材料与试剂

生物材料

1.人脑样本（购自宾夕法尼亚大学 CNDR 脑库）

试剂

1.TriZol（Invitrogen，目录号：15596026）
2.Qiagen RNeasy 套件（Qiagen，目录号：74104）
2.安捷伦生物分析仪 RNA 6000 纳米试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1511）
3.安捷伦生物分析仪 DNA 1000 Nano（安捷伦，目录号：5067-1504）
4.Agencourt AMPure XP珠（Agencourt，目录号：A63881）
5.KAPA RNA HyperPrep 试剂盒（KAPA/Roche 测序解决方案，目录号：KK8540）
6.Roche SeqCap RNA 探针（Roche，定制设计，参见下面的程序）
7.Roche SeqCap EZ 配件套件 v2（Roche，目录号：07145594001）
8.Roche SeqCap EZ 杂交和清洗试剂盒（Roche，目录号：05634261001）
9.乙醇（ Decon Labs, Inc.，目录号：2716）
10.RNA 应用用水（Fisher 生物试剂，目录号：BP5611）

实验室用品

1.1.5 mL 塑料管（Eppendorf，目录号：022431021）
2.0.2 mL PCR 管（Denville，目录号：C18098-4）

设备

1.生物分析仪（Agilent 2100 生物分析仪，目录号：G2939BA）
2.热循环仪（Applied Biosystems，Veriti 96 孔热循环仪，目录号：4375786）
3.测序仪（Illumina HiSeq 2500，目录号：SY-401-2501）
4.Dyna-mag2 磁铁（Thermo Fisher，目录号：12321D）
5.涡旋混合器（Fisherbrand，品牌，目录号：02-215-365）
6.微量离心机（Eppendorf 型号 5424，目录号：022620401）
7.NanoDrop 或类似分光光度计

软件和数据集

1.RStudio
2.快速质量控制
3.Trimmomatic（032 版）
4.星星
5.黄蜂
6.变体注释
7.TxDb.Hsapiens.UCSC.hg 19.knownGene

程序

A.从人脑样本中分离 RNA

1.如前所述解剖人类死后大脑样本（Chen-Plotkin 等人，2008）。在我们的出版物（Diaz-Ortiz 等人，2022）中，我们使用了神经学正常对照（NC，n = 2）和 PD（n = 4）个体，并解剖了尾状核、扣带回和小脑。
2.使用 TRIzol 和 RNeasy Mini 柱从死后脑样本中分离总 RNA 如前所述（Chen-Plotkin 等，2008）。
3.使用 NanoDrop 通过分光光度测量 260/280 nm OD 比率来评估 RNA 浓度和纯度。
注意：我们需要 1.90 到 2.10 之间的 260/280 比率（对于超出此范围的比率，请参阅一般说明和故障排除）。
4.按照 RNA 60 00 Nano 试剂盒指南，在 Agilent 2100 生物分析仪上通过毛细管电泳评估 RNA 完整性。
注意：虽然大多数应用都需要 > 7 的 RNA 完整性数 (RIN)，但这并非在所有情况下都可行；我们的 RIN 在 5.2 到 9.0 之间变化（平均为 6.5）。在 RIN < 6.5 的情况下，鼓励目视检查生物分析仪痕迹以确定病因（请参阅一般说明和故障排除）。图 1显示了带有相应 RIN 的 Agilent 2100 生物分析仪迹线示例。

图1。生物分析仪对具有不同 RNA 完整性数 (RIN) 的 RNA 样本进行跟踪的示例，具体而言，RIN = 9.0 (A)、RIN = 5.2 (B) 和 RIN = 3.2 (C)。虽然 B 和 C 的 RIN 数相对较低，但迹线 B 中从左到右的第二个宽峰与小 RNA 的存在一致，而迹线 C 中不存在四个不同的峰与真实的 RNA 降解一致。

5.分离等分 RNA 并储存在 -80 °C 下直至使用。
注意：我们从每个分离的脑样本中制备了多个 20 μL等分试样，以便