材料与试剂

生物材料

从胚盘到原肠胚晚期阶段的受精鱼卵。

解决方案

1.PBS 可溶片（Sigma-Aldrich，目录号：P4417），用于细胞分离
2.70%乙醇溶液（Sigma-Aldrich，目录号：65348-85），用于细胞保存
3.邻番红即用型溶液 0.1%（科学实验室用品，目录号：TMS-009-C），用于方案验证
4.碘化丙啶即用型溶液 1 mg/mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：P3566），用于方案验证
5.RNAse A 即用型溶液 10 mg/mL（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
6.磷酸盐缓冲溶液（参见配方）
7.70% 乙醇（参见配方）

食谱

1.磷酸盐缓冲溶液
试剂最终浓度数量
公共广播公司所有盐总计 150 mM：
137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO 4 、2 mM KH 2 PO 41 片
水分子_不适用高达 100 毫升
全部的不适用100毫升

2.70%乙醇
试剂最终浓度数量
乙醇 (95%)70%74毫升
水分子_不适用26毫升
全部的不适用100毫升

实验室用品

1.微量离心管杵（ Sigma-Aldrich，目录号： BAF199230001-100EA）
2.锥底微量离心管（ Sigma-Aldrich，目录号： HS4325-1000EA）
3.离心管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430790）

设备

1.微量离心机（ Thermo Fisher Scientific，目录号：75004081）
2.带有 8–20 ×变焦镜头的显微镜，用于数据验证（ Thermo Fisher Scientific，目录号：4479672）
3.涡旋混合器（VELP Scientifica ，目录号： F202A0173）
4.解剖针（ Thermo Fisher Scientific，目录号：13-820-024）
5.用于数据验证的流式细胞仪（Beckman Coulter，目录号：CO9752）

软件和数据集

1.用于流式细胞术的 CytExpert 软件（用于数据验证）

程序

1.该协议已在硬骨鱼（包括斑马鱼）中的中等大小（直径 3-4 毫米）的受精奈尔玛卵上进行了测试。手术前，用 PBS 冲洗鸡蛋：将鸡蛋放入离心管 (15 mL) 中，然后倒入 10–20 mL 冷 PBS 溶液。排出液体并重复此步骤，以防止可能影响进一步分析的任何污染。此步骤也可以通过实验室中可用的任何方式完成：使用滤茶器、烧杯、纱布等。
2.使用杵将鸡蛋（或单个鸡蛋）放入管中。最好是加入鸡蛋并逐渐加工。不要均质，也不要用力推动研杵，以免损坏细胞：足以打破细胞壳。处理过的鸡蛋的样品体积不应超过试管的 2/3。 1.5 mL 离心管可容纳不同数量的鸡蛋，具体取决于鸡蛋的大小。因此，在此过程中可以将大约 30 个直径为 3-4 毫米的鸡蛋依次放入管中。
3.将冷 PBS 充满鸡蛋管，并在涡旋上摇动 5 s，或使用杵或解剖针机械地释放可见壳外所有鸡蛋的内容物。
4.使用解剖针机械地从管中取出所有壳。确保所得半透明培养基中没有残留壳以避免细胞损失非常重要。
5.°C下以 300–500 × g离心5 分钟。
6.弃去上清液而不影响沉淀。添加 1–1.5 mL 冷 PBS 并再次离心。
7.（可选）重复步骤 6 1-2 次，清洗细胞中的小碎片，并将沉淀重悬于 100 μL冷 PBS 中。
按照这些步骤，我们获得含有细胞的沉淀。 PBS 的体积可以根据需要改变（50–500 μL ）。该悬浮液含有一定量的小悬浮非细胞颗粒。手术后，悬浮液中细胞与其他漂浮非细胞颗粒的总比例至少为 10%。
细胞悬液可随时用于任何分析。还可以使用标准方案（例如使用冷冻乙醇）将其固定以进行长期细胞储存（Ciancio 等人，1988）。

