材料与试剂

1.Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)（康宁，目录号：10-013-CV），储存于 4 °C
2.胎牛血清（FBS）（ATCC，目录号：30-2020 TM ），等分并储存在-20°C
3.新鲜制备的100-200 nm尺寸的纳米乳液（纳米乳液的制备方法请查阅参考文献）
4.24 孔板（Corning，VWR，目录号：10062-896）
5.96 孔板（Corning，VWR，目录号：29442-056）
6.微量离心管（ Fisherbrand Premium 微量离心管，目录号：05-408-129）
7.密理博西格玛TM Millex TM -GS 无菌注射式过滤器装置，MCE，0.22 和 0.45 μm（目录号：SLGSR33SB 和 SLHA033SS）
8.Fisherbrand TM一次性比色皿（Fisher Scientific，目录号：14-955-127）
9.封口膜（Sigma-Aldrich，P7793）
10.使用 PURELAB ® Option-Q 系统生成I 型超纯 HPLC 级水 (18.2 M Ω · cm )
11.DiR [1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳花青碘化物，DiIC 18 (7)]（Thermo Scientific，目录号：D12731）
12.DiD [DiIC 18 (5)； 1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳花青，4-氯苯磺酸盐]（Thermo Scientific，目录号：D7757）
13.流体巯基乙酸盐介质（Millipore ，目录号： STBMCTM12）
14.胰蛋白酶大豆肉汤（Millipore ，目录号： STBMTSB12 ）

设备

1.Odyssey 经典成像仪（Li-COR Inc.，林肯，内布拉斯加州）
2.Odyssey M 成像系统（Li-COR Inc.，林肯，内布拉斯加州）
3.Pearl 小动物成像系统（Li-COR Inc.，林肯，内布拉斯加州）
4.37 °C 培养箱（Fisher Scientific， IsoTemp ® 500 系列）
5.激光粒度仪 NanoZS （英国马尔文）
6.Prism R 冷冻微量离心机（ Labnet International Inc.）

软件和数据集

1.Image Studio 5.2 版（Li-COR Biosciences，美国）
2.Zetasizer 软件 7.13（马尔文帕纳科）
3.GraphPad棱镜，10.0.0

程序

表中列出了定义的质量控制属性 (CQA) 和质量控制 (QC) 措施 1 包括对制造的纳米乳液进行常规评估，以确保冷藏（4 ° C）储存后随着时间的推移胶体稳定性。我们提出的程序改编自Herneisey 和 Janjic (2023) 。在纳米乳液的整个生命周期中测量纳米乳液液滴尺寸、多分散指数 (PDI) 和荧光信号。同时，其他列出的压力测试可以在制造后的前几周内完成。本手稿中详细描述了所有胶体表征和压力测试。我们的实验室在许多出版物中使用了这一系列测试来保证纳米乳液的质量。我们配方的 CQA 和 QC 列于表 1 ，改编自Herneisey 和 Janjic (2023) 。图 2 总结了制造双色荧光标记 PFC-NE 后获得的 CQA 和 QC 的代表性结果。

表 1. 对全氟化碳纳米乳液 (PFC-NE) 进行的直径和多分散指数 (PDI) 关键质量属性 (CQA) 和质量控制 (QC) 测试汇总。转载自Herneisey 和 Janjic (2023) ，知识共享归属 (CC BY) 许可证 ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ) 。
描述CQA 或 QC直径规格PDI规格
初始直径中国质量保证协会140–180 纳米不适用
初始 PDI中国质量保证协会不适用< 0.25
% 直径变化或 PDI 值，之后：
过滤（0.22微米）中国质量保证协会<±5%< 0.25
细胞培养条件中国质量保证协会0–10%< 0.3
4℃保存95天中国质量保证协会<±5%< 0.25
4℃保存215天质量控制不适用不适用
80℃孵育7天质量控制不适用不适用

