材料与试剂

生物材料

大鼠 INS-1E 胰腺细胞（由蒙特利尔大学中心医院的 Marc Prentki 博士捐赠提供。细胞可来自 Accegen，目录号：ABC-TC233S）

试剂

N-乙基马来酰亚胺（NEM）（Sigma-Aldrich，目录号：E3876）
人胰岛淀粉样蛋白多肽（IAPP）（内部合成，可从金斯瑞订购，目录号：RP11278）
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY-NH 2
注：C2-C7 之间有二硫桥。
大鼠胰岛淀粉样蛋白多肽（rIAPP）（内部合成，可以从 Genscript 订购，目录号：RP11280）
KCNTATCATQRLANFLVRSSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH 2
注：C2-C7 之间有二硫桥。
钼酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：277908）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：AX1775）
磷标准品（Sigma-Aldrich，目录号：P3869）
硫酸，98% (H 2 SO 4 )（Sigma-Aldrich，目录号：258105））
过氧化氢，30% (H 2 O 2 )（Thermo Fisher，目录号：033323-AP）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma Aldrich，目录号：221465）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
HEPES，游离酸（Sigma-Aldrich，目录号：391314）
HEPES，1 M 溶液（Cytiva，目录号：SH30237.01）
丙酮酸钠（Cytiva，目录号：SH30239.01）
青霉素-链霉素，100 × （Cytiva，目录号：SV30010）
胎牛血清（FBS）（Cytiva，目录号：SH30070.03）
RPMI 1640，含 L-谷氨酰胺（Cytiva，目录号：SH30027.01）
Hank's 缓冲盐水溶液（HBSS），不含钙、镁和酚红（Cytiva，目录号：SH30588.01）
胰蛋白酶 1 ×含 0.05% EDTA（Wisent，目录号：325-042-CL）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
FAST-DiO（Invitrogen，Thermo Fisher，目录号：D3898）
FAST-DiI（Invitrogen，Thermo Fisher，目录号：D7756）
洗涤缓冲液（参见配方）
1 M 氢氧化钠 (NaOH)（参见配方）
巨型质膜囊泡 (GPMV) 缓冲液（参见配方）
3.5% m/v 钼酸铵 (IV)（参见配方）
10% m/v 抗坏血酸（参见配方）
完整的生长培养基（参见食谱）
8.9 NH 2 SO 4 （参见配方）
1 mg/mL FAST-DiO（参见配方）
1 mg/mL FAST-DiI （参见配方）

食谱

洗涤缓冲液
10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、2 mM CaCl 2 、pH 7.4
在烧杯中添加 400 mL 超纯（1 型）水。
溶解 HEPES (1.192 g)、NaCl (4.38 g) 和 CaCl 2 (0.111 g)。
使用 pH 计，在搅拌下缓慢添加 1 M NaOH，使 pH 值达到 7.4。
将溶液转移至 500 mL 容量瓶中，并添加超纯（1 型）水以完成体积。
使用前，该溶液必须通过层流防洪罩内的 0.2 μm PES 瓶式过滤器进行过滤。
将瓶子储存在 4°C 下。

1M 氢氧化钠
称出 4 克 NaOH 颗粒。
在烧杯中，添加 75 mL 超纯（1 型）水。
将 NaOH 颗粒缓慢添加到水中，同时搅拌直至完全溶解。
将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，并添加更多超纯（1 型）水以完成体积。
该溶液可在室温下储存在棕色玻璃瓶中。
注意： NaOH 的溶解是高度放热的。这必须慢慢进行以避免沸腾。对于较大体积，请考虑将混合烧杯置于冰上以避免产生过多热量。

GPMV缓冲液
10 mM HEPES、150 mM 氯化钠、2 mM CaCl 2 、2 mM NEM、pH 7.4
在 50 mL 锥形管中，添加 12.5 mg NEM。
用洗涤缓冲液填充至 50 mL 管线。
溶解后，使用前通过层流罩内的 0.22 μm 注射器尖端过滤器过滤该溶液。
注意：每次生产 GPMV 时必须新鲜制备该溶液，因为 NEM 在溶液中长时间不稳定。

3.5% m/v 钼酸铵 (IV)
在 100 mL 容量瓶中，添加 3.5 g 钼酸铵 (IV)。
添加 50 mL 超纯（1 型）水并确保固体完全溶解。
用超纯水（1 类）填充至 100 mL 线。
转移至棕色玻璃瓶中并储存在 4°C 下。

