材料与试剂

生物材料

1.动物：4-8 周大的 B6 小鼠（杰克逊实验室，目录号：000664）

耗材

1.细胞培养板：12孔细胞培养板（ Thermo Fisher Scientific，目录号：150628）
2.Eppendorf 管（ Thermo Fisher Scientific，目录号：3451）
3.Tipone ®移液器吸头（USA Scientific，目录号：1126-7810）
4.移液器（Corning，Falcon® ，目录号：357543）
5.冷冻保存瓶（康宁，目录号：430659）

试剂

1.乙醇
2.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
3.青霉素-链霉素（5,000 U/mL）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15070063）
4.杜尔贝科改良的伊格尔培养基（DMEM，高葡萄糖）（ Thermo Fisher Scientific，目录号：11965）
5.胎牛血清（FBS）（GE Healthcare， HyClone ，目录号：SH30071.03）
6.明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890-100G）
7.胶原酶A（Millipore Sigma，目录号：10103578001）
8.溶液（ Mediatech ， Cellgro® ，目录号：25-053-CI）
9.常见上皮标记物E-钙粘蛋白（Cdh1）（BD Transduction Lab，目录号：610181）
10.Specific epithelial marker Keratin 12 (Krt12) (Abclonal, catalog number: A9642)
11.成纤维细胞标记物波形蛋白（Sigma，目录号：17-10195）
12.100×青霉素-链霉素溶液（ Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
13.角膜上皮细胞基础培养基（ATCC，目录号：PCS-700-030）
14.角膜上皮细胞生长试剂盒（ATCC，目录号：PCS-700-040）

解决方案

1.角膜上皮细胞培养基（参见食谱）
2.角膜基质成纤维细胞培养基（参见食谱）
3.0.1% 明胶溶液（参见食谱）

食谱

1.角膜上皮细胞培养基
根据制造商的说明准备完整的角膜上皮生长培养基。 ATCC完全角膜上皮生长培养基中各成分的最终浓度如下：
5 μg /mL 载脂铁转铁蛋白
1.0 μM肾上腺素
0.4% 提取物 P
100 ng/mL 氢化可的松
6 mM L-谷氨酰胺
5μg /mL重组人胰岛素
CE生长因子：专有配方

2.角膜基质成纤维细胞培养基
450 mL 的 DMEM
50 mL 胎牛血清
5 mL 青霉素/链霉素 (5,000 U/mL)

3.0.1%明胶溶液
0.1 克明胶粉
100 mL 的 PBS
高压灭菌并在 4°C 下保存三个月。

设备

1.Mcpherson-Vannas弯曲虹膜剪刀（Storz 眼科仪器，目录号：E3347）
2.Castroviejo 缝合钳 0.12 mm（Storz O眼科仪器，目录号：E1796）
3.Martinez 双端角膜解剖器（Storz O眼科仪器，目录号：E3001）
4.Algerbrush II（ Katena Products, Inc.，新泽西州丹维尔）
5.细胞培养箱（ Thermo Fisher Scientific， Thermo Scientific，型号：3250）
6.水浴锅（VWR，型号：1545）
7.移液器（艾本德）
8.移液器辅助装置 (Drummond)
9.台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra® X -15R）
10.实验室旋转摇床（Barnstead Thermolyne LabQuake ，型号：4152110)
11.倒置显微镜（尼康、Eclipse TS100）
12.焦显微镜（尼康、Eclipse Ti ）
13.40 μm尼龙网过滤器（Fisher Scientific，莱斯特郡，英国）

程序

A.角膜上皮细胞分离与培养

1.此过程中使用的所有材料必须经过消毒或高压灭菌，以防止污染（图 2）。

图 2. 手术中使用的手术工具必须经过高压灭菌
2.用二氧化碳安乐死小鼠，然后颈椎脱位以确认死亡。
3.使用镊子将两个眼球剜出，并将其放入 1% 青霉素-链霉素 PBS 中（图 3A）。
4.在显微镜下用一把手术剪刀小心地从眼球上剪掉全厚度的角膜（图3B）。
5.此后，使用剪刀将整个角膜与角膜缘切成蝴蝶领带状形状（图 3C），并将其放入 1%青霉素-链霉素PBS 中。