图 2.近红外荧光 (NIRF) 标记的全氟化碳纳米乳液 ( PFC-NE)的体外稳定性测试。 A) 制造后第 1 天和第 8 个月之间的液滴尺寸分布叠加比较。 B) 21 天的 pH 稳定性。 C) 在时间 0 和 37°C 孵育 72 小时后测量三种不同生物介质（水、DMEM 和 DMEM 中的 20% FBS）中的 PFC-NE 血清稳定性（p = 0.514、p = 0.777、p = 0.969 ，分别为学生t检验，n = 3)。 D) PFC-NE 离心稳定性。在离心之前和之后测量 PFC-NE（未稀释）大小（p = 0.097，学生t检验，n = 3）。 E) 使用 0.22 μm 滤膜进行无菌过滤之前和之后的 PFC-NE 稳定性（p = 0.642，学生t检验，n = 3）。 F)在制造后第 1 周和第 20 周之间比较PFC-NE 与 NIRF 染料DiR的荧光信号。 PFC-NE 按 PFC-NE 与水的 1:4 比例进行稀释。 Li-COR Odyssey Imager用于收集荧光信号。 GraphPad Prism 9.0用于统计分析；数据代表平均值±SD，每次测量至少重复三次。数据转载自Nichols 等人。 (2021) 根据知识共享归属 (CC BY) 许可证 ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ )。

A.尺寸和 Zeta 电位的动态光散射 (DLS) 测量

该分析技术用于测量粒径 (nm)、多分散指数 (PDI) 和 zeta 电位 (mV)。我们在许多出版物中使用了这种方法来描述和表征我们的纳米乳液 (NE)。我们的方法从 DLS 测量的 60 秒平衡步骤开始，然后在 25 °C下进行三轮（通常为 15 次）。 Zetasizer 软件 7.13 根据每次运行期间的颗粒计数自动选择最佳粒度分布测量所需的运行次数。尺寸和 PDI 随时间或应力后的变化表明胶体基础结构不稳定。使用 Malvern 的 Zetasizer 进行粒度测量可提供粒度分布曲线，可表明稀释液内的粒度均匀性。样品在介质中稀释制备。新的纳米乳液配方按 1:20 v/v 稀释至 1:160 v/v，以确定实现最高强度尺寸分布的稀释度。纳米乳液按 1:40 v/v 或 1:80 v/v 稀释。一旦选择，在所有需要尺寸、PDI 或 zeta 电位测量的测试中应使用相同的稀释比 (v/v)。标准尺寸、PDI 和 zeta 电位测量值在 HPLC（1 类水）中稀释。稀释介质可能会发生变化，具体取决于要运行的测试类型。所提出的方法详细介绍了通过在水中稀释 2 mL 体积的纳米乳液来同时测量尺寸和 zeta 电位。然而，如果仅测量尺寸或 PDI，则可以制备 1 mL 稀释液。图 2A 显示了示例数据。

方法：
1.在 HPLC 级水中按 1:40 v/v 或 1:80 v/v 稀释纳米乳液，在与 Zetasizer Nano 兼容的塑料比色皿中形成总体积 2 mL。
2.将比色皿插入 Zetasizer 并测量尺寸和 PDI。
3.每次完成测量后，取出比色皿，并通过 zeta 电位测量比色皿冲洗 1 mL 纳米乳液稀释液，以润湿电极。
4.将剩余的稀释液填充到 Zeta 比色皿填充线。
5.将 zeta 比色皿放入 Zetasizer Nano 中并测量 zeta 电位。

B.过滤测试

对于体内使用的纳米乳液，重要的是要有一种不影响纳米制剂胶体稳定性的灭菌方法。在无菌罩的范围内，纳米乳液通过 0.22或 0.45 μm 注射器过滤器进行过滤。过滤器尺寸取决于要过滤的颗粒的大小。例如，使用0.22 μm 过滤器很难过滤~200 nm 及以上的颗粒，因为颗粒可能不容易流过过滤器，并且迫使颗粒通过小过滤器孔径的应力可能会影响胶体结构和稳定性。在这些情况下，可以使用更大的过滤器尺寸，例如 0.45 μm。我们大多数粒径 <140 nm 且 PDI <0.15 的纳米乳液都可以使用 0.22 μm 过滤器进行过滤。超出此尺寸和 PDI 范围的纳米乳液必须使用 0.45 μm 孔径的过滤器进行过滤。请参阅图 2A 了解过滤测试的典型测量结果。示例数据如图 2E 所示。

