20,00096板每孔

H.神经球培养（图 7、8）

图8.在体外不同天将成年大鼠齿状回的神经祖细胞培养为神经球。 A. 第 25 天：神经球形成，其球形形状逐渐形成且尺寸增大。 B.第32天：神经干/祖细胞（NSPC）增殖，球体直径急剧增加。 C.第36天：神经球迅速增殖，其中心呈现黑色。 D.第41天：出现大而暗的神经球。 E.第48天：神经球开始附着到表面。所有比例尺均为 50 μm，使用 20 ×物镜。

获得的单细胞悬浮液（2.8–3.5 × 10 5 个细胞每毫升）播种，用于神经球培养，如下所示：
1.将细胞沉淀重悬于 1 mL 无血清生长培养基中，然后对细胞进行计数，并按照推荐数量（老年大鼠5 × 10 5 个细胞，年轻成年大鼠3–4 × 10 5 个细胞）接种到培养皿中。非粘附 T25 烧瓶。然后，在 37 °C、 5% CO 2下孵育（参见注释 4）。关键：以高于建议的密度接种细胞会导致细胞聚集。
2.老年组要在 7 天之前不要扰动细胞。让细胞适应培养基 4-5 天并开始形成球体。避免烧瓶受到任何干扰或移动（参见注释 5）。
3.初始孵育期结束后，按如下方式重新铺板细胞培养物：将 T25 烧瓶内的所有培养基（其中含有开始形成神经球的细胞和小细胞簇）收集到 15 mL Falcon 管中。
4.将 1–1.5 mL 的 PBS (1 × ) 添加到 T25 烧瓶中，然后用移液器移取烧瓶的整个表面，并丢弃到 15 mL Falcon 管中。
5.在室温下以95× g离心5分钟。
6.将细胞沉淀重新悬浮在 1 mL 的神经球介质中，并缓慢上下移液 2-3 次。
7.转移至 6 孔板的一个孔中。
8.每 3-4 天添加一次生长因子和肝素；生长因子 (20 ng/mL) 和肝素 (2 μg/mL)。
14-16 天后，幼年大鼠的球体形成。老年大鼠的神经球从接种后10天开始生长。 28-30 天后，老化球体完全形成（参见注释 3 以及图 7 和 8）。如果培养基变黄，请在培养开始 3 天后添加 1 mL 无血清培养基。

I.神经球数量的量化

神经球的数量作为 NSPC 增殖的指标。在神经球达到最大生长且中心没有出现黑色外观的阶段（最佳时间），估计球体的数量如下：
1.将细胞培养孔板置于倒置显微镜下，物镜 20 × 。
2.从一个角开始，沿着井直径一直到下一个角，逐个区域对球体进行计数。
3.调整焦点以防止检测到细胞聚集体而不是健康球体。

J.量化神经球的大小

神经球的直径被用作神经球生长的指标。
使用 20 ×物镜，从整个孔（8-9 个视野）中拍摄非重叠的随机图像，因为大多数球体都包含在视野中。使用 Infinity 软件测量神经球的直径。两次测量直径的平均值代表神经球直径。然后，为每个图像表达不同的直径。例如，如果图像中有七个神经球，请计算每个神经球的直径。现在有七个不同直径的神经球，其中三个神经球直径为 58 ± 9 微米，两个神经球直径为 89 ± 13 微米，两个神经球直径为 120 ± 9 微米。这为间接评估 NSPCs 在体外培养不同天数的增殖率提供了有价值的量化数据。

使用 Infinity 软件的步骤如下：
打开Infinity软件>选择文件>打开图像>调整>千分尺>从工具栏中选择一把尺子>放入比例尺的长度并右键单击>打开页面>在放大框中写入1并将比例尺的长度写入长度框>绘制一条水平线和一条垂直线，然后右键单击>显示长度（图9、10和11）。

图 9. 通过 Infinity 软件量化神经球大小。打开图像。

图10.打开文件，调整千分尺，在长度框中写入比例尺长度，在放大倍率框中写入1

图 11. 画两条线并计算两个数字的平均值以获得每个球体的直径

K.神经球的通道

1.取出板中的内容物并将其转移至 15 mL Falcon 管中。
2.轻敲板并用 DMEM/F12 介质移液以移出附着的球体。
3.g离心5 分钟。
4.去除上清液，并将 300–500 μL Accutase准确添加到沉淀（神经球）上。
5.根据神经球的大小和数量，在 25 °C下孵育4-8 分钟。关键：在酶孵育过程中，可以缓慢地上下移液 4-5 次而不产生气泡。光照下观察神经球是否解离。
6.添加两倍于酶体积的完全无血清培养基并轻轻混合。
7.× g离心5 分钟。
8.将颗粒重新悬浮在 1 mL 的神经球介质中。
9.5 个细胞/mL的相同密度对细胞和板进行计数。关键：神经球通道的数量对于确定细胞密度很重要。由于在我们的培养系统中，增殖率随着传代次数的增加而降低，因此在第一次传代后的阶段中以更高的密度铺板细胞至关重要。