图3.小鼠角膜分离的过程。 (A) 眼球被摘除并置于 PBS 缓冲液中。 (B) 将整个角膜连同角膜缘一起切掉，(C) 每季度分成蝴蝶结状。

6.为了包被 12 孔培养板，制备 0.1% 明胶溶液（配方 3）并通过过滤灭菌。将 100 μL该包被溶液添加到每个孔中，并在室温下放置 10 分钟。
7.从板中吸出涂层溶液，并将 2-4 个角膜上皮面朝下放置在每个孔上，以便有足够的上皮细胞移出组织。
8.用镊子轻轻按压组织片，使组织充分接触板表面；添加100 μL角膜上皮培养基（配方1）以覆盖整个角膜组织。
9.将板与培养的角膜在 37°C、100% 湿度和 5% CO 2下孵育。
10.第二天，沿着孔壁非常缓慢地添加500μL角膜上皮培养基，以防止组织漂浮。
11.当大多数上皮细胞从上皮组织移到板上时，大约在播种后第 7 天（图 4A-4D），用镊子取出角膜组织并添加 1 mL 的新鲜角膜上皮培养基。
12.每 3-4 天用 1.5 mL 新培养基更换旧培养基，直至细胞汇合。重复使用离体角膜组织至少五次。
13.除去培养基后，将汇合的小鼠角膜上皮细胞与板和彼此分离，方法是将其与 0.3 mL 的 0.15% 胰蛋白酶 EDTA 溶液在 37°C 下孵育 3分钟。
14.将细胞以 1:2 的比例分成两个单独的孔，用 3 mL 的角膜基质成纤维细胞培养基（配方 2）过夜，以灭活胰蛋白酶并帮助细胞粘附到板上。
15.第二天，用 1.5 mL 角膜上皮培养基更换角膜基质成纤维细胞培养基。
16.角膜上皮细胞通过其小、紧凑、圆形或椭圆形形态（图 4E）以及角膜上皮标记物角蛋白 12 (Krt12) 和常见上皮标记物 E-钙粘蛋白 (Cdh1) 的免疫染色（图 4F-4G）来证实。。

图 4. 小鼠角膜上皮细胞分离和培养。将分离的小鼠角膜倒置在涂有 0.1% 明胶的细胞培养板上，培养 (A) 0、(B) 1、(C) 3 和 (D) 7 天。 (E) 单层培养的角膜上皮细胞及其与 (F) 角膜上皮标记物角蛋白 12 (Krt12) 和 (G) 常见上皮标记物 E-钙粘蛋白 (Cdh1) 的免疫荧光。

B.角膜基质细胞分离与培养

1.用二氧化碳安乐死小鼠，然后颈椎脱位以确认死亡。
2.Algerbrush II 和棉签通过机械刮擦将上皮层向下去除至基底膜（视频 1 显示Algerbrush II的头尖将角膜上皮细胞刮成细胞碎片团；在整个上皮区域清创后，细胞用棉签清洁碎屑块）。

视频1. 使用Algerbrush II清创角膜上皮

3.摘除两个眼球并将其放入 1% 青霉素-链霉素 PBS 中。
4.在显微镜下用一把手术剪刀小心地从眼球上剪掉全厚度的角膜（图3B）。
5.此后，每季度将整个角膜与角膜缘切割成蝴蝶领带状形状（图3C）并将其放入1％青霉素-链霉素PBS中。
6.使用马丁内斯双头角膜解剖器去除内皮层（视频2显示去除内皮后角膜基质明显变得更清晰），并使用一把手术剪刀和刀片将剩余的基质组织切成小块。