方法：
1.测量 HPLC 级水中未过滤的纳米乳液的尺寸和 PDI。
2.使用 0.22 或 0.45 μm 过滤器在无菌罩内过滤纳米乳液样品。
3.使用与步骤 1（方法 A）相同的稀释比 (v/v)，测量过滤后的纳米乳液的尺寸和 PDI。
4.比较过滤前后的粒径值，看粒径值是否有明显变化。
注： ±10%的尺寸变化在可接受范围内（详情参见参考文献： Janjic et al., 2018; Herneisey et al., 2019; Saleem et al., 2019; Liu et al., 2020; Nichols et al.等人，2021 年；Herneisey 和 Janjic，2023 年）。

C.用于动物模型之前进行实验室级无菌测试

PFC-NE 是非无菌制造的，并根据纳米乳液液滴尺寸通过 0.22 或 0.45 μm 注射器过滤器进行无菌过滤。为了验证纳米乳液在动物研究中的使用，我们采用了改编自 USP 34 微生物测试第 71 条的无菌方案 [(71) 无菌测试，2016]。它利用培养基孵育前后 pH 值的变化来确定无菌状态。统计学上显着的 pH 偏差通过使用 GraphPad 软件计算的t检验来确定。显着的 pH 变化表明纳米乳液不是无菌的。选定的培养基为细菌和真菌等生物污染物提供理想的生长条件。巯基乙酸液体培养基仅用于检测厌氧细菌，胰蛋白酶大豆肉汤用于检测需氧和厌氧细菌和真菌。

方法：
1.将纳米乳液以 1:40 v/v 比例溶解到以下介质中（0.5 mL 纳米乳液到 19.5 mL 介质）。
a.流体巯基乙酸盐介质：在水浴中，30–35 °C。
b.胰蛋白酶大豆肉汤：在 22.5 ± 2.5 °C 下孵育。
2.将稀释液分成两部分，一份用于初始 pH 测量，另一部分用于随时间的孵育。
3.拍摄培养基中样品外观的照片。这将充当介质控制。
4.测量培养基对照和样品稀释液的 pH 值。
5.密封所有样品管并将纳米乳液在介质溶液中孵育 14-28 天。
6.目视评估培养基的微生物生长情况（浊度），再次拍照并与步骤 3 中的照片进行比较，然后再次测量 pH 值。

D.离心测试

为了评估纳米乳液在物理不利条件下的胶体稳定性，例如模拟恶劣的运输条件和剧烈的处理，使用了离心。纳米乳液胶体对离心的弹性也很重要，因为我们利用离心来测量制剂的药物含量，并在体外细胞培养测定过程中将纳米乳液治疗剂与细胞分离（Herneisey et al., 2019）。根据我们的经验，以 3,000 rpm (840× g ) 离心 30 分钟不会导致明显的尺寸变化。图 2D 显示了离心测试结果的示例，显示了离心前后液滴尺寸的差异。

方法：
1.将 500 μL 未稀释和过滤的纳米乳液分离到 1.5 mL 微量离心管中。
2.在环境温度( 25 ℃ ）。
3.吸取 100 μL 样品，并在 HPLC 级水中测量其尺寸和 PDI。
4.将管中剩余的 400 μL 样品在25 °C下以 3,000 rpm (840 × g ) 离心 5 分钟。
5.从每个管中取出足够的样品，用 HPLC 级水制备稀释液，用于尺寸和 PDI 测量（Nichols 等人，2021）。
6.比较所有样品的大小（未离心、过滤的样品作为对照）。
注意：离心步骤不应导致稳定纳米乳液的尺寸发生显着变化，任何变化通常小于 10%。

