材料与试剂

1.硅橡胶片（道康宁公司医疗产品，目录号：501-1）
2.0.5 mL 管（Corning，目录号：3750）
3.凝血酶（MP Biomedical，目录号：76461-568）
4.纤维蛋白原（Sigma，目录号：F3879-1G）
5.纤维蛋白胶（Akhter 等人，2019 年；Ward 和 English，2019 年）
6.异氟烷（Piramal Healthcare，目录号：RXISO-250）
7.纱布垫（Fisher Brand，目录号：22-362-186）
8.聚维酮碘溶液（Purdue Frederick Company，目录号：10224）
9.乙醇（Thermo Fisher，目录号：T038181000CS）
10.10 μL 移液器吸头（Eppendorf，目录号：022492004）
11.0.9% 氯化钠 (NaCl)（Fisher，目录号：S271-1）
12.4% PFA（在 0.1 M PBS 中制备的多聚甲醛）（Sigma，目录号：P6148-500G）
13.1 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 由 PBS 片剂制备（Sigma，目录号：P4417-100TAB）
14.安乐死溶液（10 mg/mL，用无菌盐水制成）（Med Vet International，目录号：RXEUTHASOL）
15.Sylgard 184 有机硅弹性体基质和固化剂（Krayden DOW，目录 DC4019862）

设备

A.袖带电极

1.杜蒙镊子＃5（精细科学工具，目录号：11251-10）
2.手术剪刀（Fine Science Tools，目录号：14084-09）
3.弹簧剪刀（Fine Science Tools，目录号：15006-09）
4.硅橡胶管（实验室管，目录号：508-006）
5.绝缘线（Cooner Wire，目录号：AS631）
6.柔性硅胶（Dow Corning，目录号：Sylgard ® 184）
7.缝纫针尺寸 #9（胜家，目录号：01125）
8.台夹（用于将硅胶管固定到位）
9.木制涂抹棒（电子显微镜科学，目录号：07230）
10.丝编织线尺寸 0（JA Daknatel & Son Inc.，目录号：3-766-900）
11.显微镜（尼康，型号：SMZ800）
12.LED 测试仪，设置为 15 V，用于检查袖带电极的电流泄漏（Hewlett Packard Palo Alto Hp California 630）

B.用于电刺激

1.草地刺激器和放大器盒（Ward 和 English，2019）
2.定制实验室视图计划（Ward 和 English，2019）

C.外科手术

1.Thy-1 YFP-H 成年小鼠（2-4 个月大；雄性和/或雌性体重 18-30 g）（Jax 实验室，库存号：003782）
2.手术单（Med-Vet International，目录号：SKU DR1826）
3.带缝合刀的持针器（Fine Science Tools，目录号：12502-14）
4.理发器（瓦尔组合套件#9990-1201）
5.Deltaphase 等温垫（Braintree Scientific，型号：39DP）
6.温水循环器（Gaymar TP500）
7.手术立体镜 (AmScope SM-4BZ-80S)
8.玻璃珠灭菌器（Braintree Scientific，目录号：GER 5287-120V）
9.手术板（Fisher Brand ，目录号：0900224C）
10.手术胶带（3M 微孔胶带e，1532-1）
11.棉头涂抹器（Dukal 公司，9006）
12.眼膏（Refresh PM）
13.三重抗生素软膏（Mckesson Medical Surgical Inc，目录号：955410）
14.美洛昔康口服混悬液（Med-Vet International，目录号：RXMELOXIDYL10）
15.可吸收：涂层 Visorb 未染色编织聚乙醇酸缝合线 NSF-2 19 毫米 3/8 30英寸（75 厘米）（CP 医疗，目录号：421A）
16.不可吸收的单丝聚酰胺缝合线（Redilon 5-0）1 公制 18英寸（45 厘米）（CP 医疗，目录号：661B）