10% m/v 抗坏血酸
在 100 mL 容量瓶中，添加 10.0 g 抗坏血酸。
添加 50 mL 纳米纯水并确保固体完全溶解。
用纳米纯水将其余部分填充至 100 mL 线。
转移至棕色玻璃瓶中并储存在 4°C 下。

完整的生长培养基
RPMI 1640、100 U/mL 笔链球菌、10% FBS、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、50 mM β-巯基乙醇
在层流罩内，将以下物质添加到 500 mL 的 RPMI 1640 瓶中：
5 mL 青霉素-链霉素 (100 × )。
50 mL 的胎牛血清。
5 mL 的 HEPES (1 M)。
5 mL 丙酮酸钠 (100 mM)。
1.75 μL β-巯基乙醇。注意： β-巯基乙醇有强烈气味。使用本产品前确保足够的通风。
将此介质储存在 4°C 下。
注意：在无菌条件下工作对于避免污染细胞培养物至关重要。

8.9 NH 2 SO 4
将 75.8 mL 纳米纯水量入玻璃瓶中。
缓慢添加 24.2 mL 浓 (95%–98%) H 2 SO 4 。注意： H 2 SO 4的稀释是放热的，应小心操作。将溶液置于冰上并持续搅拌，同时缓慢添加酸。

1 毫克/毫升 FAST-DiO
用 1.0 mL DMSO 溶解 1.0 mg FAST-DiO。
通过将 50 μL 分配到单独的 0.5 mL 微量离心管中来制备该主溶液的等分试样。
注意：该化合物对光敏感，特别是当未掺入脂质双层时。尽量减少暴露在环境光下。使用较小的等分试样可以最大限度地减少每个等分试样的冷冻/解冻循环次数。

1 毫克/毫升 FAST-DiI
用 1.0 mL DMSO 溶解 1.0 mg FAST-DiO。
通过将 50 μL 分配到单独的 0.5 mL 微量离心管中来制备该主溶液的等分试样。
注意：该化合物对光敏感，特别是当未掺入脂质双层时。尽量减少暴露在环境光下。使用较小的等分试样可以最大限度地减少每个等分试样的冷冻/解冻循环次数。

实验室用品

96孔微孔板，黑色，非结合表面，透明底部（Corning，目录号：3651）
硅胶微孔板盖（Corning，目录号：3090）
100毫米组织培养皿（Sarstedt，目录号：3902）
150毫米组织培养皿（Sarstedt，目录号：3903）
2 mL血清移液器（Sarstedt，目录号：1252025）
5 mL血清移液器（Sarstedt，目录号：1253025）
10 mL血清移液器（Sarstedt，目录号：1254025）
25 mL血清移液器（Sarstedt，目录号：1685020）
15 mL 锥形离心管（Sarstedt，目录号：62.554.100）
50 mL 锥形离心管（Sarstedt，目录号：62.547.004）
0.5 mL 微量离心管（Sarstedt，目录号：72.704）
100 kDa 离心过滤装置（Amicon，Millipore，目录号：UFC910024）
0.2 μm PES 瓶式过滤器装置（ThermoFisher，目录号：569-0020）
10 mL 注射器（BD，目录号：309604）
0.22 μm 注射器过滤器（Sarstedt，目录号：83.1826.001）
16 mm × 150 mm 玻璃反应管（VWR，目录号：47729-580）
12 mm × 75 mm 玻璃反应管（VWR，目录号：47729-570）
适用于 12 mm × 75 mm 反应管的塑料塞（VWR，目录号：60819-003）
棕色玻璃瓶（Sigma-Aldrich，目录号：DWK218062454）
带硅胶密封件的微孔板盖（Corning，目录号：07-200-699）
18 G 针（BD 精密滑轨，目录号：305195）

设备

酶标仪（Molecules、Spectramax i3）
带吊桶转子 (S41*) 的离心机（Thermo，IEC CL30）
层流罩（VWR Microzone）
培养箱（Thermo、Heracell 150i）
热板（Fisherbrand、Isotemp）
铝加热块（Thermo Fisher，目录号：88880136）
pH 计（Fisherbrand、Accumet AE150）
微量移液器（Gilson Pipetteman P200，目录号：F144058M）
涡旋混合器（Scientific Industries vortex genie-2，目录号：SI-0236）
金属碗或玻璃烧杯，足够大以容纳试管架，并且能够在 100 °C 下加热。如果有的话可以替换为水浴