E.血清稳定性

需要仔细评估胶体和荧光稳定性，以避免体内制剂失败。虽然很容易令人信服地展示制剂在体外条件下的表现，但一旦纳米乳液与复杂的生物介质接触，预测纳米乳液的体内行为却极具挑战性。此类介质含有各种成分，如脂质、蛋白质、电解质等，所有这些成分都可以决定纳米乳剂的命运，影响生物分布、毒性和药代动力学特征。如果纳米乳剂用于动物生物医学测试，血清稳定性测试至关重要（Moore 等，2015）。图 2C 显示了血清稳定性测试结果的示例，显示了在体温下含血清培养基中孵育 72 小时之前和之后液滴大小的差异。

方法：
1.使用以下物质在 1.5 mL 微量离心管中制备一式三份 1.0 mL 纳米乳液稀释液：
a.HPLC级水
b.DMEM
c.DMEM 中含 20% FBS
2.使用 DLS 测量第一组稀释液的大小。这是对照、0 小时时间点读数。
3.将剩余的两个稀释液在 37°C 下孵育。
4.24 小时后测量第二次稀释的大小，72 小时后测量第三次稀释的大小。在 DLS 测量之前无需进一步稀释样品，因为纳米乳液在步骤 1 的初始制备过程中已被充分稀释。
5.比较测量值之间的任何尺寸差异。
、1 × PBS、DMEM 培养基、DMEM 中的 10% FBS 和 DMEM 中的 20% FBS 中进行，并在 24 小时、48 小时后进行尺寸测量。和72小时。

F.热循环

进行热循环研究是为了研究纳米乳液的温度敏感性/耐受性并加速配方的老化。该测试还可以帮助确定适当的储存条件并预测所制备的纳米乳液的保质期（Herneisey et al., 2019）。

方法：
1.将 5.0 mL 未稀释、过滤的纳米乳液等分至 15 mL 小瓶中。
2.使用封口膜密封小瓶并将其储存在 4°C 下。
3.在 4°C 下孵育 24 小时后，将小瓶转移到设置为 50°C 的培养箱中，再孵育 24 小时。
4.将小瓶在 4 °C 至 50 °C 之间循环，每个温度进行四次热循环。每次热循环为24小时，总热循环时间为8天。
5.循环完成后，让样品平衡至室温 1 小时，然后测量尺寸和 PDI。
6.将在环境温度下连续储存的新鲜制备的过滤纳米乳液的测量值用作对照。

G.荧光稳定性

为了确定 NIRF 标记的纳米乳液的长期荧光稳定性，定期定量荧光以检查荧光损失非常重要。我们的实验室方案是使用 Li-COR Odyssey 经典成像仪（Nichols 等人，2021）建立的，但可以轻松适应其他荧光板读取器（Herneisey 和 Janjic，2023）。调整成像仪焦点和强度设置以获得最高荧光信号，而不会导致样品过饱和和漂白。获得多次测量以确定最佳设置选择。 Odyssey M 成像系统还可以使用焦点偏移获得荧光测量。焦点偏移的确定方式与 Odyssey Classic 相同。一旦确定了初始最佳设置，相同的设置将用于所有后续测量。我们在体外评估初始荧光，以确保纳米乳液信号足够高，可以在动物研究期间在体内检测到。体外荧光稳定性监测的示例如图 2F 所示，其中使用 Image Studio Ver 5.2 对纳米乳液的连续稀释进行成像并进行荧光定量。图 3 显示了监测炎症的示例数据尾静脉注射 NIRF 标记的 PFC-NE 后长达 40 天，通过 Li-COR Pearl 成像仪测量小鼠体内的荧光。荧光差异对应于巨噬细胞浸润模式的变化，该变化响应于载药 NIRF 标记的 PFC-NE (CXB-NE) 中递送的药物塞来昔布 (CXB) ( Liu et al., 2020) 。

