材料与试剂

生物样本

牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A8412）；参见一般注释 1
C2C12，小鼠（ Mus musculus ）成肌细胞（Yaffe 和 Saxel，1977）；参见一般注释 1
质粒pc1208(pEG-MeCP2) (Kudo等人，2003) ；参见一般注释 1
大鼠 IgG 抗 MeCP2 4H7 抗体。自制，非商业化（Jost et al. , 2011）；参见一般注释 1
驴抗大鼠IgG-Cy3抗体（JacksonImmunoResearch，目录号：111560）；参见一般注释 1 和 2

试剂

1,4-二氮杂双环-[2.2.2]辛烷（DABCO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2522）
2-丙醇（AppliChem GmbH，目录号：131090.1212）
4 ' ,6'-二脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Carl Roth，目录号：6335.1）
硫酸铝 14–18 水合物（Carl Roth，目录号：3731.1）
过硫酸铵（Carl Roth，目录号：9592.3）
溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0404）
考马斯亮蓝 R（Sigma-Aldrich，目录号：1.12553）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4 · 7H 2 O）（Carl Roth，目录号：X987.2）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
绝对纯乙醇，医药级（AppliChem GmbH，目录号：A4230）
乙二胺四乙酸（EDTA）（AppliChem GmbH，目录号：131026.1211）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5400）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9422）
Hybond ECL 膜（硝酸纤维素膜）（VWR，目录号：RPN3032D）
低脂奶粉（Sucofin）
用于分析的甲醇 EMPARTA ® ACS（Sigma Aldrich，目录号：1070182511）
Mowiol ® 4-88（Sigma-Aldrich，目录号：81381）
Nonidet TM P-40替代品（NP-40）（Roche，目录号：11332473001）
胃酶抑素 A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Carl Roth，目录号：6367.1）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Carl Roth，目录号：3904.1）
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957.1）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：11667289001）
反式环氧琥珀酰-L-亮酰胺基（4-胍基）丁烷（E64）（Sigma-Aldrich，目录号：E3132）
Tween 20（Carl Roth，目录号：131026.1211）
Whatman 3MM CHR（Whatman 纸）（Cytiva，目录号：3030-672）

解决方案

丙烯酰胺/双丙烯酰胺 30%（聚丙烯酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号：A3699）
Dulbecco改良 Eagle培养基，高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D7777 ）
胎牛血清高级（Capricorn Scientific，目录号：FBS-11A）
甲醛溶液，36.5%–38% H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
正磷酸（Carl Roth，目录号：6366.1）
Pierce TM 660 nm 蛋白质测定试剂（Thermo Fisher，目录号：22660）
Pierce TM 10 ×蛋白质印迹转移缓冲液，不含甲醇（转移缓冲液）（Thermo Fisher，目录号：35040）
四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4049）
过硫酸铵 10%（参见配方）
考马斯脱色液（参见配方）
考马斯染色液（参见配方）
DAPI 解决方案（参见食谱）
E64 解决方案（参见食谱）
加载缓冲液（参见配方）
低脂牛奶 3% PBS 溶液（参见食谱）
低脂牛奶 5% PBS 溶液（参见食谱）
裂解缓冲液（参见配方）
封固剂（参见配方）
胃酶抑素 A 溶液（参见食谱）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（参见食谱）
PBS-EDTA 0.02% (w/v)（参见配方）
PMSF 溶液（参见配方）
10 mL 凝胶的聚丙烯酰胺凝胶 5%（堆积）（参见配方）
10 mL 凝胶的聚丙烯酰胺凝胶 8%（分离）（参见配方）
电泳缓冲液 10 × （参见配方）
十二烷基硫酸钠 (SDS) 10%（参见配方）
Tris 1 M pH 6.8（参见配方）
Tris 1 M pH 8.5（参见配方）
Tris 1.5 M pH 8.8（参见配方）

食谱

过硫酸铵10%
试剂最终浓度数量
过硫酸铵10%（克/体积）1克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升

考马斯亮蓝脱色液
试剂最终浓度数量
乙醇10%（体积/体积）40毫升
正磷酸2%（体积比）2毫升
水分子_不适用58毫升
全部的不适用100毫升

考马斯染色液
试剂最终浓度数量
考马斯0.2%（重量/体积）0.2克
正磷酸2%（体积比）2毫升
乙醇10%（体积/体积）10毫升
水分子_不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