软件和数据集

Prism 8（GraphPad）
Excel、Office 16（微软）

程序

细胞培养

从液氮储存中取出一份 10 6 INS-1E 细胞，并在室温下缓慢解冻。一旦细胞变暖到可以安全处理的程度，就可以通过在双手之间来回滚动管子来进一步加热管子。注意：液氮温度足够低，长时间接触会造成皮肤损伤。处理液氮时穿戴适当的个人防护装备。
解冻后，在层流罩下工作并保持无菌条件。将细胞转移至 15 mL 锥形管中，加入 10 mL 生长培养基，预热至 37°C。室温下将细胞以 500× g离心 5 分钟，并除去上清液。
将 10 6 个细胞重悬于 10 mL 37°C 完全生长培养基中，并转移至 100 mm 组织培养皿中。将培养皿存放在 37°C、5% CO 2的培养箱内。
两天后，传代细胞：
取出旧的生长介质，并用 2 × 5 mL 的 37°C HBSS 冲洗。
除去 HBSS 后，添加 2 mL 37°C 胰蛋白酶，并在 37°C 下孵育细胞 5 分钟。
回收细胞并用 5 mL 37°C 生长培养基灭活胰蛋白酶。
将细胞收集在 15 mL 锥形管中，并在室温下以500× g离心 5 分钟。
丢弃上清液并将细胞沉淀重新悬浮在 10 mL 37°C 生长介质中。
将细胞转移到新的组织培养皿中，然后将其放回培养箱。
每天检查细胞直至达到 80% 汇合并再次传代。
传代3次后，将细胞（15×10 6 个细胞）均匀分入两个100mm培养皿中。
两天后，检查融合情况。如果细胞融合度低于 80%，请再等一天。
一旦细胞达到 ≥ 80% 汇合（≥ 15 × 10 6 个细胞），将细胞从一个 100 mm 培养皿转移到 150 mm 培养皿中。将第二个培养皿分成两个 100 mm 培养皿（每个 7.5 × 10 6 个细胞）。
一个培养皿用作继续培养物生长的储备，另一个培养皿用作产生 GPMV 的细胞来源。在培养箱中保持这些正常，根据需要更换培养基并分裂细胞。
让150 mm培养皿中的细胞达到≥80%汇合度（≥33×10 6 个细胞），并将其均匀分入两个150 mm培养皿中。这两个 150 毫米培养皿将在下一步中用于生产 GPMV。将这两个 150 mm 培养皿置于培养箱中，温度为 37 °C，含 5% CO 2 。
图 1 以图形方式总结了该过程。
注意：在无菌条件下工作对于避免污染细胞培养物至关重要。

图 1. 细胞培养和分裂以制备用于巨质膜囊泡 (GPMV) 生产的细胞的示意图

GPMV形成

一旦两个 150 mm 培养皿达到 80% 汇合（33 × 10 6 个细胞），即可从培养箱中取出它们。丢弃旧的生长培养基，并用 10 mL 的 37°C HBSS 清洗细胞两次。
丢弃 HBSS，并用 10 mL 的 37°C 洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
丢弃洗涤缓冲液，并向细胞中添加 5 mL 37°C GPMV 缓冲液。
注意：GPMV 缓冲液必须在每次使用前新鲜配制，因为 NEM 在溶液中长时间不稳定。 NEM 被选为 GPMV 诱导剂，因为它具有诱导 GPMV 形成的强大能力且对肽聚集的影响较小。与其他 GPMV 诱导剂不同，NEM 不会交联蛋白质，而是烷基化游离半胱氨酸（Scott，1976；Erdinc Sezgin，2022；I. Levental 等，2010；KR Levental 和 Levental，2015）。
2下将细胞在 GPMV 缓冲液中孵育 2 小时。
从培养箱中取出两个 150 mm 培养皿，并小心地将含有 GPMV 的细胞上方的液体收集到每个培养皿的一个 15 mL 锥形管中。
将 GPMV在室温下以 500× g离心 5 分钟，以沉淀任何细胞碎片。将含有 GPMV 的上清液转移到两个空的 15 mL 锥形管中。

GPMV 标记

向装有 GPMV 的 15 mL 锥形管中添加 5 L 的 FAST-DiO 溶液 (1 mg/mL)，最终浓度为 1 μg/mL，并轻轻地来回摇动管 10 秒以混合。向第二个管中添加 2 μL FAST-DiI 溶液 (1 mg/mL)，终浓度为 0.4 μg/mL，并轻轻来回摇动管 10 秒以混合。
注意：FAST-DiO 和 FAST-DiI 原液对光敏感。为避免荧光团降解，请在光线昏暗的环境中工作。
在 37°C 下孵育 GPMV 2 小时以完成标记。
从培养箱中回收两个管，并将每个管的内容物转移到 100 kD Amicon 离心过滤装置中，以浓缩 GPMV 并减少任何未掺入的示踪剂的量。
将 Amicon 装置在 400× g下离心 1 分钟，并验证过滤装置中剩余的体积，确保整个体积不会通过。重复这些短暂的离心，直到每个单元中剩余 500 μL。
图 2 以图形方式总结了该过程。

