材料与试剂

1.培养皿（90 mm × 15 mm）（Nest，目录号：752001）
2.聚丙烯微量离心管（2.0 mL）（Eppendorf， Biologix ，目录号：80-0020）
3.纸巾
4.锥形管（50 mL）（Falcon，目录号：602002-1）
5.锥形瓶 (250 mL)
6.烧杯（10 和 500 mL）（Glassco Aleman，目录号：229.202.02、229.202.08A ）
7.带螺旋盖的硼硅酸盐玻璃瓶，带橡胶/聚四氟乙烯内衬（250 mL）（Glassco，目录号：6679.269.245.01）
8.镍铬合金接种针（ Citoplus ，目录号：33210001B）
9.滤纸，孔径：3 μm （ Munktell Ahlstrom，目录号：391）
10.滤纸，孔径：10 μm （Ahlstrom Munksjo ，目录号：389）
11.雌蕊（ Axygen ，Pes15b）
12.岩心取样器（直径：5 毫米）
13.磁力搅拌棒（ Kartell TM ，目录号：0076800）

生物材料

1.裂褶菌公社神父。（ Fungario Universidad del Tolima；实验室收藏，菌株 030，凭证：LRD27）
2.香菇_ （左）神父。（ Fungario Universidad del Tolima；实验室收藏，菌株 147，凭证：ZF37）

试剂

1.琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：BCBS4444V，05040 ）
2.蛋白胨（EMD，Millipore，目录号：WM879031-906BD）
3.酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
4.麦芽提取物（OXOID，目录号：LP0039）
5.D-葡萄糖（EMD Millipore，目录号：K51794437 004）
6.D-蔗糖（Fisher Scientific，目录号：S5-500）
7.氢氧化钠（NaOH）（EMD Millipore，目录号：B1101198-436）
8.七水硫酸镁 (MgSO 4 · 7H 2 O)（Honeywell Specialty Chemicals Seelze，目录号：10314903）
9.七水硫酸铁 (II) (FeSO 4 · 7H 2 O)（Sigma-Aldrich，目录号：F7002）
10.硫酸铵 [(NH 4 ) 2 SO 4 ] ( PanReac Química SLU，目录号：A1032)
11.无水磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Mallinckrodt Baker，目录号：3252-01）
12.乙醇，96%（ Fábrica de Licores Tolima）

解决方案

1.麦芽琼脂培养基（参见食谱）
2.SYAMI 培养基（参见食谱）
3.氢氧化钠 (NaOH) 0.1 N （参见配方）

食谱

1.麦芽琼脂培养基
试剂最终浓度
蛋白胨3克/升
麦精30克/升
琼脂15克/升

2.SYAMI培养基
试剂最终浓度
MgSO 4 · 7H 2 O0.05克/升
K 2 HPO 42.0克/升
FeSO 4 · 7H 2 O0.2克/升
(NH 4 ) 2 SO 40.15克/升
酵母抽提物2.0克/升
碳源（葡萄糖或蔗糖）40克/升

3.氢氧化钠 (NaOH) 0.1 N
试剂数量
氢氧化钠1克
水分子_250毫升

设备

1.离心机（HERMLE Labortechnik GmbH，Z326K，目录号：311）
2.轨道摇床（IKA LABORTECHNIK，KS250 basic）
3.通风柜（ Jpinglobal ，目录号： JPCEGH1200-BB-PP）
4.卧式层流柜（Purificación y análisis defluidos ）
5.超低温冰箱，-85 °C（ Kaltis ，目录号： 390）
6.冷冻干燥机（Buchi，型号： Lyovapor L-200）
7.高压灭菌器（全美国，型号：1941X）
8.冰箱（COLDLINE，型号：FORTE V13-RHC）
9.Barnstead Smart2Pure UV/UF（ Thermo Scientific，类型：Smart2Pure 3 UV/UF）
10.热板磁力搅拌器（Stuart，目录号： UC152）
11.分析天平（KERN，型号：ACS 220-4）
12.搅拌机（Recco，型号：242748）
13.干燥炉（ Memmert ，目录号： ref 1470）
14.干燥器 ( Metacrilato 250 mm)
15.筛子（ Endecotts Ltd.，ASTM E-11，目录号： 65803- TAN AC8-1-1/2, 37,3）
16.硼硅酸盐玻璃过滤系统（Glassco，目录号：COL-764-260.202.01）
17.培养箱，28 °C（Binder，目录号：BD023UL）
18.pH 计（SI Analytics，型号： HandyLab 100）
19.水浴（Buchi，目录号：B-480）
软件和数据集

1.用于计算的 Microsoft Excel
2.RStudio 团队，2015。RStudio：马萨诸塞州波士顿 R. 的集成开发环境。网址： http: //www.rstudio.com/