DAPI解决方案
试剂最终浓度数量
数据API1毫克/毫升10毫克
水分子_不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升

E64解决方案
试剂最终浓度数量
E641毫米360微克
乙醇50%（体积/体积）500微升
水分子_不适用500微升
全部的不适用1毫升

加载缓冲液
试剂最终浓度数量
特里斯50毫米0.3克
安全数据表2%（体积比）2毫升
甘油10%（体积/体积）10毫升
溴酚蓝0.01%（体积比）100微升
数码地面电视100毫米1.5克
水分子_不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

低脂牛奶 3% PBS 溶液
试剂最终浓度数量
低脂奶粉3%（重量/体积）0.3克
公共广播公司不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升

低脂牛奶 5% PBS 溶液
试剂最终浓度数量
低脂奶粉3%（重量/体积）0.5克
公共广播公司不适用至 10 毫升
全部的不适用10毫升

裂解缓冲液
试剂最终浓度数量
特里斯25毫米0.03克
氯化钠1M0.6克
葡萄糖50毫米0.09克
乙二胺四乙酸10毫米0.03克
吐温200.2%（体积比）20微升
Nonidet TM P-40替代品0.2%（体积比）20微升
永磁同步滤波器解决方案1毫米1微升
E64解决方案10μM1微升
胃酶抑素A溶液29μM1微升
水分子_不适用10毫升
全部的不适用10毫升

封固剂
试剂最终浓度数量
莫维奥尔 4-8813%（重量比）8克
Tris-HCl 1 M pH 8.5133毫米8毫升
水分子_不适用32毫升
甘油33%（体积比）20毫升
达伯科2%（重量/体积）1.2克
全部的不适用60毫升
将 mowiol 添加到 Tris 和 H 2 O 中，并在搅拌的同时加热至 50–60 °C。
冷却至室温。
添加甘油并再次搅拌。
添加 DABCO 并通过搅拌将其溶解。
将溶液以 5 , 000 × g旋转15 分钟。
等分上清液并储存在-20°C。

胃酶抑素A溶液
试剂最终浓度数量
胃酶抑素A2.9毫米2毫克
二甲基亚砜不适用1毫升
全部的不适用1毫升

磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
试剂最终浓度数量
氯化钠1.37米80克
氯化钾27毫米2克
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O10毫米21.7克
KH 2 PO 410毫米2.4克
水分子_不适用至 1 升
全部的不适用1升

PBS-EDTA 0.02%（重量/体积）
试剂最终浓度数量
乙二胺四乙酸0.02%（重量/体积）2毫克
公共广播公司不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

永磁同步滤波器解决方案
试剂最终浓度数量
PMSF100毫米17.42毫克
2-丙醇不适用1毫升
全部的不适用1毫升

聚丙烯酰胺凝胶 5%（堆积），适用于 10 mL 凝胶
试剂最终浓度数量
聚丙烯酰胺5%（体积/体积）0.33毫升
Tris 1 M pH 6.8125毫米0.25毫升
十二烷基硫酸钠 10%0.1%（体积比）0.02毫升
过硫酸铵10%0.1%（体积比）0.02毫升
泰美德0.001%（体积/体积）0.002毫升
水分子_不适用1.4毫升
全部的不适用2毫升
10 mL 凝胶的聚丙烯酰胺凝胶 8%（分离）（参见一般说明 1）
试剂最终浓度数量
聚丙烯酰胺8%（体积/体积）2.7毫升
Tris 1.5 M pH 6.8375毫米2.5毫升
十二烷基硫酸钠 10%0.1%（体积比）0.1毫升
过硫酸铵10%0.1%（体积比）0.1毫升
泰美德0.0006%（体积/体积）0.006毫升
水分子_不适用4.6毫升
全部的不适用10毫升

电泳缓冲液 10×
试剂最终浓度数量
Tris碱基25毫米30克
甘氨酸1.92米144克
安全数据表1%（体积比）100毫升
水分子_不适用至 1 升
全部的不适用1升