方法：
1.使用 HPLC 级水在 24 孔板中制备纳米乳液的六种连续稀释液，从 1:5 v/v（200 μL纳米乳液与800 μL水）到 1:160 v/v。
2.将每个稀释液中的 100 μL 三个副本转移到透明的平底 96 孔板中，并在 Li-COR Odyssey 成像仪上读取该板。
3.成像参数如焦点偏移（例如，0.5-1.0）和强度（例如，0.5）根据用于新鲜制备的纳米乳液的每个板/纳米乳液组合进行调整，并在所有后续测量中保持恒定。
4.DiR [1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳花青碘化物，DiIC18(7)] 是我们最优选的近红外染料，可以使用 800 nm 荧光通道进行检测。
5.染料组合，例如DiR (800 nm) 和DiD (700 nm) [DiIC18(5)；如果染料具有不同的检测波长 (nm)，则可以将1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳花青，4-氯苯磺酸盐]掺入单一配方中并进行测量。
6.根据研究要求在 D0（第 0 天）、D7、D15、D30、D60、D90 等重复荧光测量，以检查荧光稳定性。荧光损失不应大于初始值的 10% (Herneisey 和 Janjic, 2023) 。
注：我们的实验室在体外显示出最长 215 天的稳定纳米乳液荧光（Herneisey 和 Janjic，2023），并且在体内给药 40 天后，可以在切除的组织中检测到 PFC-NE （Liu等人，2020）。

小鼠炎症模型中 PFC-NE 标记的巨噬细胞的长期体内荧光成像。 (A) 无药 (DF-NE) 和 (C) 塞来昔布 (CXB-NE)纳米乳剂在雄性小鼠模型中显示出体内稳定荧光 40 天； (B，D) 分别用相同的 DF-NE 和 CXB-NE纳米乳处理的雌性小鼠的 NIRF 成像。 (E) 40 天随访期间男性中 DF-NE 和 CXB-NE 相关信号分布。 CXB-NE 治疗的动物随着时间的推移显示出信号减弱，尽管与 DF-NE 治疗没有统计学差异。数据代表平均值±SEM；使用双向方差分析来确定所有组之间的统计显着性。转载自刘等人。 (2020)根据知识共享归属许可证 ( https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ) 的条款。

数据分析

尺寸差异必须在表 1 指定的范围内，并根据实验者确定的 CQA 和 QC 参数。
体内荧光数据必须使用双向方差分析进行分析，如图 4 所示。使用GraphPad Prism 10.0.0软件进行统计分析和绘图。这些值表示为平均值±SEM。将 P 值 < 0.05 视为具有统计显着性。

全氟化碳纳米乳液 ( PFC-NE)的实验室级无菌测试。在 A) 胰蛋白酶大豆肉汤和 B) 液体巯基乙酸盐培养基中孵育 28 天之前和之后的 pH 值波动。使用t检验来确定 pH 值随时间变化的统计显着性。纳米乳剂通过了无菌认证，pH 值没有显着变化，培养基中没有浑浊度。

协议验证

M. Herneisey 和 JM Janjic* “治疗诊断全氟化碳纳米乳液的胶体和荧光稳定性的多重线性回归预测模型” Pharmaceutics 2023, 15 (4), 1103。
JM Nichols、CV Crelli 、L. Liu、HV Pham、JM Janjic*、AJ Shepherd*“利用用于近红外荧光成像和显微镜的双色纳米乳剂追踪糖尿病神经病变中的巨噬细胞”《神经炎症杂志》(2021)， Vo 。 18、文章编号：299。
纳米治疗在小鼠 CFA 炎症模型中揭示的性别差异” Theranostics 2020 ， 10（4），1694。
M. Herneisey、L. Liu、E. Lambert、N. Schmitz、S. Loftus 和 JM Janjic* 使用质量源于设计 (QbD) 方法开发治疗诊断全氟化碳纳米乳剂作为非阿片类止痛纳米药物模型AAPS PharmSciTech 2019 ， 20：65。

致谢

所提出的协议和工作得到了 CDMRP 奖项的部分支持：W81XWH-20-1-0854、W81XWH-20-1-0276、W81XWH-19-1-0828 和 W81XWH-20-1-0730。
使用 BioRender.com 创建的复合示意图。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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