材料与试剂

真菌和细菌菌株

1.待测真菌菌株 [ Serpula lacrymans ，产地：因斯布鲁克，无。 1SLIBK2018 （Embacher 等人。，2021） ]
2.待测试的细菌菌株[例如，微杆菌属。（恩巴赫等人。、 2021 年和 2022） ]

材料

1.蒸压木块 (50 mm × 25 mm × 15 mm)（例如云杉冷杉;一个实验的所有块都应来自同一批次木材）
2.装有 25 mL 麦芽提取物琼脂的容器（88 mm 高，Ø 75 mm，体积 300 mL，例如 ROTILABO ® ，目录号：EP28.1）
3.培养皿 94 mm × 16 mm，无通风口（Greiner Bio-One，目录号：632180）
4.待测试的预培养细菌分离株
5.预培养的待测真菌菌株（例如木材腐烂真菌S. lacrymans ）
6.Fisherbrand TM Easy Reader TM锥形离心管 15 mL，PP（Fisher Scientific，目录号： 11819650）
7.无菌牙签
8.1.5 mL微量离心管（ Greiner Bio-One，目录号：616201）

试剂

1.酪蛋白胨（Roth ，目录号： 8952.2）
2.大豆蛋白胨（Roth ，目录号： 2365.2）
3.氯化钠（Roth ，目录号： 0601.1）
4.琼脂（Roth ，目录号： 5210.2）
5.麦芽提取物（Roth ，目录号： X976.2）
6.水分子_
7.D（+）-葡萄糖一水合物（Roth ，目录号： 6780.1）
8.(NH 4 ) 2 HPO 4 （Roth ，目录号： P736.1）
9.KH 2 PO 4 （罗斯，目录号： 3904.1）
10.MgSO 4 · 7H 2 O （Roth ，目录号： T888.1）
11.CaCl 2 ·2H 2 O （Roth ，目录号： T885.1）
12.FeCl 3 （Roth ，目录号： 5192.1）
13.硫胺素HCl（Roth ，目录号： T911.1）
14.EDTA二钠盐（Roth ，目录号： 8043.1）
15.ZnSO 4 ·7H 2 O （Roth ，目录号： K301.2）
16.H 3 BO 3 （Roth ，目录号： 5935.1）
17.MnCl 2 ·4H 2 O （Roth ，目录号： 0276.1）
18.CoCl 2 ·6H 2 O （Roth ，目录号： 7095.1）
19.CuSO 4 · 5H 2 O（Roth ，目录号： 8175.6）
20.(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O（Roth ，目录号： 7311.1）
21.FeSO 4 · 7H 2 O（Roth ，目录号： P015.1）
22.KOH（Roth ，目录号： 6751.1）
23.氢氧化钠 (9356.1)
24.PCR试剂：
a.Red Taq 2 × DNA 聚合酶预混液（VWR，Radnor，美国）
b.引物 27F (5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC A-3') 和 1492R (5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')（均为 10 μM ）
c.蒸馏水
d.牛血清白蛋白（BSA）2％[（Roth，目录号：3854.2）；另请参阅（Embacher 等人。，2021） ]
25.用于凝胶电泳系统的1%琼脂糖凝胶[例如，琼脂糖粉末（Sigma，目录号：A9539）]
26.聚乙二醇 6000 (PEG) 20%（Roth ，目录号： 0158.1）
27.80% 乙醇 (-20 °C)
28.无核酸酶水
29.胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 平板（参见食谱）
30.TSA 软琼脂（收获当天新鲜制备，保存在 ~50 °C 直至使用）（参见食谱）
31.液体胰蛋白胨大豆 (TS) 培养基（参见食谱）
32.麦芽提取物琼脂 (MEA)（参见食谱）
33.改良 Melin- Norkrans (MMN)（参见食谱）
34.赫特纳的微量金属（参见食谱）
35.0.85% 氯化钠溶液（参见配方）
36.硼酸钠缓冲液（20 × 库存溶液，pH 8）（用于琼脂糖凝胶电泳，请参见配方）

食谱

1.胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA ) 平板
酪蛋白胨 1.5%（w/v），15 克
大豆蛋白胨 0.5%（w/v），5 克
氯化钠 0.5%（重量/体积），5 克
琼脂 1.8%（w/v），18 克
dH 2 O，加起来为1 L
（pH= 7.3±0.2）
准备 TSA 培养基，高压灭菌（120°C），使其冷却，倒入培养皿中，冷却至室温（RT）。储存于 4°C。