十二烷基硫酸钠 10%
试剂最终浓度数量
安全数据表10%（体积/体积）10毫升
水分子_不适用90毫升
全部的不适用100毫升

Tris 1 M pH 6.8
试剂最终浓度数量
特里斯1M12.1克
水分子_不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

Tris 1 M pH 8.5
试剂最终浓度数量
特里斯1M12.1克
水分子_不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

Tris 1.5 M pH 8.8
试剂最终浓度数量
特里斯1.5M18.15克
水分子_不适用至 100 毫升
全部的不适用100毫升

设备

AMAXA nucleofector (Lonza) 或同等产品。细胞转染所需。参见一般说明 1
共焦显微镜 Leica TCS SPE-II (Leica) 或同等产品。成像 z 堆栈以计算体积所需。参见一般说明 1
成像仪 AI600 (Amersham) 或同等产品。 SDS-PAGE 凝胶成像（470–635 nm 落射白光，任何合适的滤光片以观察考马斯染色的蛋白质）和蛋白质印迹（荧光落射光：460、520 或 630 nm，带有相应的发射滤光片 Cy2-525BP20 ）所需、Cy3-605BP40 或 Cy5-705BP40，请参阅一般注释 2)
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（Bio-Rad Laboratories）或同等产品
PowerPac 基本电源（Bio-Rad 实验室）或同等产品
S3e 细胞分选仪（Bio-Rad Laboratories）或同等产品。它需要一个照明源和适合与目标蛋白质融合的荧光标签的滤光片：对于 EGFP，可以使用带有 525/30 nm 发射滤光片的 488 nm 激光
Nikon Eclipse Ti (Nikon) 上的单分子设置。用作荧光平台的示例。在给出的示例中，EGFP 图像是使用 Nikon 的 OBIS 488 nm (100 mW) 激光器和 Quadbandpass (432/25 515/25 595/25 730/70 nm) 滤光片拍摄的。参见一般说明 1
Trans-Blot ® SD 半干转移池（Bio-Rad Laboratories）或同等产品
宽视场显微镜 Axiovert 200（蔡司）。用作荧光平台的示例。在给出的示例中，EGFP 图像是使用 HBO100 灯泡和硬涂层 EGFP 滤光片拍摄的（例如：482/18；bs：495LP；em：520/28）。参见一般说明 1
12 毫米圆形盖玻片（厚度 0.13–0.16 毫米）（对角线，目录号 41001112）或根据您的显微镜样品的同等材料
#1.5H 24 mm 圆形盖玻片（厚度 175 ± 5 μm）（Thor 实验室，目录号：CG15XH1）。用于单分子设置中的活细胞显微镜。参见一般说明 1
宽视野显微镜 Nikon Eclipse TiE2（尼康）。用于验证跨平台的门排序。 Spectra X LED 395 ± 25 nm (295 mW) 和 370 ± 24 nm 分别用作 DAPI 和 GFP 的照明，并使用 Quadbandpasss (432 ± 25、515 ± 25、595 ± 25、730 ± 70 nm) 作为发射滤光片。使用数值孔径为 0.7 的20 × SPlan Fluor LWD DIC 物镜采集图像

软件和数据集

S3 ProSort TM软件（Bio-Rad Laboratories）或同等软件。用于对细胞分选仪中的细胞进行分析和分选
ImageJ（斐济）（Schindelin等人，2012）。在给出的示例中，使用了 FIJI 版本 1.52q，并且需要插件 BioFormats 来打开在宽场和共焦显微镜中生成的图像
Volocity 6.3（珀金埃尔默）。请参阅一般说明 1。可以使用 ImageJ 插件 3D 套件来计算 z 堆栈中的体积和强度