程序

A.使用深层培养生产 EPS

1.S. commune和L. crinitus 培养物准备。
a.将 4 °C 蒸馏水储备中的每种真菌菌株接种到 90 mm × 15 mm 培养皿中的固体麦芽琼脂培养基上，并在 28 °C 下孵育，直至平板完全生长 4-7 天（参见图形概述，步骤 1 ））。也可以使用其他尺寸的培养皿。
b.完全生长后，用无菌核心取样器（直径 5 mm）切割固体麦芽琼脂培养基，并使用无菌镍铬合金接种针将每种真菌菌株的三个圆盘转移到 2.0 mL聚丙烯微量离心管中。
c.添加 1 mL 无菌蒸馏水，并使用雌蕊分散琼脂盘。另一种分散方法是使用不锈钢浸入式搅拌机 3 秒。
d.将混合物转移到含有 50 mL SYAMI 培养基的 250 mL Erlenmeyer 中，之前在 15 psi 下高压灭菌 15 分钟，并通过在 150 rpm 和 28°C 下摇动孵育 72 小时或其他特定时间；这个时间取决于所使用的实验设计和研究应变。例如， S. commune菌株在72 h时即可产生EPS，并在144 h时达到最大产量。 L. crinitus菌株在 144 h 即可产生 EPS。其他真菌香料可能需要更多时间来生产 EPS。
注意：在层流柜下工作。

B.EPS提取

1.中和和酶失活。
a.孵育时间后，将培养物添加到 500 mL 烧杯中并测量 pH 值。 pH 值可以在 4 到 5 之间。
b.以 2:1 的比例添加无菌蒸馏水（100 mL H 2 O 到 50 mL 培养物）。
c.使用浸入式搅拌机（两个脉冲）均质化培养物（菌丝体和液体）。
d.使用 NaOH (0.1 N) 中和混合物 (pH = 7.0)。
e.将混合物转移至250 mL 硼硅酸盐玻璃瓶中，并在 80°C 水浴中孵育 30 分钟。
通风橱下工作。
2.称量菌丝体生物量和 EPS。
a.将 20 mL 的混合物放入 50 mL 锥形管中。在以下步骤中，将确定菌丝体生物量和 EPS 的重量。
b.以 10,610× g离心30 分钟。
c.将上清液转移至新的 50 mL 锥形管中。以 1:1 的比例将冷乙醇 (99.8%) 添加到上清液中以沉淀 EPS。将此混合物和生物质颗粒储存在 4°C 下 12 小时。
d.沉淀EPS和生物质颗粒转移到定量滤纸盘上并将它们放在预先称重的100 mm × 15 mm 培养皿上。将每个样品放在不同的过滤器/培养皿上。
e.将培养皿在干燥炉中在 100–110°C 下孵育 2 小时。
f.将培养皿放入干燥器中 30 分钟。
g.随后，对每个样品（EPS 沉淀和生物质颗粒）的培养皿进行称重。
h.使用以下公式计算生物质和 EPS 的干重：
干重=(C-A) /( B-A) × 100
空滤纸/培养皿的重量，B是滤纸/培养皿与新鲜样品的重量，C是滤纸/培养皿与干燥样品的重量t 。
3.EPS净化。
a.使用定量滤纸（孔径：10μm ）过滤130mL得自步骤B1e的混合物。使用硼硅酸盐玻璃过滤系统。
b.使用定量纸（孔径：3 μm ）重复过滤步骤两次。使用硼硅酸盐玻璃过滤系统。这可以防止菌丝体小碎片的通过。
c.将混合物转移至 50 mL 锥形管中。
d.以 10,610× g离心30 分钟。
e.将上清液转移至 500 mL硼硅酸盐玻璃瓶中。
f.以 1:1 的比例添加冷乙醇 (96%) 以沉淀 EPS。在 4°C 孵育 12 小时（图 1a）。

图 1. 胞外多糖 (EPS) 的沉淀、冻干和溶解从大型真菌的深层培养物中获得

g.μm筛子分离 EPS 。 EPS 将悬挂在筛子顶部。使用筛子下的容器收集乙醇（参见图形概述，步骤 8、9 和 10）。也可以使用相同孔径的滤纸。
h.添加无菌蒸馏水并重复步骤 B3f 和 B3g。
i.将获得的 EPS 放入超低温冰箱中（-85°C，2 小时）。
j.冷冻干燥 EPS（参见表 1）。