2.TSA软琼脂
酪蛋白胨 1.5%（w/v），15 克
大豆蛋白胨 0.5%（w/v），5 克
氯化钠 0.5%（重量/体积），5 克
琼脂 0.7%（w/v），7 克
dH 2 O，加起来为1 L
（pH= 7.3±0.2）
准备 TSA 介质和高压灭菌器 (120 °C)。储存在 ~50 °C 下，直至用于 Koch 后的板铸造。

3.液体胰蛋白胨大豆 TS 培养基
酪蛋白胨 1.5%（w/v），15 克
大豆蛋白胨 0.5%（w/v），5 克
氯化钠 0.5%（重量/体积），5 克
dH 2 O，加起来为1 L
（pH= 7.3±0.2）
准备TS液体培养基，高压灭菌器（120°C），并使其冷却。储存于 4°C。

4.麦芽提取物琼脂 (MEA)
麦芽提取物 3%（w/v），30 克
大豆蛋白胨 0.3%（w/v），3 克
琼脂 1.8%（w/v），18 克
dH 2 O，加起来为1 L
（pH= 3.5±0.2）
准备MEA介质，高压灭菌器（120°C），并冷却至50°C。倒入培养皿中并冷却至室温。储存于 4°C。

5.改良的 Melin- Norkrans (MMN) [根据 Tauber 等人。 (2016) ]
葡萄糖，5 克
(NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.25 克
KH 2 PO 4 , 0.5 克
MgSO 4 · 7H 2 O， 0.15克
CaCl 2 · 2H 2 O, 0.067 克
氯化钠，0.025 克
FeCl 3 (1%), 1.2 mL
硫胺素-HCl (10%), 1 µL
Hutner 痕量金属 (0.01 × )，100 µL
琼脂，20 克
dH 2 O，加起来为1 L
（pH值= 5.6）
制备 FeCl 3 、硫胺素-HCl (10%) 和 Hutner 微量金属 (0.01 × ) (Hutner 等人， 1950）分别。将它们添加到介质中，同时在旋转摇床上混合。测量 pH（必要时进行调整）并将介质调整至 1,000 mL。 120°C 高压灭菌，冷却，倒入培养皿中，冷却至室温。储存于 4°C。

6.赫特纳的微量金属
EDTA 二钠盐，50 g 溶于 250 mL dH 2 O
ZnSO 4 · 7H 2 O，22 g 溶于 100 mL
H 3 BO 3 ，11.4 克，200 毫升
MnCl 2 · 4H 2 O，5.06 g 溶于 50 mL
CoCl 2 · 6H 2 O，1.61 g 溶于 50 mL
CuSO 4 · 5H 2 O，1.57 克，溶于 50 毫升
(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O，1.10 g 溶于 50 mL
FeSO 4 · 7H 2 O，4.99 克，50 毫升
20% KOH 溶液（重量/体积）
对于 1 L 最终混合物，将每种组分溶解在指定体积的水中。 EDTA应溶解在沸水中，最后配制FeSO 4 · 7H 2 O以避免氧化。
混合除 EDTA 之外的所有溶液。煮沸，然后加入 EDTA 溶液。混合物的颜色变成绿色。当所有物质溶解后，冷却至 70°C。在保持温度在 70°C 的同时，添加 85 mL 热 KOH (20%)。冷却至室温并填充至 1 L 最终体积。用棉塞封闭烧瓶（允许空气交换）并每天旋转一次，同时孵育 1-2 周。通常，溶液最初是清澈的绿色，但在接下来的几天内变成深红色或紫色，留下铁锈棕色沉淀物。如果没有沉淀形成或溶液保持绿色，请检查 pH 值（应约为 6.7；如果偏差较大，请尝试添加 KOH 或 HCl 进行调整）。
通过两层 Whatman #1 滤纸过滤，如有必要，重复操作，直至溶液澄清。以方便的等份形式冷藏或冷冻储存。

7.0.85% 氯化钠溶液
氯化钠 0.85%（w/v），8.5 克
dH 2 O，加起来为1 L
准备溶液、高压灭菌器（120°C）并冷却。储存于室温。

8.硼酸钠缓冲液（20 ×原液，pH = 8）
硼酸，48 g（浓度 1 M）
NaOH 颗粒，8 克
dH 2 O ，加起来为 1 L
制备 900 mL dH 2 O，并向溶液中添加硼酸和氢氧化钠。搅拌直至所有固体溶解。添加硼酸或 NaOH 将 pH 调节至 8。用 dH 2 O填充至 1 L。
将 20 ×储备液稀释至 1 × （可用于琼脂糖凝胶的制备和凝胶槽中）。