程序

通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 进行蛋白质纯化和浓缩验证

纯化蛋白质。您将需要您想要研究的目标蛋白 (POI) 的纯化版本。它可以是未标记的，也可以是标记的（参见一般注释 3）。由于蛋白质纯化有多种可能性，我们不会包含对我们使用的蛋白质纯化的描述，这可以在手稿中找到（Zhang et al. , 2022）。
使用 SDS-PAGE 分析纯化的蛋白质。
使用已知量（250、500、750、1,000、1,500、2,000 ng）的参考蛋白（即 BSA）进行稀释，在 H 2 O 中最终体积为 15 μL 。
TM 660 nm 蛋白质测定试剂）估计纯化蛋白质的浓度。
使用估计值（400、600、800、1,000 ng）制备特定数量的纯化蛋白质，使其在 H 2 O中最终体积为 15 μL。
将参考蛋白稀释液与 5 μL 上样缓冲液 4 ×混合至终浓度 1 × ，95 °C 煮沸 5 分钟，然后置于冰上。
将不同量的纯化蛋白与 5 μL 上样缓冲液 4 ×混合至终浓度 1 ×， 95 °C 煮沸 5 分钟，然后置于冰上。
将聚丙烯酰胺凝胶放入电泳室中，并填充 1 ×电泳缓冲液。
通过恒定 100 V 的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品。
将凝胶在考马斯染色溶液中孵育过夜（约 16 小时）。
将凝胶在脱色溶液中孵育（2×10 分钟）并在 H 2 O中平衡。
对成像仪中的凝胶进行成像（图1A）。

图 1. SDS-PAGE 考马斯染色和分析以验证纯化蛋白的浓度。 (A) 用于验证的凝胶示例。将已知量的牛血清白蛋白 (BSA) 与通过比色测定估计的不同量的纯化目的蛋白(POI)一起上样。修改自Zhang等人。（2022 ）。白色虚线代表 B 中用于定量的选择。 (B) 使用凝胶分析工具在 ImageJ 中获得的强度分布。对各个条带进行条带宽度的选择，并将感兴趣的条带面积计算为峰下面积。 (C) 基于 B 中获得的强度测量的校准曲线。回归曲线的方程在图中进行了描述。 (D) 根据 POI 带的强度测量值，使用 B 的回归曲线方程，计算获得 POI 的校正浓度 (conc)，从而可以根据计算的 POI 强度确定 POI 的校正量。条带和浓度（以 ng/μL 为单位）作为所得值的平均值，1624.6 ± 80.3 ng/μL。显示的值是 A 所示凝胶中从左 (POI 400 ng) 到右 (POI 1000) 的计算结果。误差的计算在数据分析部分中进行了描述。 (E) 三个技术重复的测量值和标准偏差，每个重复采用四个带强度来计算平均值，如 D 所示（对应于左侧重复）。

使用 ImageJ 对凝胶进行图像分析，验证纯化蛋白质的浓度。
生成覆盖整个带区的矩形选区。
分析→凝胶→选择第一个泳道（对于第一个泳道）和分析→凝胶→选择下一个泳道（对于其他泳道）创建感兴趣的区域（图1A，白色虚线）。
分析→凝胶→绘图通道功能获取强度测量值（图 1B）。
将条带的强度量化为峰下的面积（图 1B）。为此： i) 使用工具直线在峰底部绘制一条水平车道，使峰闭合； ii) 使用工具棒选择峰值； iii) 自动显示所选区域的面积。
根据参考蛋白的已知浓度绘制强度（面积）并生成回归曲线（图 1C）。
回归曲线方程为 Y = a × X + b，其中 X 为蛋白质数量（以 ng 为单位），Y 为强度。因此，考虑X = (Y - b)/a，您可以根据强度计算蛋白质含量（图 1C）。参数b对应于特定凝胶的背景。
使用从 POI 的每个估计量的峰下区域获得的强度值来获取实际值（图 1D）。
您可以通过将 POI 的量除以每个孔中添加的原始溶液的体积来获得 POI 的浓度（图 1D）。 POI 的浓度是这些值的平均值。

