材料与试剂

生物材料

拟南芥生态型哥伦比亚 (Col_0) 植物处于中花、完全开花和种子收获阶段(Boyes 等，2001) 。

实验室用品

1.精细中尖镊子/镊子（Fisher Scientific，目录号： 12-000-157）
2.培养皿（Fisher Scientific，目录号： FB0875712)
3.永久性墨水标记
4.纸巾（Fisher Scientific，目录号： 19-040-898）
5.胶带（Fisher Scientific，目录号： 15949）
6.X射线源： Kevex PXS10-16W MicroFocus系统
7.Boss LS-1416 CO 2激光切割机

设备

1.Inspex 20i X 射线机
对于 X 射线成像柜的定制制造，详细信息如图 1 所示。Inspex 20i X 射线机由Kodex Inc.（新泽西州纳特利）组装。

图 1.X 射线成像装置示意图。 (A) Inspex 20i X 射线机及所有配件的卡通草图。定制钢柜 (J) 尺寸为 64.77 厘米（深） × 127 厘米（高） × 78.74 厘米（宽），内衬铅板，符合佐治亚州的 BRH 21 CFR 1020.40 和 FDA 21 CFR 1020.40 X 射线辐射法规。 X 射线源 (G) 是Kevex PXS10-16W MicroFocus系统，可产生朝下的锥形束，以便可以在位于柜底部的Kodex LTX-1717 数字检测面板 (E) 上检测到阴影。这种非晶硅平板探测器的外层有一个碘化铯闪烁体，可以将 X 射线转换为光，然后由下面的光电二极管层数字化，传输到计算机并在屏幕上显示。微焦点系统允许通过改变源和探测器之间的样本高度来放大或缩小聚焦图像（靠近源会产生放大的图像）。将样本尽可能靠近光源 (G(a)) 会产生大约 9.5 mm 2的视场。邻近探测器 (E) 的视场约为 45 倍，为 431.8 mm 2 （探测器为 17 × 17 英寸）。柜外组件（红色）： (A) X 射线源电源； (B) 探测器的电源和数据传输单元； (C) 计算机渲染和保存图像； (D) X 射线机的不间断电源和浪涌抑制器。柜内组件（黑色）：（E） Kodex LTX-1717数字检测面板，E（w）宽度44.45厘米，E（d）深度44.45厘米，E（h）检测器与源之间的距离104.14厘米； (F) X 射线的锥束路径（照明锥体，53 ° ）； (G) Kevex PXS10 MicroFocus X 射线源（最大设置为 80 kV，0.100 mA）； (H) 图像采集快门触发器； (I) 用于查看图像的触摸屏显示器和键盘。（本研究的平均设置：本研究中的长角果标本放置在悬挂在检测器上方 98.4 厘米处的低密度塑料平台上，源在 40 kV 和 0.09 安培下运行）。 (二) 前门打开的 X 光机图片。

2.Inspex 20i X 射线机测量长角果/种子的秤
使用 Boss LS-1416 CO 2激光切割机 (70 W)从卡片纸（重量 90磅）上切割出的 X 射线半透明秤。我们这样做是因为在 X 射线图像中看不到固体塑料或金属尺上印刷的井号标记。我们使用 Adobe Illustrator 矢量绘图包设计了比例尺。仅切割毫米刻度和刻度的外部轮廓；毫米数字标记没有。激光切割机的切口宽度（又名井号线宽度）的平均值为 0.152 毫米。这比我们希望的要宽，但标记的中心非常准确。激光切割机的尺寸精度为± 0.0127 毫米，并且使用哈希标记中心的多个千分尺测量结果证实了这种高精度。由于在种子和长角果旁边可以看到比例尺及其哈希标记，因此它们被证明是一种简单、经济且可重复的校准 X 射线图像尺寸的方法。

软件和数据集

1.VetView Console：一体化工作站软件，用于图像采集、处理和编辑。
2.DaVinci Resolve 11：校准软件，作为脚本运行，用于在光源不提供照明时对从 X 射线探测器读取的数据进行暗校准。
3.FIJI ImageJ Build 2.13.1：该图像处理程序用于计算和测量长角果内种子的直径。
4.GraphPad Prism 版本 9.4.1：统计分析和图表生成。

程序

请参阅视频 1，了解详细说明该过程的 A、B 和 C 部分。

视频 1. 显示样品制备和 X 射线成像过程的视频教程

A.Inspex 20i X射线机中设置低密度塑料平台用于样品托盘（具体见图1、2）

图 2. Inspex 20i X 射线机的样品装载和准备情况。 (A) 湿纸巾上装有长角果样品的大培养皿。 (B) 装有两个长角果样品的小培养皿，并使用金属镊子放置刻度。 (C、D) 两端用胶带固定的低密度平台的横向 (C) 和俯视 (D) 视图。还显示了面板 B 中显示的带有长角果样品和刻度的培养皿。（E，F）X 射线源的电源，显示面板 F 中启用了 X 射线键。