设备

1.Eppendorf 离心机 5810，配备 A-4-81 转子（Eppendorf SE，汉堡，德国）
2.Heraeus Fresco TM 17 微量离心机配备 24 × 1.5/2.0 mL 转子和ClickSeal TM生物防护盖（ Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
3.计数室Thoma （深度：0.01 mm，0.0025 mm 2 ， Assistance ， Glaswarenfabrik Karl Hecht，Sondheim vor der Rhön ，德国）
4.高压灭菌器（HMC Europe，HICLAVE ，目录号：HGS-133）
5.培养箱（温度范围：10–30 °C，例如，Heraeus Vötsch，维也纳，奥地利）
6.台式轨道培养摇床（New Brunswick Scientific，Edison，型号：Innova ® 40/40R）
7.耐化学腐蚀隔膜真空泵型号 N810 FT.18（KNF LABOPORT，德国汉堡）
8.真空过滤歧管和无菌过滤漏斗（Millipore Sigma TM 、 Microfi l ® 、Merck Millipore Billerica，美国）
9.硝化纤维过滤器（0.45 μm ；直径 47 mm，部件号：1215230，GVS North America，桑福德，美国）
10.REAX2 型顶置摇床（ Heidolph Instruments，型号：541 - 21001 - 00）
11.加热烤箱，3.8 立方英尺，230 VAC（ Memmert ，UNB500/230 基本烤箱）
12.天平（PM4600 DeltaRange ® ，梅特勒-托利多，维也纳，奥地利）
13.微生物安全柜（Platinum SF， Kojair Tech Oy， Mänttä-Vilppula ，芬兰）
14.纸箱包装（保证黑暗孵化）
15.无菌玻璃培养皿（100 mm × 20 mm Rotilabo ® ，Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国）
16.无菌钳子
17.可消毒冲头（例如，提供约 0.8 厘米× 0.7 厘米× 1.1 厘米的塞子）
18.镊子
19.PCR 循环仪（Primus 96 高级、 Peqlab 生物技术，埃尔兰根，德国）
20.水平凝胶电泳系统（ RunOne TM Electrophoresis Cell， Embi Tech，圣地亚哥，美国）
21.Gel Doc TM EZ 成像仪 30016395-0000 171800（Bio-Rad Laboratories，Hercules，加利福尼亚州，美国）
22.Thermomixer ® Comfort 5355（Eppendorf SE，德国汉堡）

软件

1.微软 Excel 版本 2209
2.RStudio 版本 4.0.3 (2020-10-10)

程序

A.确定木块上细菌活力的预实验

1.在 5 mL 的 TS 液体培养基中过夜培养细菌分离株（25°C，220 rpm，不受控制的光/暗条件）。
2.收获细菌并用 1 mL 0.85% NaCl 溶液洗涤（3 × ，5,900 × g离心10 分钟）。
3.使用Thoma室用0.85% NaCl 溶液将细菌悬浮液调节至 10 8 CFU/mL （最终体积最小 10 mL）。
4.将高压灭菌的木块浸入细菌悬浮液中，并在无菌玻璃培养皿中于 25°C 下孵育过夜。
5.第二天，使用消毒镊子将木块轻轻压在 TSA 板上。移除木块。 25°C 孵育过夜至 24 小时。
6.如果细菌在 TSA 板上快速生长，则它们可用于主要实验。

B.主要实验的准备

1.在固体琼脂培养基上建立真菌（图 1；此处， S. lacrymans在改良的 Melin- Norkrans (MMN) 上于 25°C预培养3-4 周）。

图1。建立了S. lacrymans培养。箭头：外围区域

2.将菌丝体覆盖的琼脂塞（使用可消毒的冲头，〜0.8厘米× 0.7厘米× 1.1厘米）添加到装有25 mL MEA介质的容器中。
注意：使用预培养物的外围区域。留出一些船只，因为它们用作控制（图1）。
3.在黑暗中孵育四个星期 (25 °C)。
同时：
4.对木块进行编号（50 ± 0.5 mm × 25 ± 0.5 mm × 15 ± 0.5 mm，例如来自云杉的木块）冷杉）。
5.对木块进行高压灭菌（120°C）并记下其重量（保持无菌条件，例如将天平放在无菌工作台下）。使用前将它们保存在无菌环境中。
a.将至少四个湿度控制样本木块放入烤箱中，并在 ~50°C 下干燥 72 小时。
b.称重并记录控湿木块的干质量。
6.对玻璃培养皿进行编号和称重。