使用荧光激活细胞分选和蛋白质印迹计算细胞组分中的蛋白质含量

样品制备：使细胞在培养所需的特定条件下生长。您需要在 10 cm 细胞培养板中放置来自野生型（未转染细胞）和转染细胞的10 6 –10 7 个细胞。此步骤应适应所使用的特定细胞系。对于使用 AMAXA 电穿孔的 C2C12：
将 50 个细胞/cm 2接种到 10 cm 细胞培养板中。
在 37 °C、5% CO 2的生长培养基中生长过夜。
移除介质。
用 PBS-EDTA 清洗细胞。
添加 2 mL 胰蛋白酶。
37°C 孵育 5 分钟。
用 4 mL 的生长介质停止胰蛋白酶。
将 0.5 mL 细胞播种到带有 9 mL 生长介质（未转染样品）的新 10 cm 细胞培养板中。
将 1 mL 细胞以 0.3 × g离心 5 分钟，弃去上清液。
将 2–5 μg 质粒混合在 100 μL 室温 AMAXA M1 溶液中。
将沉淀重悬于含有质粒的 AMAXA M1 溶液中，并收集在比色皿中。
将比色皿放入 AMAXA nucleofector 中并选择程序 B-032。
收集细胞并将其接种到带有 10 mL 生长培养基（转染样品）的新 10 cm 细胞培养板中。
将未转染和转染的样品在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
来样加工；各个板材单独加工：
用 PBS 清洗细胞。
添加 2 mL 胰蛋白酶。
37°C 孵育 5 分钟。
将细胞收集在 15 mL 管中。
0.3 × g离心5 分钟，弃去上清液。
将颗粒重新悬浮在 2 mL 的 PBS 中。
0.3 × g离心5 分钟，弃去上清液。
将颗粒重新悬浮在 3 mL的 PBS 中。
荧光激活细胞分选 (FACS)
在分析模式下分析未转染的细胞，以确定 GFP 强度与面积的关系，并保存最小和最大强度值。为了重现性，我们建议计数大约 10 6个细胞。如果 FACS 分选机的软件未提供这些值，则可以从结果图表中推断出这些值。
使用与未转染细胞相同的设置在分析模式下分析转染细胞，并保存最大强度值。为了重现性，我们建议计数大约 10 6个细胞。如果 FACS 分选机的软件未提供这些值，则可以从结果图表中推断出这些值。
使用获得的值计算门（表 1）。参见一般说明 4。

表 1. 基于强度的门计算参数。 *对数的使用仅用于表示目的，并不影响以下计算。
范围描述公式
最小未转染样品中强度的最小值log(未转染的最小整数)*
负最大未转染样品中的强度最大值log(未转染的最大整数)*
POS_MAX转染样品中强度的最大值log(最大转染整数)*
垃圾桶参考区间（参见一般说明 4）(POS_MAX-NEG_MAX)/40
POS_TH定义正计数的阈值最小值 + 11 * 宾
LOW_MIN“低”类别的最低阈值最小值 + 13 * 宾
最低限度“高”类别的最大阈值最小值 + 22 * 宾
HIGH_MIN“低”类别的最低阈值最小 + 24 * 宾
最高上限“高”类别的最大阈值最小 + 33 * 宾

根据门定义的强度值将转染细胞分为“低”和“高”（图 2）。收集细胞并保存细胞计数。

图 2. 用于定量 FACS 细胞组分中目的蛋白 (POI) 量的蛋白质印迹分析示例。 (A) 用于验证的凝胶示例。将已知量的纯化 POI 与已知量的细胞裂解物一起上样。修改自Zhang等人。（2022 ）。 (B) 使用 ImageJ 的凝胶工具分析对凝胶条带进行定量，以确定纯化 POI 的强度并生成校准曲线。 (C) 将裂解物条带的强度测量值与验证曲线相结合，以获得总蛋白的校正量，并且在知道细胞数量的情况下，获得每个细胞的蛋白量。