软件

1.FIJI (NIH) 处理和分析图像
2.Microsoft Excel 组织轴突长度数据

程序

A.袖口构建（Rios 等人，2019）

1.取大约 1 英寸的硅胶管。将管子插入由支架固定的木制涂抹器上。在立体镜下，在管道的中间切一条缝（图 2 和 3A）。

图 2. 袖带构建示意图。 A) 硅管示意图。 B) 硅胶管放置在木制涂抹器上，以便在构建时易于操作。穿过管道制作 1/2 英寸的狭缝。

图 3.袖带制作过程。 A) 长约 1 英寸的袖口管。管子被切割以形成狭缝。 B) 管上总共有六个孔：两个在狭缝左侧，四个在狭缝右侧。 C) Cooner 线的绝缘长度约为 4-5 cm。 D) 将去绝缘线用丝线捆扎。 E) 丝线与库纳丝一起沿着第一个孔穿过上孔，回到下孔，然后从第一个孔返回。 F) 将去绝缘线缠绕在绝缘线周围以将其固定，使电线不会从袖口管上脱落。 G) 重复相同的过程（从 C-F）以制作一个完整的袖带，该袖带由位于袖带管内的两根去绝缘电线组成。外面裸露的电线上覆盖有柔性硅胶，以防止电流泄漏。袖口被修剪至约1 厘米的长度。 H) 用于测试袖带的设置（气泡测试），包括充满 0.9% NaCl 的培养皿和保持在 15 V 的 LED 测试仪。 I) 袖带显示气泡仅从 Cooner 线去绝缘的袖带管内部逸出。 J) 定制袖带电极的全视图；额外的长度允许在电刺激期间在手术台上（手术用品、刺激器和实验动物）进行更灵活的设置，例如，非常短的袖带需要将刺激隔离单元放置在距离动物很短的距离处。

2.使用 30 G 针，在距离管左侧狭缝约 4-5 毫米处打一个孔 (1)。在管道右侧，距狭缝 2-3 毫米处打一个上孔 (2)。同样，在上孔 2 下方 2-3 毫米处打一个下孔 (3)（图 4）。
注意：将孔 1 与 2 对齐。对齐 3，使管道左侧的 1 位于 2 和 3 的中心。

图4. 使用 30 G 针在管上打孔的位置示意图。这些孔为 Cooner 线提供了穿过的通道，以便去绝缘线完全位于管内。

3.同样，再打一个孔 ( 4 )，与左侧的 1 保持 2-3 厘米的距离。右视图中，打一个上孔（ 5 ），距2留2-3厘米的距离，打一个下孔（ 6 ）（5下方），距上孔5留2-3毫米。总共六个孔用 30 G 针在管中制成（图 4）。
注意：将孔 4 与 5 和 6 对齐，使 4 位于 5 和 6 的中心。孔 4、5 和 6 与 1、2 和 3 等距。
4.取大约 30 厘米的库纳线。去除电线尖端约 4-5 厘米长的绝缘（图 5 和 3C）。将 20 厘米的丝线穿入 9 号缝纫针的针眼中。用丝线在细线的去绝缘部分打一个结。固定结，使其不会与细线分离（图 3D）。
注： Cooner 线由 13 根绝缘内细编织金属线组成。当电线末端的绝缘层被去除时，金属线往往会磨损。应注意将其卷绕在自身周围以尽量减少磨损。

图 5. 管道内部示意图，显示 Cooner 线的绝缘部分和去绝缘部分的位置
5.将丝线穿过孔 1（左），然后穿过孔 2（右），使去绝缘线的一部分位于管内（图 5 和 3E-3F）。
6.将针旋转 180°，将其穿过右侧的孔 3，然后再次穿过管左侧的孔 1，确保去绝缘线的一部分位于管内（图 5 和 3E-3F）。用另一根 30 厘米的 Cooner 线重复此过程，并将其穿过左侧的孔 4，穿过右侧相应的两个孔 5 和 6。
7.从左孔出来的剩余去绝缘线紧紧地缠绕绝缘线 4-5 圈，以确保其不会从袖口上脱落（图 3F）。
注意：卷绕去绝缘线时应小心，以免 13 根小金属线磨损。剪掉任何多余的去绝缘电线，以最大限度地减少电流泄漏。
8.将 0.8 克 Sylgard 184 有机硅弹性体基质与 0.1 克 Sylgard 184 有机硅弹性体固化剂混合。使用这种混合物密封袖口管外部的任何非绝缘金属细线，以防止电流泄漏。柔性硅在 100°C 的培养箱中固化5分钟。
注意：将柔性硅胶反复涂抹到培养箱中并在培养箱中固化，直到覆盖袖口管外的所有裸露（未绝缘）电线。
9.将袖口修剪至长度约 1 厘米（图 3G）。使用保持在 15 V 的 LED 测试仪测试袖带（气泡测试）。在培养皿中填充 0.9% NaCl（盐水）。将袖带浸入盐水溶液中。将 Cooner 线远端 (1–2 cm) 去绝缘并连接到 LED 测试仪。进行气泡测试，其中正确构建的袖带应仅从电线去绝缘的袖带内部逸出。应使用柔性硅胶再次密封从袖口外部逸出的任何气泡（图 3I）。此步骤对于防止附近神经/肌肉的脱靶刺激至关重要。