C.主要实验的设置

1.在真菌培养物准备好之前大约 2-3 天开始准备细菌。将它们培养在 TSA 培养基（25°C）上。
2.用细菌接种 5 mL 液体 TS 培养基（25°C，220 rpm，过夜）。
3.NaCl溶液洗涤（3 × ，5,900 × g离心10分钟）
4.使用Thoma室将细菌悬浮液调整至 10 8 CFU/mL（使用0.85% NaCl 溶液）。
5.将编号、高压灭菌并称重的木块与细菌悬浮液一起浸入，立即取出，沥干多余的悬浮液（灭菌滤纸），并将一块（浸入的）木块放入装有真菌菌丝体的每个容器中。至少准备五个重复。
注意：留出一些容器作为对照。
6.对于每种方法，将木块放入装有 MEA 但不含菌丝体的容器中，因为这些是额外的对照（无菌细菌对照）（每个细菌至少一式三份）。
7.仅用 0.85% NaCl 溶液处理至少 14 个木块，并将它们放置在菌丝体顶部（无菌真菌对照）。
8.将容器在 25°C 黑暗中孵育（例如，将它们放入纸箱包装中）八周（图 2）。

图 2. 木材腐烂实验的准备和设置程序。 B 和 C 部分的插图。
D.收获

1.用消毒镊子去除木块表面的菌丝体（图2）。在无菌条件下收集菌丝体以供在步骤 D3 中进一步使用。
2.将木块压印在 TSA 板上并在 25°C 下孵育。
a.将每块木材放入一个编号并预先称重的玻璃培养皿中；编号应该匹配。
b.称量木块+培养皿的重量。
c.在大约 50 °C 的温度下干燥木块。
3.称重从木材中收集的菌丝体。
4.用 NaCl 溶液 (0.85%) 按 1:10 稀释菌丝体样品。
5.在旋转摇床上摇动菌丝体溶液 30 分钟。
6.将 100 μL溶液置于 TSA 琼脂板上，并在 25 °C 下孵育。
7.使用残留溶液。
a.对于 Koch 后的板铸造（如果小于 1 mL）：
我。将残留溶液与 3 mL TSA 软琼脂混合。
二.轻轻涡旋。
三.均匀倒在 TSA 盘子上。
b.对于真空硝化纤维过滤器上的浓缩（如果超过 1 mL）：
我。用 96% EtOH 清洁过滤器单元并对镊子进行消毒。
二.安装无菌过滤漏斗和过滤器。
三.将溶液倒在过滤器上。
四.施加真空。
v. 将过滤器放在 TSA 介质上。
8.将所有琼脂板在 25°C 下孵育，并每天检查生长情况（图 3）。

图 3. 木材腐烂实验的采伐和评估程序。 D 和 E 部分的插图。

E.评估

1.称量干燥的木块。
a.木块可以留在玻璃培养皿中，因为重量是在实验开始时确定的。
b.每天称重直至干燥（不应超过 2-3 天）。
2.检查 TSA 板的生长情况，记录哪些板发生生长。
a.使用单个细菌菌落建立纯培养物（TSA 琼脂平板，25°C）。
b.进行菌落 PCR 并通过对 16S rRNA 基因（Embacher）进行测序来检查细菌是否与所应用的物种匹配等人。，2021）。
我。准备 PCR 反应：将 12.5 μL Red Taq DNA 聚合酶预混液 (2 × ) 与 0.625 mL 引物 27F 和 1492R (10 μmol )、10.75 μL蒸馏水和 0.5 μL BSA (2%) 混合（总体积 = 25 μL ）。
二.用无菌牙签挑选不超过三天的单个细菌菌落并将其添加到 PCR 混合物中。
三.将反应转移到 PCR 循环仪：PCR 条件为 95°C 10 分钟，30 个循环，95°C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 45 秒，最终延伸步骤为 72° C 10 分钟。
四.通过琼脂糖凝胶电泳（硼酸钠缓冲液 1 × ，100 V，约 20 分钟）检查 PCR 产物，以确认其正确大小（~1,550 bp）。
v. 纯化 PCR 反应（Travis Glenn 的 PEG 方案）。
1) 将 18 μL相应的 PCR 反应液转移至 1.5 mL 管中，并通过不断上下吹打溶液与 16 μL PEG (20%) 混合。
2) 将其放在恒温摇床上（37℃，800rpm）15分钟。
3)在室温 (21 °C) 下以 15,000 × g离心15 分钟。
4) 排出上清液（因为它含有剩余的聚合酶、引物二聚体和未使用的dNTP，干扰后续测序反应）。
μL冰冷的 80% 乙醇 (-20 °C)洗涤沉淀。
× g离心2 分钟。
7) 除去上清液。
8) 重复离心步骤并完全除去上清液。
9) 打开盖子，将管子放在热摇床上（37 °C，800 rpm）孵育，直至不留乙醇痕迹（可见滴和气味）。
10)加入18μL无核酸酶水。
11) 将无核酸酶的水上下吹打数次（这可确保 DNA 完全重悬于水中）。
六.再次用琼脂糖凝胶电泳检查纯化的 PCR 产物（硼酸钠缓冲液 1 × ，100 V，约 20 分钟）（图 3）。
七.发送进行测序[例如使用Microsynth测序服务（瑞士Balgach ）]。