大型真菌冻干参数胞外多糖（ EPS）
干料菌株冷冻参数烘干架温度调节腔室压力干燥时间
每股收益S. commune和L. crinitus-50℃高达 60 °C0.01毫巴72小时

k.确定冻干 EPS 的重量（图 1b）。

C.增溶

1.浓缩 EPS 溶液的制备。
a.在 50 mL 烧杯中称取 100 mg冻干 EPS。
b.添加 1.25 mL NaOH (0.1 N) 和 10 mL无菌蒸馏水。
c.使用磁力搅拌器溶解混合物1-2 小时。不要加热。
d.添加无菌蒸馏水至最终体积为 25 mL。
e.最终浓度为 4 mg/ mL。
f.NaOH 的最终浓度为 0.005 N。
g.您可以根据检测需要制备不同浓度的溶液。
h.考虑使用的 NaOH (0.1 N) 体积，因为它可以改变EPS 结构。在这种情况下，建议使用尽可能小的体积，并且最终浓度不超过 0.005 N。
i.准备好的 EPS 溶液可以储存在 4°C 下（图 1c）。

数据分析

1.建立使用深层培养进行 EPS 生产的实验设计。使用中心或因子设计，并使用方差分析或响应面方法 (RSM) 分析数据（ Cui 和Zhang，2012； Supramani等，2019；Yu 等，2022 ）。
2.考虑到 EPS 的生产受到多个变量的影响，例如接种物特性、时间和培养条件（Hamidi 等人，2022）。
3.使用培养基的阴性对照（无接种物）以供以后在设计中使用和计算生产参数。
4.碳源是EPS 生产最关键的变量之一。生产 EPS 时，使用至少两种不同的碳源非常重要，因为产量可能存在很大差异。本协议中建议使用葡萄糖或蔗糖；然而，可以使用其他常规和非常规来源。不同真菌物种的碳源浓度不同。本协议建议使用 40 g/L；然而，其他作者报告的ed值高达 120 g/L（Mahapatra 和 Banerjee，2013）。
5.在纯化过程中，过滤对于分离生物质残留物至关重要。 EPS 可用于测试细胞系或其他生物活性测定。
6.计算干 EPS、干生物量、容积生产率、比生产率、实际产量和回收效率（ Fariña等，1998； Q.Meng 等，2021 ）（表 2）。

深层培养生产胞外多糖 ( EPS)对应的发酵参数
参数方程
干EPS(克/升)
干生物质(克/升)
容积生产率 (VP)干EPS（g/L）/发酵时间（h）
具体生产力VP（克/升/小时）/干生物量（克/升）
实际产量干EPS (g/ L/ )/初始碳源底物(g/L)
回收效率冻干 EPS (g/L)/干 EPS (g / L)

7.使用 RStudio 或 MATLAB 分析数据。数据对应于表 2 中方程的确定。
8.和蛋白质来确定 EPS 的纯度。这些确定的方法可在Parimelazhagan (2016) 中找到。

协议验证

干 EPS 的结果如表 3 所示。结果以平均值±标准差的形式报告，本次工作的 n = 3。

大型真菌菌株深层培养产生的干胞外多糖 (EPS)的比较
大型真菌参考条件文化干EPS（克/升）
裂褶藻这部作品pH 5.5，SYAMI 培养基，40 g/L 蔗糖，7 天，150 rpm10.58±3.28
香菇_ （左）神父这部作品pH 5.5，SYAMI 培养基，7 天，40 g/L 蔗糖，150 rpm4.61±1.30
裂褶藻孟等人，2021pH-，种子培养基，6天，40克/升葡萄糖，1.0克/升吐温803.77
虎香菇（公牛。）神父。他等人，2016乳糖60g/L，酵母抽提物4g/L； pH = 5.0，12 天，0.2% 吐温 80。4.10 ±0.27

一般注意事项和故障排除

执行该协议所需的实验程序涉及使用与皮肤、眼睛和粘膜接触而着火和刺激的低风险化学物质，因此必须使用所有保护元件和安全措施来避免和防止事故。

致谢

这项研究得到了58653 号项目、 Alianza Columbia Científica 、 Gobierno Nacional de Columbia 和 Banco Mundial、Proyecto Betaglucanes 、 2018 年Contrato FP448442-211-2018 的支持。该协议改编自 Fariña 等人所做的工作。（2001）。我们感谢 Julia Fariña 博士、PROIMI、CABBIO 和 MINCIENCIAS 开设的课程，题为：“ Mycoprospecting ：从自然到生物技术产品”。生物反应器生产和下游加工。”

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

道德考虑

本研究中使用的标本是根据非商业目的获取生物资源的许可证（ Permiso Marco de Recolección，托利马大学 2018 年第 2191 号决议）和非商业目的获取遗传资源和衍生产品的合同而收集的。 -商业目的。 -商业目的（资源获取框架合同遗传学及其产品衍生品2020 年第 294 号。文件RGE0353-3，托利马大学）。

参考

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