从细胞中提取总蛋白用于蛋白质印迹。
将分选组分中的细胞以 0.3 × g离心 5 分钟，弃去上清液。
将沉淀重悬于 1 mL 裂解缓冲液中，用力移液以破坏膜。
通过蛋白质印迹定量分选细胞中的蛋白质含量。
根据 A 中计算的浓度制备已知量的纯化 POI（30、60、90、120、150、180、210 和 240 ng）。参见一般说明 5。
将标准 POI 和样品与 4 ×上样缓冲液混合至终浓度 1 × ，并在 95 °C 中煮沸 5 分钟。以 10,000 × g离心 10 分钟，清除细胞裂解液，并将上清液置于冰上。
如步骤 A2e – A2f 中所述，通过 SDS-PAGE 分析级分。
在 27 mL H 2 O中稀释 3 mL 转移缓冲液 10 ×来制备转移缓冲液 1 × 。
将 Whatman 纸和硝酸纤维素膜切成凝胶大小，并将其浸泡在 1 ×转膜缓冲液中15 分钟。
2 O中清洗凝胶10 分钟。
在转移缓冲液中平衡凝胶 1 × 10 分钟。
将转移装置组装到转移室中（从下到上）：2 × Whatman、硝酸纤维素膜、凝胶、2 × Whatman。
除去气泡。
将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，恒定电压为 25 V，持续 20-45 分钟。
将膜置于含 5% 低脂牛奶的 PBS 中，在室温下在旋转器中孵育 30-60 分钟。
在 4 °C 下，与适当稀释度的 POI 抗体在旋转器中孵育过夜。
将与荧光团连接的二抗在 PBS 中的 3% 低脂牛奶中适当稀释，在室温下在旋转器中孵育 1 小时。
使用成像仪检测荧光信号（图 2A）。
使用 ImageJ 测量带中的强度，如步骤 A3a–A3d 中所述（图 1B）。
根据已知浓度绘制强度以生成回归曲线。
使用回归曲线中的方程，计算分选细胞的“低”和“高”部分的蛋白质含量。 POI 的强度应在校准曲线的（线性）范围内。
将蛋白质量除以凝胶上分析的细胞数，以获得每个细胞的分子数。

浓度计算（以及跨成像平台的使用）

样品制备。在适合成像的基质（即室载玻片或盖玻片）所需的条件下培养细胞。按照步骤 B1 中描述的过程进行操作。请参阅一般说明 6。该方法适用于活细胞或固定细胞。如果是固定细胞：
移除介质。
用 PBS 清洗盖玻片两次。
将盖玻片与 PBS 中的甲醛溶液 1:10 在室温下孵育 10 分钟。
用 PBS 清洗盖玻片 3 次。
在石蜡膜上添加 15 μL DAPI 溶液液滴，并将盖玻片倒置。在黑暗中室温孵育 15 分钟。
将盖玻片翻转过来。
用 PBS 清洗盖玻片 3 次。
2 O清洗盖玻片一次。
在玻璃载玻片上添加 10 μL 封固剂液滴，并将盖玻片倒置在其上。
让它在黑暗中干燥。
校准曲线的生成。参见一般说明 6。
使用 POI 通道的相同设置获取阴性细胞和转染细胞中的细胞图像。此外，人们还可以获得额外的渠道来促进细分。在给出的示例中，我们使用了带有 DAPI（在固定细胞中）或显示核分布的蛋白质（在活细胞成像中）的第二个通道。
使用 ImageJ 分割细胞（或细胞核，在我们的例子中）（图 3A）。在给出的示例中，使用以下 ImageJ 协议对细胞进行分割： i)处理→过滤器→高斯模糊……，应用 2 像素西格玛（半径）； ii)处理→减去背景，应用 15 像素的滚球半径，其他选项均不选择； iii)图像→调整→阈值，使用“Li”作为阈值方法。然后修改图像以找到距离太近的核，并将其识别为一个，以便丢弃它们（当它们重叠时）或分成两个感兴趣的区域（如果可能）。
计算所有细胞 POI 通道中的总强度。该值对应于 ImageJ 结果表中的“IntDen”列，可以在分析→设置测量...→积分密度中选择。
计算表 1 (图 3B) 中所述的门的强度值。
绘制强度对数范围内的细胞频率（图 3C）。

图 3. 不同仪器的校准曲线的生成。 (A) 在新成像系统中生成校准曲线所需的最少分析方案。 (B) 根据获得的强度值计算门。箱按观察到的最小 (min) 值和最大 (max) 值之差的 1/40 计算。 (C) 不同成像系统中相同 POI 的曲线示例：FACS（左图）、宽场（中左图）、共焦（右左图）和单分子显微镜（右图）。增加成像的细胞数量会导致与通过蛋白质印迹 (FACS) 定量目标蛋白 (POI) 所用的曲线更加相似。 FACS、宽场和单分子是由Zhang 等人修改的。（2022 ）。 (D) 描述重复对门生成的影响。对应于三个生物重复（每个 n > 500）的误差条用于生成 C 中的宽场图，包括使用单个数据集计算门的标准偏差。