图 2. 分离和标记由培养细胞形成的巨型质膜囊泡 (GPMV) 的工作流程

使用 P200 移液器小心地回收保留在过滤器单元中的 GPMV，将标记的膜转移到 1.5 mL 微量离心管中。以这种方式制备的 GPMV 应在 48 小时内使用，如果需要，可以储存在 4 °C。
注意：虽然 FAST-DiO 和 FAST-DiI 在掺入膜后对光降解不是特别敏感，但最好避免不必要的环境光暴露。

总磷测定

为了确保实验的重现性并准确量化 GPMV 与肽之间的比率，可以通过总磷测定来测量 GPMV 悬浮液中磷脂的浓度。
在热板上将铝块预热至 210 °C。
使用 12 mm × 75 mm 玻璃管，使用磷酸盐标准试剂制备校准曲线。建议数量请参见表 1。

4 3-标准磷含量
P含量（μmol）4 3-标准品体积(μL)
0.000000
0.0065010
0.0162525
0.0325050
0.0487575
0.06500100

将 100 μL 的每种 GPMV 悬浮液转移到 12 mm × 75 mm 玻璃管中。
将 450 μL 8.9 NH 2 SO 4添加到所有管中。
对于要分析的每个标准品和样品，用 18 G 针刺穿塑料塞五次，以防止在后续步骤中压力积聚。
将铝块上的管加热 25 分钟，确保温度保持在 200 至 220 °C 之间。该反应用于消化样品中的有机物。
取出管子并冷却 5 分钟，直至可以处理。向每个管中添加 150 μL H 2 O 2 ，盖上盖子，并在相同温度下加热 30 分钟。该反应用于去除由于有机材料的消化而可能在反应管中形成的任何深色。
将管子从火上移开，让它们在室温下冷却。同时，将一金属碗水在电炉上煮沸，准备 100°C 水浴。
注意：重要的是碗足够大，可以同时将所有反应管放入其中。这可以使用塑料试管架来完成。
使用 P1000 微量移液器将每个管中的残留液体转移到干净的 16 mm × 150 mm 玻璃管中。
添加 500 μL 10% 抗坏血酸、500 μL 3.5% 钼酸铵 (IV) 和 3.9 mL 纳米纯水。
轻轻涡旋样品，用玻璃弹盖住每个管，并在水浴中加热 7 分钟。在这里，抗坏血酸对混合物的还原使得磷和钼酸铵之间发生比色反应。
让管冷却 5 分钟，然后将每管 200 μL 转移到 96 孔微孔板中。测量每个孔在 820 nm 处的吸光度，并使用线性回归计算磷酸盐的浓度。详细信息请参阅数据分析部分。注意：热 H 2 SO 4和 H 2 O 2具有腐蚀性，应小心处理。使用手套、实验服、安全眼镜，并在化学通风柜内工作。

荧光共振能量转移动力学

使用从 D 获得的磷脂浓度，在 GPMV 缓冲液中制备 2 倍浓度（100、25 和 6.25 μM）的 GPMV 稀释液。
将 50 μL 每种混合 GPMV 悬浮液转移至 96 孔微孔板（黑色、非结合表面、透明底部），一式三份。重要提示：准备适当的空白以便之后能够标准化数据至关重要。
向每个 GPMV 样品中添加 50 μL GPMV 缓冲液（空白）、以 25 μM 新溶解在 GPMV 缓冲液中的 IAPP，或以 25 μM 新溶解在 GPMV 缓冲液中的大鼠 IAPP（对照肽）。
用硅胶盖盖住微孔板以防止蒸发。
在读板器中，每 10 分钟测量一次 FRET 产生的荧光（λ激发= 485 nm，λ发射= 570 nm）。对动力学进行编程，执行 5 秒的单次搅拌，然后以 10 分钟的间隔记录板底部的荧光强度，持续 24 小时，并在中等设置下获得增益。
注意：虽然该方案是为了检测与淀粉样蛋白生成肽相关的质膜损伤而开发的，但它也可能适用于其他非淀粉样蛋白生成肽。此外，淀粉样肽的聚集可能对实验过程中进行的测量次数敏感。因此，强烈建议测量的井数和收集数据点的频率保持一致。