L.免疫染色（图12）

1.孔 1–2 × 10 4 个细胞接种到 96 孔板中（参见注释 6）。
2.从孔中吸出培养基并用 100 μL PBS (1×) 洗涤。
3.完全吸出 PBS，加入 100 μL 4% 多聚甲醛 (PFA) 的 PBS（PH 7.4）溶液，然后室温孵育 20 分钟（建议不要使用冷 PFA）。
4.吸出 PFA，并用 100 μL PBS (1×) 清洗每孔（3 次）。
5.μL 0.2% Triton X-100孵育 10 分钟，使细胞膜具有渗透性。
6.要封闭非特异性抗原，请添加 100 μL 封闭液（封闭液由 10% 正常山羊血清、1% BSA、0.1% Tween 的 PBS 溶液组成）（参见配方s ）并孵育 60 分钟。
7.吸出封闭液。
8.μL PBS （1×）清洗（3 次）。
9.如下在封闭液中稀释一抗：
a.要制备 350 μL 1:200 抗巢蛋白溶液，请将 1.75 μL巢蛋白抗体添加到 348 μL 封闭溶液中。使用前准备。
b.要制备 350 μL 1:100 Sox2 溶液，请将 3.5 μL S ox 2 抗体添加到 346.5 μL 封闭溶液中。使用前准备。
c.要制备 250 μL 1:250 GFAP 溶液，请将 1 μL GFAP 抗体添加到 249 μL 封闭溶液中。使用前准备。
10.每孔加入70 μL一抗，用封口膜密封板边缘以防止抗体溶液蒸发，并在室温下孵育3小时或在4℃下孵育过夜，优先在湿室中孵育。
11.(1 × )清洗（3 次）。
12.用 PBS (1 × ) 稀释二抗（两种二抗均为 1:1,000）。要制备 2 mL 二抗溶液，请将 2 µL 二抗添加到 1,998 µL PBS (1×) 中。
13.将细胞与 70 μL 二抗在室温下避光孵育 2 小时。
14.加入 100 μL PBS (1 × )，孵育 5 分钟，除去 PBS，重复该过程 3 次，然后用铝箔覆盖整个 96 孔板以防止光线穿透。
15.加入 70 μL DAPI 溶液，室温避光孵育 1 分钟。
16.除去 DAPI 溶液，并用 100 μL PBS (1 × ) 清洗每个孔两次。
17.使用倒置荧光显微镜立即捕获图像。对于阴性对照，不添加一抗（参见注释 7）。
18.免疫阳性细胞的百分比（图 12）。

图 12. 免疫细胞化学检测单层培养的神经祖细胞的抗原标记。神经祖细胞表达 (A) Sox2 抗原、(B)巢蛋白抗原和 (C) GFAP（星形胶质细胞标记）。所有比例尺均为 100 μm ，使用 10 ×物镜。

数据分析

对于单层培养，含有原代培养物或传代细胞的多个孔（4 孔板或 6 孔板）可作为技术复制来平衡变异。
不同实验设置或通道的独立重复作为生物复制。每个实验条件和源自它的细胞通常被视为生物复制。每个条件使用四到六个生物重复，以减少假阳性数据并使数据可信。 N 个条件的数量定义为生物重复，每个 N 重复相同条件的孔数定义为技术重复。两只年轻成年和老年大鼠在体外几天内的球体数量和大小的 N 数如下表所示（表 2-5）。

表 2. 每个 N 的体外天数中年轻组的球体大小 (μm)
年轻群体/球体大小D5D10D12D14D15D17D18D20
N137544987153127114183
氮气49475049.54104108.50129137
N33964101105190
N430109

表3。每个 N 的体外天数中老年组的球体大小 (μm)
老年组/球体尺寸D5D10D15D17D18D31D39
N10394542376877
氮气454239736079
N33332296399
N45578152