检查校准曲线的质量：所有阴性细胞应归类为阴性，归类为高的细胞应在 POI 通道中具有清晰的信号。请参阅故障排除。
浓度的计算。
遵循奈奎斯特采样（即在共焦显微镜中），获取包含 POI 所在的整个细胞结构的 Z 堆栈，包括 POI 的通道。
对结构进行分段（可以使用其他通道）并确定 POI 通道中体积的强度。请参阅一般注释 8。在给出的示例中，3D 分割是在 Volocity 中使用 DAPI 通道使用以下协议完成的：I)测量→查找→查找对象； II)测量→处理→膨胀（迭代：3）； III)测量→加工→填充物体上的孔洞； IV)测量→处理→侵蚀（迭代：3）； V)测量→过滤→按大小排除对象。体积可以根据体素计数来计算，而强度则在描述 ROI 的表中的总和中进行描述。
使用校准曲线的门值，将细胞分为低和高。参见一般注释 7。
计算不同类别结构的平均体积。
每个类别的 POI 浓度对应于每个细胞的蛋白质量除以该类别结构的平均体积。

数据分析

请注意，在给出的示例中，由于门的选择，为单个细胞计算的蛋白质浓度被分类为一个广泛的类别。然而，该方法可以尽可能精确，因为可以减小门尺寸并获得足够的细胞来执行可测量的蛋白质印迹。即使在这种情况下，也会出现三个部分的错误： i) 通过蛋白质印迹计算蛋白质含量； ii) 细胞（或核）体积的变异性； iii) 强度测量误差。考虑到所有这些因素，该方法允许根据 POI 荧光强度将单细胞分配到相应的蛋白质浓度范围。为了正确考虑最终浓度值中提到的误差，每一步都应考虑误差传播。在误差传播中，给定一个函数：f = a × b/y，其中变量a、b和y的误差分别为 ∂ a 、∂ b和 ∂ c ，f (∂ f )的误差可以计算如下：

∂_f=f×√(〖∂_a〗^2/a^2 +〖∂_b〗^2/b^2 +〖∂_y〗^2/y^2 )

在这里，您可以找到错误来源以及如何获取错误值：
纯化蛋白的蛋白浓度以 ng/μL 为单位（图 1），组分中的蛋白浓度以 μg/细胞为单位（图 2）。
强度测量：可以估计为背景信号的平均标准偏差。要计算背景信号，请在线之间生成多个相同大小的 ROI 并获取强度。该值对应于 ImageJ 结果表中的“IntDen”列，可以在分析→设置测量...→积分密度中选择。
重复误差：计算出的不同泳道之间的标准偏差（在图 1 的情况下）。
重复误差：技术和/或生物重复之间的标准偏差加上计算的传播误差。
蛋白质浓度（μM）。
蛋白质浓度计算如上所述。
体积计算：细胞之间的标准偏差。
在图 1 给出的示例中，按照步骤 1a 中所述计算得出的背景标准偏差为 15.793。因此，每条线的浓度（以 ng/μL 为单位）为 1,714.4 ± 6.8、158.3 ± 5.5、1,633.8 ± 4.8 和 1,601.8 ± 4.2。最终浓度数是这些值的平均值 1624.6，误差对应于重复的标准偏差 (69.5)，再加上计算的传播误差 (10.8)，得到最终数 1,624.6 ± 80.3 纳克/微升。

协议验证_

该方法得到了Zhang等人的验证。 (2022)，对应于图3、补充图3以及补充表S9和S10。
为了定量，对转染细胞的三个复制品进行分选并用蛋白质印迹进行分析以获得分子的数量。使用来自两个生物重复的至少 50 个细胞来计算每种条件下的浓度体积。
在宽场显微镜中使用不同的校准曲线（每个实验大约 500 个细胞进行 3 次生物复制），强度值结果具有可比性（图 3D）。
为了验证跨平台的使用，我们按照步骤 B1 中的描述准备了示例。三分之一的细胞（转染或未转染）在盖玻片上生长，三分之二在组织培养皿上生长。 24小时后，收集盖玻片，用冰冷的甲醇固定6分钟，用DAPI复染，并按照步骤C1d至C1i中所述安装。所有盖玻片均使用宽场显微镜成像（图 4A）。 DAPI 通道用于通过 ImageJ 中的处理进行分割（高斯模糊，sigma 5 像素；减去背景，滚动，20 像素）。根据我们对 C2C12 成肌细胞的先验知识，仅考虑面积在 90 至 140 μm 2之间的细胞核。使用分段核内的 GFP 强度（图 4B，直方图）绘制校准曲线。如步骤 B2 和 B3 中所述收集和分选培养皿上生长的细胞，并将所得的低和高级分用冰冷的甲醇固定 6 分钟，通过在 37°C 下孵育过夜干燥到盖玻片上，然后通过用 DAPI 复染并按照前面所述进行封固。这些盖玻片在与校准相同的条件下成像（图 4A）。分选细胞的 GFP 强度叠加在直方图中（图 4B），导致大多数情况下在正确的门中分离。