1.拉动位于柜 J 中央右侧的金属闩锁，打开 X 射线机的前门。
2.将低密度塑料平台粘贴在源 G 下方约 3.5 厘米处。我们发现，当标本在低密度聚乙烯塑料薄膜制成的平台上成像时，可获得最高对比度的图像。这是因为这些薄膜相对于长角果、种子和纸校准标尺来说是射线透明的。然而，许多其他塑料，例如塑料培养皿中使用的聚苯乙烯和聚碳酸酯，也可以使用，效果良好。
3.推动金属闩锁手柄关闭前门，直至听到确认联锁系统已接合的咔嗒声。

B.Inspex 20i X 射线机的校准（详细信息见图 1 和图 2E-2F）

1.按下控制面板 A 上的电源开关，打开控制面板 A。
2.使用电源开关打开控制面板 B。
3.按电源按钮打开面板 C 以启动桌面。
4.在控制面板 A 上，逆时针转动金属钥匙至 ON 位置，然后按面板 A 上的绿色按钮。
注意：现在应该可以看到以下指示灯：红色表示 X 射线打开，黄色表示互锁，绿色闪烁表示主电源打开。详细信息请参见图 2。
5.等待 X 射线管装置预热约 10-15 分钟。
注意：作为预热程序的一部分，钢柜 J 上方的 X 射线标志将亮起，控制面板 A 上的数字（图 2F）将显示电压和电流（安培）逐渐增加。
6.系统完全准备就绪的标志是面板 A 上待机旁边的绿灯亮起，伏特和安培读数设置为 0，并且 X 射线标志关闭（图 2F）。
7.打开前门（参见步骤 B1）并确保柜 J 内的顶灯未点亮。如果指示灯熄灭，则关闭前门并继续执行下一步。
8.双击桌面上的暗校准选项卡即可运行暗校准。
笔记：
a.为了获得最佳图像对比度，需要执行此步骤。
b.作为此步骤的一部分，桌面屏幕上将出现一个弹出窗口，然后消失，表示步骤已完成。
9.重复步骤 B8。

C.Inspex 20i X 射线机收获拟南芥和成像程序（详细信息见图 1 和 2）

我们使用标准方法在土壤上种植拟南芥植物。此步骤是植物生物学中的标准程序，并且各种资源都是常见的。
1.用去离子水润湿一张纸巾并将其放入一个大培养皿中。
注意：整张纸巾都要湿，然后挤出多余的去离子水。
2.为了收获所需生长阶段的长角果（Boyes et al., 2001），使用镊子一次轻轻地拔出一颗长角果，并将其放入透明的培养皿中。
注意：强烈建议轻柔地处理干燥的长角果，因为它们容易分裂并释放种子。
3.使用细尖镊子取出带有蒂的长角果，并将其放在湿纸巾上，直到准备好进行下一步。
注意：长角果只能在湿纸巾上停留最多 1-2 分钟，因为较长的等待时间可能会引发干燥长角果的吸水。
4.将一颗角果转移到一个干净的小培养皿的底部。
注意：最多可以并排放置 5-6 个长角果以提高吞吐量。
5.将 1 厘米比例尺放在小培养皿中的长角果旁边。
6.打开柜 J 的前门，将小培养皿放在低密度塑料平台上。
注意：可能需要进行几次试运行来调整样本定位、焦点和整体图像质量。
7.关闭前门并打开桌面上的VetView控制台程序。
8.单击“新样品”选项卡并使用样品 ID 和样品名称框标记样品。
9.单击“捕获”并等待弹出窗口。
注意：确保新窗口设置为整个样本，然后单击“捕获”。
10.单击控制面板 A 上的绿色 ON 按钮。
11.在控制面板 A 上，使用数字屏幕下方的旋钮将伏特设置为 40.0，将安培设置为 0.09。
12.单击手持式 X 射线按钮 H。
13.当VetView程序显示“图像获取”时，单击控制面板 A 上的红色按钮关闭 X 射线束。
注意：此步骤可确保延长 X 射线灯泡的使用寿命。获取图像后，将 X 射线束打开的时间不超过一分钟。
14.图像将出现在桌面屏幕上，并在图像中心周围显示一个白色方块。
注意：白色方块是帮助图像居中并裁剪不必要的空白区域的工具。
15.通过左键单击选取框边缘并将其拖动以使样本在选取框框架内居中，确保样本和比例尺位于选取框内。
注意：可以通过拖动角或边来调整选取框的形状。
16.选择“接受图像”进行下游处理。
注意：要重新获取图像，请选择“拒绝图像”。通过调整带有长角果样品的小培养皿来重复步骤 D5。单击桌面屏幕上的编辑协议并从步骤 D9 开始。
17.接受所需的图像后， VetView控制台程序将重新配置到主页。
18.选择为样本提供的名称（步骤 D7）并单击打开研究。
注意：这将允许您右键单击来调整对比度。
19.VetView控制台程序的主页。
注意：在进行另一轮成像之前，请检查目标文件夹中保存的图像。
20.打开柜 J 的前门，从 X 射线机中取出装有长角样品的小培养皿。
21.重复步骤 D3–D18 以获取其他图像。
22.实验完成后，关闭 J 柜中的顶灯，并通过关闭桌面（面板 C）和控制面板 A 和 B 来关闭 X 射线机电源。
注意：关闭电源的顺序与 C 节中讨论的打开电源的顺序相反。