表 4. 每个 N 中每次传代的年轻组中的球体数量
年轻群体/球体数量P1P2
N17079
氮气17886
N3145129
N48928
N559137

表 5. 每个 N 中每次传代的老化组中的球体数量
年龄组/球数P1P2
N15679
氮气9865
N37887
N42512

球体的数量和尺寸如下图所示（图 13、图 14 和图 15）。

图 13. 年轻成年大鼠和老年大鼠体外几天内球体大小的比较。年轻成人组的球体尺寸更大（不显着）。数据以平均值±SEM 表示。

图 14. 年轻大鼠和老年大鼠每次传代的球体数量比较

图 15. 每个齿状回 (DG) 的神经干/祖细胞 (NPC) 标记物阳性细胞的百分比。大约 80% 的总细胞呈 SOX2 阳性。数据表示为平均值±SEM。

通过这种方法，DG 从 4 个增加到 6 个 15 天后，成年大鼠在单层系统中达到 90% 的汇合度。对于老年大鼠， 25 天后，来自 6 只大鼠的 DG 在单层培养中产生了适当的汇合。
通过这种方法分离的细胞代表了成年 NSPC 的可识别形态。这些细胞也代表 NSPC 的典型标记。 Sox2 在 80% 的细胞中表达。大多数细胞表达Nestin ，少数细胞表达GFAP。对于每口井，用相机捕获 6-8 个不重叠的显微视野。免疫阳性细胞的百分比量化如下等式：

免疫阳性细胞数/DAPI标记细胞核数×100=免疫阳性细胞百分比。

测量每个 N 的 SOX2 和 GFAP 阳性细胞的百分比（表 6）。计算得出的 Sox2 和 GFAP阳性细胞如下条形图所示（图 15）。
在此协议中，我们将细胞扩展为神经球培养物，这是一种众所周知的高纯度 NSPC 培养方法。实际上，根据该方案，在包被板上培养的神经球以单层形式增殖，并且大部分呈 Sox2 阳性。
培养物中存在成熟的神经元，可通过其长突来识别。因此，证实了获得的细胞上存在对 NSPC 具有特异性的抗原标记。这是一种有效且可靠的方案，用于培养和扩增老年大鼠NSPC（20-24 个月），此前曾报道称该方案具有挑战性和困难性。

表 6. 每个 N 的 SOX2 和 GFAP 阳性细胞百分比
样本Sox2 阳性细胞的百分比GFAP阳性细胞的百分比
N182.30452675(200 / 243)12.23684（760 中的 93）
氮气68.02721088（441 中的 300）16.94444（360 中的 61）
N391.18329466（431 中的 393）8.333333（504 中的 42）
N420.13889(58 共 288)
意思是80.5050107714.41338
标准差11.682454685.192688

协议验证

根据从单层和神经球培养物及其免疫染色获得的数据，我们引入了一种可靠且可重复的方案，用于分离和扩增源自年轻成年和老年大鼠 DG 的成年大鼠神经祖细胞。这些细胞携带神经干细胞的特定标记，并在所有实验和测定中可靠地复制。通过神经球细胞培养条件，来自年轻成年大鼠的干细胞产生了高达四代的自由漂浮的神经球，并且增殖在第四至第五代时减慢。在我们的培养条件下，老年大鼠干细胞的神经球形成一直持续到第2代，并且在第3代时没有可识别的神经球。在一些研究中，老年大鼠的NPC通过更多的传代进行扩增。这项研究将添加更多有关 DG 成年大鼠 NSPC 的衍生和扩展的信息。

笔记

1.老年大鼠的头骨比年轻成年大鼠的头骨更厚，因此移除它们更困难且需要更长的时间。
2.尽快计数细胞，尤其是老年大鼠 NSPC，其更为敏感。
3.在交换培养基时，需要特别注意和努力，轻轻地、缓慢地处理大鼠 NSPC。任何剧烈的操作都会导致 NSPC 脱离。
4.如果在培养的第一天有足够大的组织颗粒以防止精确计数，则在此步骤中计数并平板细胞（根据我们的实验）。
5.这些细胞非常敏感，快速移液、补充剂浓度的改变以及培养容器的剧烈移动等因素会阻止细胞贴壁。尽量不要形成气泡。
6.每个标记使用三个重复。
7.不要延迟拍照，因为这可能会导致荧光褪色。

必要的预防措施：
1.阅读所有材料和设备的安全数据表。
2.台盼蓝是一种致癌剂。使用个人防护服并避免接触您的手、皮肤和眼睛。不要呼吸它。
3.在无菌条件下操作所有产品。使用手套、口罩和防护服。

致谢

这项工作得到了马什哈德菲尔多西大学的资助（编号 3/54633）的支持。作者非常感谢 Shefa 神经科学研究中心、Khatam Alanbia医院、Sepideh Ghasemi 和 Hadi Aligholi博士提供的技术和科学支持。

利益争夺

作者没有利益冲突。

参考

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