图 4. 跨平台量化重现性的验证。 (A) 验证过程方案：将细胞（未转染和转染）接种在盖玻片中，同时使用荧光激活细胞分选 (FACS) 将一部分转染细胞分选为低和高类别。通过脱水将所得级分固定在盖玻片上。所有盖玻片均用 DAPI 复染并使用宽视野显微镜成像。 DAPI 用于分割细胞核并量化细胞核中 GFP 通道的总强度。 (B) 根据频率（n 未转染：63，n 转染：1,539），使用未分选的细胞确定校准曲线。橙色点和洋红色菱形分别代表排序的低分数和高分数的单独强度值。

一般注意事项和故障排除

一般注意事项

该材料并不是该协议特别需要的，但已在给出的示例中使用。
荧光或放射性偶联二抗应用于蛋白质印迹，以确保信号强度的线性。不建议进行酶促反应（即与辣根过氧化物酶偶联的抗体）。
如果目标蛋白没有适合蛋白质印迹的抗体，则使用标记的纯化蛋白。
选择 40 个箱作为参考区间是为了在不改变参考区间的情况下生成不同的门结果（类别数量），但可以适应具体的实验设置。请注意，箱的数量决定了设置门时可接受的变异范围。当使用其他荧光团和/或蛋白质时，此步骤最容易受到优化。
凝胶上分析的目标蛋白量应与上样细胞数量的预期量相似。当细胞对应的条带不在校准曲线内时，您可以修改用于校准的纯化蛋白的加载量和/或使用不同数量的细胞。
您将需要没有标签的未转染野生型细胞作为阴性对照，并需要在与 B 部分所述相同条件下的转染细胞来生成每个平台的校准曲线。该系统适用于活细胞和固定细胞显微镜检查，包括免疫染色。唯一的要求是任何其他荧光、抗体或其他成分不应干扰 POI 强度的测量（即发射光谱与检测重叠）。
每个成像仪器都需要自己的校准曲线。测量的准确性很大程度上取决于用于校准曲线的细胞数量（图 3C），要获得可重复的结果，最少需要约 200 个细胞。只要采集条件（即激光功率、曝光时间）在实验之间保持恒定，校准曲线就可以在同一平台中使用。请注意，如果使用单平面和体积，校准曲线应该不同。该方法不应受到任何附加处理方法（即不同的反卷积算法）的影响。如果在分析过程中使用额外的处理来确定强度，则必须以相同的方式处理用于校准的图像。
该部分可用于通过分割亚细胞结构而不是整个细胞来确定 POI 的亚细胞浓度。

校准曲线故障排除

问题1：低门中包含阴性细胞。
可能的原因： (a) 自发荧光高的死细胞已被分割； (b) 两个或多个细胞被分割为一个。这可以通过绘制强度与细胞面积的关系来检测； (c) 由于单元格数量不足，分箱不够准确。
解决方案： (a) 修改图像并消除这些细胞； (b) 修改分割程序； (c) 在相同条件下从同一样本获取更多图像，或合并在相同条件下成像的多个实验。

问题2：转染细胞属于阴性类别。
可能原因：不适当的成像条件（即激光功率或采集时间）导致高表达细胞饱和。
解决方案：丢弃数据集。如果数据集非常有价值，您可以估计与其他数据集相比饱和细胞的百分比，并相应地移动门（请注意，这会增加不完美的错误！）。

致谢

这项工作由 MCC 的 CA 198/10-1 项目编号 326470517 和 CA 198/16-1 项目编号 425470807 资助。我们感谢张辉在该方法开发过程中提供的建议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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