数据分析

结果

拟南芥长角果的传统组织学方法使用有机溶剂，并且通常需要 > 24 小时才能捕获图像。我们的新型 silique 成像工具通过使用 X 射线成像，可实现最少的样品处理和更快的实验周转时间。图 3 中的 X 射线图像和图 4 中所示的测量结果显示了使用 X 射线成像可视化处于不同发育阶段的拟南芥长角果的适用性和再现性。我们最初每次 X 射线曝光仅对单个长角果进行成像；然而，我们设置的视野允许在每次 X 射线曝光时以最高可用图像分辨率对至少四个长角果和一个比例尺进行成像（图 3）。此功能可实现更高的通量并减少实验之间的变异性。

图 3.带有比例尺的长角果图像。成熟阶段（干）长角果的代表性图像，刻度位于底部。白色比例尺（1 厘米）显示在图像的中心。
我们三个独立实验的结果表明，实验之间的种子计数和直径具有一致的可重复性（图 4）。总之，与依赖透明/固定试剂的传统长角果和种子可视化方法相比，定制 X 射线成像系统具有显着的优势。预计研究人员可能会采用这种新工具来对不同植物物种的长角果和种子发育进行成像。

图 4. 使用Inspex 20i X 射线机进行长角果和种子成像以及再现性统计测试。 Inspex 20i X 射线机拍摄的 (A) 幼年期、(B) 成熟期和 (C) 干燥期长角果的代表性图像。每个面板中的插图显示了不同成熟阶段的长角果的示例图像。 (D) 种子总数（y 轴）和 (E) 来自三个独立实验（x 轴 - 测试 1、2、3）的干长角果的种子直径（y 轴）（以毫米 (mm) 为单位）。每个测试中的中心粗体水平线代表中位数（D 组：26-28.5；E 组：0.39-0.41），而分布范围以数据点两端的水平小边缘显示。每个测试由 n > 20 个数据点表示，每个点代表每个测试平均 n > 30 个长角果。 D 组和 E 组的单向方差分析 P 值 > 0.05。

协议验证

通过提供支持声明的数据来验证该协议。请参阅图 4，面板 D 和 E，了解重复次数和统计测试的详细信息。

笔记

在我们的实验中，我们没有发现用暴露于 X 射线的种子培育的拟南芥植物有任何表型变化。

致谢

我们感谢瓦尔多斯塔州立大学、科学与数学学院以及生物系对本科生和教师研究的支持。
作者贡献： Brylie A Ritchie：进行实验、收集数据并撰写方法初稿； Theodore A Uyeno：设计X射线成像模块和比例尺，准备图形，撰写图形初稿以供审阅和编辑； Daniel F Rincon Diaz：进行实验、收集数据、撰写方法初稿并协助制作视频教程； Ansul Lokdarshi ：构思项目、绘制图表、分析数据、撰写、审查和编辑最终手稿。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Boyes, DC、Zayed, AM、Ascenzi, R.、McCaskill, AJ、Hoffman, NE、Davis, KR 和 Gorlach, J. (2001)。基于生长阶段的拟南芥表型分析：植物高通量功能基因组学模型。植物细胞13(7)：1499–1510。
Hedhly, A.、Vogler, H.、Eichenberger, C. 和 Grossniklaus, U. (2018)。拟南芥花器官和长角果的整体清洗和染色。 J. 维斯。过期。：e3791/56441。
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Kao, P. 和 Nodine, MD (2021)。扩大显微镜在拟南芥种子发育中的应用。见 Guichard, P. 和 Hamel , V.（编）。细胞生物学方法（第 181-195 页）。学术出版社。
普鲁内特 (Prunet)，N. 和邓肯 (Duncan)，K. (2020)。花卉成像：研究花卉发育的当前显微镜和断层扫描技术指南。 J.Exp。机器人。 71（10）：2898-2909。