B.手术准备

1.将所有手术器械放入玻璃珠灭菌器中，在 250 °C 下保持 30 秒。在室温下冷却手术器械至少 5 分钟（或直至摸起来凉爽）。
2.将加热垫或循环器放在手术板下方以保持体温。
3.将鼻锥放在手术板上并用手术胶带固定。
4.在室温下解冻等份凝血酶（凝血酶是通过将 25 μL凝血酶储备溶液添加到 975 μL 45 mM CaCl 2中制备的）。纤维蛋白原的制备方法是将 10 mg 纤维蛋白原与 100 μL蒸馏水混合直至完全溶解。纤维蛋白原在室温下容易凝固，应在制备后5-6小时内使用。不应使用凝固的纤维蛋白原，因为神经残端无法固定，导致间隙过大，从而大大减少能够再生的轴突数量。
5.称重动物并将其放入诱导室中以诱导麻醉（1 L/min 氧气中含有 5% 异氟醚）。
6.将动物放在手术板上，其鼻子安装在鼻锥上。然后将麻醉维持在 2% 异氟烷。用电动理发器从后肢臀部开始到脚踝处修剪毛发。
7.除去动物下面的所有毛发和第一块布。用酒精和聚维酮碘连续擦拭动物后肢，各3次。
8.捏捏脚趾以检查任何反应，以确保动物位于手术平面内。根据需要滴定异氟烷。

C.神经手术应在手术显微镜的帮助下进行。

1.用无菌布覆盖动物，仅暴露手术部位。
2.通过触诊皮肤来识别股骨。
3.沿着股骨的长度做一个 4 厘米的切口。钝器解剖股二头肌和腿筋肌肉之间的筋膜。
4.使用 #5 镊子，小心地将坐骨神经与下面的结缔组织隔离（图 6A）。

图 6. 使用袖带刺激坐骨神经。 A) 通过在皮肤上切开约 4 厘米的切口来暴露坐骨神经。 B) 将定制的袖带包裹在整个坐骨神经（或选定的分支）上，使神经位于袖带内去绝缘线的顶部。袖带的去绝缘远端连接到草刺激器。神经刺激可以发生在神经横断和修复之前或之后，这之前已经详细说明过（Akhter 等人，2019）。

5.将袖带缠绕在坐骨神经上，使神经与袖带内的去绝缘线接触（图 6B）。将袖带远端的去绝缘线连接到放大器盒。使用草刺激器，以20 Hz刺激神经 1 小时[13] 。在横切前立即刺激神经可以目视确认刺激（可见肌肉抽搐）。
6.刺激神经 1 小时后，在神经下方放置一块4 毫米见方的小硅橡胶片。应用由凝血酶组成的纤维蛋白胶（2 μL ）和纤维蛋白原（1μL ）（2：1比例）至坐骨神经，使神经固定在硅橡胶片上（纤维蛋白胶凝固1-2分钟）。
7.然后，用锋利的微型剪刀完全横断神经。应注意使切断的神经残端彼此靠近。再次涂抹纤维蛋白胶 1-2分钟。
8.在不干扰横断神经的情况下，使用可吸收缝合线缝合肌肉，使用不可吸收尼龙缝合线缝合皮肤。
9.使用无菌棉签涂抹器在手术部位涂抹三重抗生素霜。

D.术后

1.将动物从鼻锥中取出，放入干净的恢复笼中（无垫料），放置在温水循环加热垫（Gaymar TP500）上。一旦动物能走动，给予口服镇痛剂[美洛昔康（ 5毫克/千克）]。神经横断后两周，皮肤或肌肉中不应出现明显的疤痕形成。
2.神经横断后两周，向动物注射 0.3–0.4 mL 的安乐死溶液 (10 mg/mL)。安乐死后，从动物身上解剖坐骨神经（距修复部位近端 4 毫米至远端）。应注意仔细收集远端神经的整个长度，不要损坏修复部位。
3.在室温下将神经固定在 1 mL 的 4% PFA 中 1 小时，然后转移到 1 × PBS 中 5-10 分钟。
4.放置在干净的载玻片上，并在神经上添加几滴带 DAPI（硬封片）的 Vectashield。
5.将玻璃盖玻片放在神经上。在盖玻片顶部添加重量 (3–5 g)，以使神经变平 24 小时。
6.×物镜对神经进行成像。
7.使用图像平铺功能，使幻灯片上神经的整个长度在计算机屏幕上可见。设置步长为 4.75 的 Z 堆栈微米。应用 4 的线平均值来减少背景噪音。在共振模式下对神经进行成像，以实现更快的成像。请勿应用变焦进行成像。图像由尼康软件自动拼接，以三维方式重建神经近端和远端。