数据分析

流式细胞术和显微镜用于方案验证。 CytExpert 软件用于所有细胞计数数据。

协议验证

成熟的 nelma 卵（ Stenodus leucichthys nelma ）用于验证协议（图 1A）。

图 1. 成熟的白斑鱼卵。 (A) 白色箭头显示胚盘的位置。 (B) 从胚盘中分离的细胞，用 O-番红染色。

按照上述方案处理了三十个鱼卵。然后，将含有细胞的沉淀重悬于 300 μL PBS 中，并固定于 70% 乙醇中（Ciancio 等人，1988），以确保分析前长期保存。将所得悬浮液的一小部分 10 μL 等分试样用番红染色（Swain 和 De，1990）。将悬浮液在载玻片上于室温下风干，使细胞粘附在其上。然后将载玻片浸入番红溶液中5分钟，并用PBS洗涤一次。使用光学显微镜检查结果（图1B）。
为了验证结果并另外显示分离细胞的真实存在，将获得的细胞的醇悬浮液（300μL ）用碘化丙啶染色（Riccardi和Nicoletti，2006）。通过 300 × g离心5 分钟，用 PBS 将细胞上的酒精洗掉两次；然后将细胞重悬于 100 μL PBS（+0.1 μg/mL RNase A 和 0.01 μg/mL 碘化丙啶）中。在 4°C 黑暗中孵育 30 分钟后，使用流式细胞仪（PE 通道）分析染色细胞（图 2）。流式细胞仪分析了 500,000 个事件。使用软件界面、侧向散射和前向散射数据，仅选择单个细胞进行分析。沿 PE 通道的直方图清楚地显示了与分离细胞的细胞周期相对应的峰值（图 2A）。点图上的垂直线（图2B）显示了直方图中细胞周期G1峰对应的位置（图2A）。在同一通道的点图（图 2B）上，存在与胚胎发生阶段（小细胞囊胚）相对应的细胞尺寸分散（y 轴），其中细胞获得不同的尺寸（图 2B）。根据我们的数据，从 30 个鸡蛋（图 1A）中分离出大约 100,000 个细胞（图 2B），这与其他已知方法相当相当。

图 2. 流式细胞荧光测定结果（PE 通道）。细胞周期直方图 (A) 和点图 (B) 显示从小细胞囊胚分析的细胞的异质性。

因此，该协议以两种独立的方式进行测试：视觉（显微镜）和光度测定。证明了从鱼卵胚盘中分离细胞的程序效率。该协议可适用于大多数硬骨鱼类，其卵处于早期成熟阶段（囊胚、原肠胚）；本议定书可能适用于具有不同卵直径[大（鲑鱼）或小（斑马鱼）]的硬骨鱼的其他代表。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

开始之前：要从囊盘中分离细胞，在大细胞囊胚阶段有正在发育的卵就足够了。根据具体目标，重要的是要注意分析所需的细胞数量。如果需要单独分析每个卵子，了解发育中的卵子中所需细胞的总数非常重要。对于检查特定数量的卵子（如果需要目标分析的一般统计数据），卵子的发育阶段并不那么重要。

故障排除

手术后无细胞：
1.取更多鸡蛋进行加工并重复该过程。
2.确保您已取出正在发育的卵子。胚胎应该在光学显微镜下可见。
3.请记住，在隔离方案的第一步中，冲洗鸡蛋后，轻轻地弹出鸡蛋就足够了。不要完全均质化。

致谢

这项研究得到了 RSF 拨款 23-26-00257 的支持。

利益争夺

作者声明，他们没有已知的可能影响本文报告工作的相互竞争的经济利益或个人关系。

参考

Ciancio, G.、Pollack, A.、Taupier, MA、Block, NL 和 Irvin, GL (1988)。使用 Hoechst 33342 和碘化丙啶测量细胞周期阶段特异性细胞死亡：通过乙醇固定保存。 J.组织化学。细胞化学。 36（9）：1147-1152。
Durkin, M.、Qian, X.、Popescu, N. 和 Lowy, D. (2013)。小鼠胚胎成纤维细胞的分离。生物协议3(18)：e908。
Fetherman, ER、Lepak, JM、Brown, BL 和 Harris, DJ (2015)。使用压力冲击处理优化三倍体白眼鱼生产的起始时间。北上午。 J.水产养殖。 77（4）：471-477。
Riccardi, C. 和 Nicoletti, I. (2006)。通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析细胞凋亡。纳特。协议。 1（3）：1458-1461。
里格，S.（2019）。用 Pronase 对斑马鱼胚胎进行去绒毛膜，用于甲硝唑介导的 β 细胞消融 V.2。 DiaComp 协议。
Swain, D. 和 De, DN (1990)。使用番红和靛蓝胭脂红对植物细胞的细胞周期进行差异染色。染色技术。 65（4）：197-204。