数据分析

线性回归

使用总磷测定过程中测得的光密度，通过绘制光密度与 6 个标准品的 Pi 量 (μmol) 的关系来进行线性回归。示例数据如下所示（表 2、图 3）。使用这些数据点，拟合线性函数并显示回归的斜率、截距和相关值。

表2 总磷测定后得到的标准曲线
Pi 标准品 (μL)Pi (微摩尔)820nm 处的吸光度
00.000000.0525
100.006500.0768
250.016250.1047
500.032500.1477
750.048750.1919
1000.065000.2558

图 3. 总磷测定的线性回归

根据图 3 中的线性回归，可以使用以下方程计算 GPMV 样品的 Pi 含量。

OD = slope×Qty Pi + intercept

Qty Pi=(OD-intercept)/slope

Conc_GPMVs (μM)=((Pi μmol)/(100 μL))×10^6

从这些计算中获得的值如下表 3 所示，最终 Pi 浓度以绿色突出显示。这些值直接对应于磷脂浓度。
表3. 从线性回归获得的样本值
样本使用体积（μL）外径820nmPi (微摩尔)Pi (μmol/μL)π (μM)
GPMV1000.09580.014031.4036×10 -4 140.4
GPMV FDiO750.07640.007581.0102×10 -4101.0
GPMV FDII750.08220.009511.2677×10 -4126.8

荧光共振能量转移动力学

计算相应三孔中每个样品的荧光值的平均值。
按以下等式所述对每次测量的平均数据进行归一化，其中 F空白是缓冲液中 GPMV 中测量的荧光强度，F处理是用人或大鼠 IAPP 处理的 GPMV 的荧光。

F_norm=F_treated/F_blank

使用 GraphPad Prism 使用玻尔兹曼 S 形曲线拟合数据，方法是选择在分析区域中使用非线性回归拟合曲线，并在Prism 早期版本的经典方程部分中查找玻尔兹曼 S 形函数，如图 4 所示。也可以使用以下等式在 Excel 或任何其他绘图软件中完成：

f(x)= F_min+(F_max-F_min)/(1+e^((V_50-x)/k) )

图 4. 从 FAST-DiO 和 FAST-DiI 标记的巨型质膜囊泡 (GPMV) 获得的代表性荧光共振能量转移 (FRET) 动力学

从拟合中，可以提取并比较动力学参数，例如顶部和底部荧光值、速率 k 和半峰时间 V 50 ，如下图 5 所示。为了比较两个肽之间的值，可以使用学生t检验或方差分析，具体取决于分析的条件数量。

图 5. 从玻尔兹曼 S 形拟合中提取的动力学参数与图 4 中的数据进行拟合

协议验证

Sebastiao的图 10 中查看等人。（2023）。从独立的 GPMV 制剂中一式三份获得数据。非淀粉样蛋白形成大鼠 IAPP 在所有测试中用作控制变量，并且在不存在任何肽的情况下针对相应的膜对 FRET 值进行标准化。使用双向方差分析 (GraphPad Prism 8) 对从 S 形拟合中提取的值进行统计分析。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

大鼠 INS-1E 细胞的保存时间不应超过 20 代，以确保产生的 GPMV 的可靠性和质量。
该过程也适用于其他细胞系。它是使用中国仓鼠卵巢细胞 (CHO-K1) 完成的，未经任何修改(Quittot 等人，2021）。对于其他细胞系，可能需要优化 GPMV 生产。
由于淀粉样蛋白自组装的敏感性，保持所有参数尽可能一致非常重要。即使改变动力学测定过程中进行的测量次数或频率也可以改变淀粉样蛋白肽的聚集行为（Sebastiao 等人，2017）。

故障排除（表 4）

表4. 故障排除
问题解决方案
总磷测定中未检测到磷脂囊泡可能被稀释。使用大于 100 μL 的体积或使用 Amicon 进一步浓缩囊泡。
检测到 FRET 信号不足将 FAST-DiO 的量从 5 μL 增加到 10 μL。
动力学有噪音该过程本质上对许多实验参数敏感。确保所有肽溶液在添加到 GPMV 之前已正确单体化并完全溶解。
无法拟合 sigmoidal 函数乙状结肠反应是淀粉样蛋白聚集的典型反应。它不一定是相关膜破坏的反应。如果需要，选择不同的模型来拟合数据。
致谢

这项工作得到了国家科学与工程研究委员会 (NSERC) 和魁北克自然与技术研究基金 (FRQNT) 的支持。该协议改编自以前的工作（Sebastiao 等人，2023）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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