数据分析_

1.将神经图像加载到 FIJI 软件（NIH）中。
2.10 mm的直线工具，在损伤部位放置感兴趣区域 (ROI)。当图像放大时，损伤部位通过破坏和无组织的轴突变得清晰可见。该点是进行神经横断的地方：损伤部位。
3.使用徒手工具，测量整个 Z 堆栈中轴突从修复部位到远端的每个轴突的长度。测量每个轴突的长度时，始终首先开始测量最短的轴突，因为稍后当较长的轴突轮廓覆盖在图像上时，它们将很难可视化（图 7）。比较电刺激神经和未治疗神经之间轴突生长的长度。确保比例尺和图像校准正确（ J >工具>比例尺）。

图 7. Thy-1-YFP-H 小鼠的神经图像。 YFP 记者可以看到再生的轴突。 A)从最短的再生轴突开始，通过追踪 Z 堆栈来测量各个轴突轮廓长度。 B)神经的放大图像，显示从损伤部位开始生长的轴突的长度。

4.将每个再生轴突的长度排序到 Microsoft Excel 中长度递增的箱中。
5.通过选择整个频率列来计算频率，然后使用公式 {= 频率（长度列中的值，bin 列中的所有值）}。
6.使用公式 = [(每个频率值× 100)/轴突总数] 计算比例。
7.然后，计算再生轴突总数的累积百分比。
8.与未刺激的神经（即未经治疗的神经）相比，电刺激的神经表现出更长的轴突（图8）。

图 8. 神经横断后受刺激与未受刺激的神经生长。 A) 横断并用纤维蛋白胶修复后的神经图像。标明了损伤部位和轴突生长方向。请注意，许多再生轴突轮廓靠近修复部位。 B) 电刺激、横断和纤维蛋白胶修复后的神经图像。标明了损伤部位和轴突生长方向。请注意，与未经治疗的神经相比，许多再生轴突的长度更长。 C) 每组的累积频率分布。电刺激纤维蛋白胶修复组中轴突长度的累积分布显着向右移动，这表明轴突更长。

笔记

1.与所有实验模型一样，这有其自身的优点和缺点。在此协议中，我们使用了报告小鼠 (Thy-1-YFP-H)。该报告器的优点在于神经不需要切片和免疫染色。或者，外周再生测定可以使用来自野生型小鼠 C57BL/6J（杰克逊实验室，库存号 000664）的神经，通过神经丝重链（NF200）对神经进行切片和免疫染色（Dun 和 Parkinson，2015）。 SCG10 是另一种常用的抗体，但它优先在再生感觉和交感轴突而不是运动轴突中表达（Shin 等人，2014 年；Lee 等人，2022 年）。由于其丰富性，使用 NF200 或 SCG10 时很难对单个轴突进行精确分析。
2.应注意不要在袖带上添加多余的柔性硅来覆盖袖带外部的去绝缘电线，因为这会使袖带变得更大、更笨重。较大的袖带更难以应用于神经，并且还需要更大的手术部位。此外，如果袖带太大，神经可能会失去与袖带内去绝缘线的接触。
3.如果保养得当，袖带可以重复用于多种刺激。用肥皂和水清洁袖带，并用浸有 70% 乙醇的精致擦拭布轻轻擦拭。最终，袖带会漏气。使用前最好对每个袖带进行气泡测试。如果气泡测试显示气泡从袖带内部和外部逸出，则必须制作新袖带。
4.纤维蛋白原容易凝固；因此，应始终在手术当天新鲜制作。进行多次手术时，每次使用新鲜的移液器吸头吸取溶液，以避免与凝血酶混合，导致其凝固。
5.为了避免切断的神经残端如雨后春笋般出现，应使用锋利的弹簧剪刀来横断神经。
6.在我们的研究中，我们经常使用纤维蛋白胶来修复横断的神经，并发现纤维蛋白胶是基于活动的治疗（例如运动）的辅助剂（Wariyar 等人，2022）。如果不使用纤维蛋白胶，则必须使用另一种将切断的神经残端固定在一起的方法（细缝线）。
7.English 及其同事报告称，当使用基于活动的治疗（跑步机跑步）时，轴突再生存在性别差异（Wood 等，2012）。在转录水平上，性二态性程序会因神经损伤而急剧激活（ Chernov 和 Shubayev，2022），这可能会影响再生能力和对治疗的反应。在实验设计中必须考虑潜在的性别差异。

道德考虑

所有涉及动物的程序均按照埃默里大学机构动物护理和使用委员会的规定进行并获得批准。

致谢

这项工作得到了 NIH 国家神经疾病和中风研究所的部分支持，奖金编号为 K01NS124912，以及 NIH 资助的埃默里性别差异卓越研究专业中心 U54AG062334 的发展资助。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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