视频2. 使用Martinez 剥离器去除角膜内皮

7.将切碎的角膜组织放入 Eppendorf 管中，在 0.5 mL 0.1 mg/mL 胶原酶 A 中于 37 °C 进一步消化 1-2 小时。每 10 分钟涡旋一次管，直到消化溶液出现混浊，这是组织彻底消化的标志。
8.40 μm尼龙网过滤器过滤消化的角膜组织，以去除较大的碎片，并将流过的基质细胞收集在 15 mL 管中。
9.将角膜基质成纤维细胞培养基添加到流穿溶液中，并以 1,000 × g离心5 分钟。
10.倒出上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 角膜基质成纤维细胞培养基（配方 2）中，并将其置于 6 孔培养板的一个孔中。
11.每 3-4 天刷新一次培养基，直至细胞汇合。
12.除去培养基后，通过在室温下与 0.3 mL 的 0.15% 胰蛋白酶溶液一起孵育 3 分钟，将汇合的鼠角膜基质成纤维细胞与板和彼此分离。
13.将细胞以 1:2 的比例分裂到两个单独的孔中，用 3 mL 的角膜基质成纤维细胞培养基灭活胰蛋白酶并帮助细胞粘附到板上。
14.角膜成纤维细胞（角膜细胞）通过其形态（图 5A-5C）和成纤维细胞标记物波形蛋白的免疫染色（图 5D）进行确认。

图 5. 小鼠角膜基质成纤维细胞分离和培养。首先从分离的小鼠角膜上机械去除上皮和内皮；将剩余的基质切碎，然后用 A 型胶原酶进一步消化。通过尼龙网过滤器后，将分离的细胞培养在涂有 0.1% 明胶的平板中，用于 (A) 1、(B) 3 和 (C) ） 7天。 (D) 单层培养的小鼠角膜基质细胞，用成纤维细胞标记波形蛋白 (Vim) 染色。

协议验证

我们使用该方案分离和培养小鼠角膜上皮和基质细胞用于我们之前的研究，并获得了可靠的结果[3] 。

一般说明和故障排除

These protocols for murine corneal epithelial and stromal fibroblast cell isolation and culture are relatively simple and easy for research laboratories in need, though their isolation yield and proliferation rates in culture are still low. We do not know why it is so technically difficult. Compared to human, mouse life span is very short; we believe that the renewability of mouse primary ocular cells, such as RPE and Müller cells to our best knowledge, is probably not as strong as human primary ocular cells.

致谢

该协议最近被实验室采用[4] 。这项工作得到了美国国家普通医学科学研究所 (P20GM103453 至 YL)、路易斯维尔大学医学院 (E0819 至 YL)、路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心定向礼品试点项目计划 (G1779 至 YL) 的支持，以及国家自然科学基金项目（82171032 LZ），辽宁省自然科学基金项目（201800209、201602210、20180550976 to LZ）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

道德考虑

本协议中动物的使用是根据机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 制定的政策和指南进行的，并得到美国肯塔基州路易斯维尔大学的批准。

参考

1.EM 西班牙和德国伯克 (2020)。角膜基质的组成、结构和功能。过期。眼科研究。 198：108137。doi ： 10.1016/j.exe.2020.108137
2.小林 T.、吉冈 R.、白石 A. 和大桥 Y. (2009)。培养正常小鼠角膜上皮细胞的新技术。摩尔。维斯。 15：1589-1593。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2728571/
3.张 Y.、杜 KK、王 F.、卢 X.、刘 JY、李 C.、Ceresa, BP、张 L.、Dean, DC、刘 Y. 等。（2023）。 Zeb1 通过维持角膜上皮细胞的活力和活动性来促进角膜上皮伤口愈合。交流。生物。 6(1)：e1038/s42003-023-04831-0。号码：10.1038/s42003-023-04831-0
4.Jin, L.、Zhang, Y.、Liang, W.、Lu, X.、Piri, N.、Wang, W.、Kaplan, HJ、Dean, DC、Zhang, L.、Liu, Y.等。（2020）。 Zeb1 通过调节血管内皮细胞增殖促进角膜新生血管形成。交流。生物。 3(1)：e1038/s42003-020-1069-z。 DOI：10.1038/s42003-020-1069-z
5.梁W.、张Y.、周L.、卢X.、Finn, ME、王W.、邵H.、Dean, DC、张L.、刘Y.等。（2022）。 Zeb1 对碱损伤角膜伤口愈合引起的炎症的调节。 iScience 25(4): 104038.doi : 10.1016/j.isci.2022.104038
6.张 Y.、王 YC、Yuka, O.、张 L. 和刘 CY (2016)。小鼠角膜基质成纤维细胞原代细胞培养。生物协议 6（19）：e1960。 doi：10.21769/bioprotoc.1960