数据分析

A.木材腐烂率

为了确保所有木块的初始水分含量均匀，并计算第零天的估计干重（干 m 0 ），在高压灭菌和称重后，将四个水分控制样本木块在 ~50°C 下干燥 72 小时（点B5）。这可以与测定同时进行。我们的样本平均损失了 0.6905 克（ ≙ 8.62%），因此 91.38% 的质量保持不变。计算干 m 0为：干 m 0 = m d 0 × 0.9138，md 0是高压灭菌后（暴露于微生物之前）木块的初始重量。计算质量损失 (ML) 差值： m T (g) = (干 m 0 - m 1 )，其中m T是暴露于微生物后 ML 的差值，m 1和干 m 0是接触微生物后的干质量。和降解前，分别。 ML（%）是真菌降解程度的衡量标准 [ m T (%) = (dry m 0 ÷ m 1 ) × 100]。为每种方法至少准备五个重复，每个对照方法至少准备三个重复。计算每种方法的平均木材重量损失（%）和标准差，并以箱线图等方式进行说明。使用 R 编程语言 (RStudio) 的 psych 包 v2.2.5 中的pairwise.t.test函数进行统计分析，使用合并 SD 的t检验（p 值调整方法：holm 和 Bonferroni）进行成对比较。此外，计算单因素方差分析 [ANOVA， RStudio 中的函数aov () ]。
共培养方法中的重量损失明显高于无菌真菌对照，这被解释为协同效应；较低的体重减轻被解释为对抗。

B.PCR 16S rRNA 放置的评估

通过评估相应的色谱图来检查测序结果的质量。如果所应用微生物的 16S rRNA 基因序列可用于比较，则通过比对初始序列与重新分离菌株的序列进行比较。或者，使用NCBI在线工具对 16S rRNA 基因进行爆炸序列。将搜索设置限制为 16S 核糖体 RNA 序列（细菌和古细菌），并针对高度相似的序列（ megablast ）进行优化。根据Blast检索的结果，将细菌归属，并与开始时应用的菌株进行比较。这可以估计细菌是否在手术中存活下来。

注意：一些霉菌孢子可能已经存活并发育；我们建议记录受影响的盘子/罐头。我们将这些样本排除在计算之外。

笔记

准备足够的装有预培养真菌的罐子，因为某些步骤无法完全无菌地进行，因此很容易发生污染。在开始实验之前，我们建议仔细计划并列出应准备的内容。

注意控制：
•无菌真菌控制： S. lacrymans与浸泡在 0.85% NaCl 溶液中的木材。
•木材无菌对照：用0.85%氯化钠溶液浸泡的木材，无微生物。
•无菌细菌控制：用细菌悬浮液浸泡的木材，细菌悬浮液调整至 10 8 CFU/mL，不含真菌。
•至少四个水分控制样本木块（没有它们就不可能估计初始干重 dry m 0 ）。
还可以通过紫外线对木块进行消毒，因为这比高压灭菌更好地保持木材的初始状态。缺点是更多的霉菌和其他污染物会在这个过程中幸存下来，这可能会导致实验出现问题。

致谢

该协议是在 DIN V ENV12038（木材和木制品的耐久性 - 人造板 - 确定对木材破坏担子菌的抵抗力的测试方法；德国版本 ENV 12038:2002）的基础上制定的。
博士项目BioApp获得资助。 SN 由奥地利科学基金资助：Y0801-B16。我们感谢 Manuela Seehauser和 Sara Hnaien进行了初步实验并帮助解决了首要问题。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突或利益竞争。

参考

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